Neuronmigratie wordt gereguleerd door talrijke cel-autonome en niet-cel-autonome factoren. Dit protocol laat zien hoe in utero elektroporatie kan worden gebruikt om te bepalen of een fenotype in een transgene muis het gevolg is van verstoring van een intrinsiek celmechanisme of belemmering van de interactie tussen de neuron en zijn omgeving.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Inductie van Eiwit van de verwijdering door In Utero Electroporatie tekorten Definieer in neuronale migratie in transgene modellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Genetische verwijderen met behulp van het Cre-Lox-systeem in transgene muis lijnen is een krachtig instrument dat wordt gebruikt om de functies van eiwitten te bestuderen. Behoudens specifieke Cre modellen, verwijdering van een eiwit gedurende een weefsel of cel populatie leidt vaak tot complexe fenotypes als gevolg van meerdere interactie mechanismen. Bepalen of een fenotype resultaten van verstoring van een cel autonoom mechanisme heid die de betreffende cel, of van een niet-cel autonoom mechanisme wat uit aantasting van de omgeving van die cel, moeilijk duidelijk. Inzicht in eiwitfunctie verwerven in een in vivo context in utero elektroporatie (IUE) maakt gen deletie in een kleine subset van cellen in de ontwikkelingslanden cortex of een andere geselecteerde hersengebied. IUE kan worden gebruikt om specifieke hersengebieden, waaronder de dorsale telencephalon, mediale telencephalon, hippocampus of ganglion verhevenheid richten. Dit vergemakkelijkt observatie of de gevolgen van cel autonome gen deletie in het kader van een gezond milieu. Het doel van dit protocol te tonen hoe IUE kan worden gebruikt om een defect in radiale migratie analyseren een floxed transgene muis lijn, met de nadruk op het onderscheid tussen de cel zelfstandige en niet-cel-autonome effecten van eiwit deletie. Door vergelijking van het fenotype gevolg van gen deletie in het gehele cortex versus IUE gemedieerde gen deletie in een beperkte celpopulatie inzicht in eiwitfunctie hersenontwikkeling kan worden verkregen dan met behulp van technieken afzonderlijk.
Inleiding
Radial migratie is een centraal proces om vroege corticale ontwikkeling. Het hangt van verschillende cel autonome factoren, zoals de juiste mitotische uitgang en neuronale differentiatie, celpolariteit, regulatie van het cytoskelet dynamiek en expressie van transmembraan receptoren, evenals niet-cell autonome factoren, zoals de vorming van de radiale gliale steiger en secretie van trekkende begeleiding moleculen 1-3. Aangezien verstoring van elk van deze mechanismen neuronale migratie beïnvloeden in een transgeen muismodel 4-8, bepalen de onderliggende oorzaak van een defect in migratie kan een complexe en moeilijk proces. In utero elek....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle experimenten werden goedgekeurd door de Universiteit van Ottawa's Animal Care ethische commissie, die de Richtlijnen van de Canadese Raad over Animal Care.
1. Pre-operatieve voorbereiding en Materialen
- Plasmide Voorbereiding:
- Bereid plasmiden met de Qiagen Megaprep volgens het protocol van de fabrikant. Innoculate ten minste 400 ml van LB bouillon met getransformeerde bacteriën om een hoge opbrengst DNA waarborgen en incubeer overnacht.
- Resuspendeer plasmide 100-200 ul TE tot een eindconcentratie van ten minste 5 ug / ul. Aliquot DNA en bewaar bij -20 ° C. Als de concentratie te laag is,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Verschillende hersengebieden kunnen worden getarget voor elektroporatie door de oriëntatie van de pedelelektroden boven de kop van het embryo te variëren (Figuur 2). Voor alle delen van de voorhersenen wordt het plasmide in het laterale ventrikel geïnjecteerd (de achterhersenen kunnen worden getarget door injectie in het vierde ventrikel). Plaats de elektroden in het algemeen zodanig dat de rechte lijn tussen hen door het gebied van interesse loopt, waarbij het DNA naar de positieve elektrode wordt getro.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Twee van de belangrijkste uitdagingen bij het uitvoeren van in de baarmoeder elektroporaties zijn 1) het voorkomen van embryo letaliteit en 2) het verminderen van variabiliteit tussen elektroporaties. Een van de belangrijkste factoren bij het voorkomen letaliteit is naald kwaliteit, zoals stompe naalden meer schade toebrengen aan het embryo. Bij het snijden van de naald, houdt de punt zo lang mogelijk terwijl nog steeds zichtbaar druppel 0.1-0.2 ul vloeistof verschijnen na een pomp van de voet peddel
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
We zijn Pierre Mattar en Freda Miller dankbaar voor hun hulp bij de in utero elektroporatie en aan Noel Ghanem en Bensun Fong voor het maken van diagrammen. We danken Linda Jui en Jason G. MacLaurin voor uitstekende technische assistentie. De apparatuur werd ondersteund door het Centre for Stroke Recovery.
Dit werk werd ondersteund door een beurs van HSFO en OGS aan D.S.S. en een CIHR-subsidie aan R.S.S.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| ECM 830 Square Wave Electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | Alleen Electroporator – koop kabels apart (45-0204) |
| 1250FS Footswitch voor ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0211 | Voetpeddel is noodzakelijk voor hands-free elektroporatie |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 (5mm) 45-0488 (7mm) | Platinumtang stijlelektroden |
| Femtojet | Eppendorf | 920010504 | Microinjector |
| Griphead 0 | Eppendorf | 920007414 | Houdt de getrokken naald vast |
| Universal Capillary Holder | Eppendorf | 920007392 | Verbindt griphead met buis |
| Injection Tube | Eppendorf | 920007431 | Verbindt capillairhouder met Femtojet |
| Foot Control | Eppendorf | 920005098 | Voetpeddel voor hands-free injectie |
| Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | Tips voor het laden van de getrokken capillaire buisjes |
| Plasmid Mega Kit | Qiagen | 12181 | 5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Niet-toxische kleurstof |
| Extra Fine Bonn Schaartjes | Fine Science Tools | 14084-08 | Voor het trimmen van de naalden |
| Bonn Strabismus Schaartjes | Fine Science Tools | 14084-09 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Recht |
| Colibri Retractors | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Stapler | Fine Science Tools | 12031-07 | Voor 7mm clips |
| Castroviejo Needle Holder | Medical Tools | SNH-6737 | Rechts, met vergrendeling |
| Needle Puller | Narishige | PC-10 | Voor het trekken van microcapillairen |
| Microcapillaries | Drummond | 1-000-800 | 0,4 mm binnendiameter glazen capillaire buisjes |
Referenties
- Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neur....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
