Ileocolische resectie wordt vaak uitgevoerd bij verschillende menselijke ziekten; er is echter weinig bekend over de impact van intestinale resectie op chirurgische aandoeningen. Dit artikel biedt instructies voor het uitvoeren van de procedure bij muizen met een hoog succespercentage, waardoor een manier wordt geboden om de effecten van ileocoische resectie te bestuderen in ziektemodellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Muizen Ileocolic darm resectie met primaire anastomose
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Intestinale resecties zijn vaak nodig voor de behandeling van ziekten van het maag-darmkanaal, waarbij de ziekte van Crohn en darmkanker twee veelvoorkomende voorbeelden zijn. Ondanks de frequentie van deze procedures, blijft er een aanzienlijke kenniskloof bestaan in het beschrijven van de inherente effecten van intestinale resectie op de fysiologie van de gastheer en de pathofysiologie van de ziekte. Dit artikel geeft gedetailleerde instructies voor een ileococale resectie met primaire eind-tot-eind anastomose bij muizen, evenals essentiële aspecten van peri-operatieve zorg om het postoperatief succes te maximaliseren. Wanneer nauwkeurig gevolgd, levert deze procedure een langetermijnoverlevingspercentage van 95% op, geen verzwakking, en minimaliseert postoperatieve complicaties van darmobstructie en anastomotische lek. De technische uitdagingen van het uitvoeren van de procedure bij muizen vormen een belemmering voor het wijdverbreide gebruik ervan in onderzoek. De vaardigheden die in dit artikel worden beschreven, kunnen worden verworven zonder eerdere chirurgische ervaring. Eenmaal beheerst, zal de muis ileococale resectieprocedure een reproduceerbaar hulpmiddel bieden voor het bestuderen van de effecten van intestinale resectie in modellen van menselijke ziekten.
Inleiding
Ileocolische resectie (ICR) is een veel voorkomende procedure die wordt uitgevoerd in zowel noodgevallen als geplande situaties voor verschillende ziekten. De ziekte van Crohn en colonkanker zijn de twee meest voorkomende indicaties voor ICR. Bij beide ziekten vertegenwoordigt recidief in de darm op de plaats van de operatie een groot klinisch probleem. Lokale recidiefsnelheden voor colonkanker blijven een probleem, zelfs bij de meest agressieve resecties1. Na ICR bij de ziekte van Crohn treedt de ziekte het meest frequent (in maximaal 80%) op in de neo-terminale ileum binnen 1 jaar na de operatie2. Gezien de impact van deze twee ziekten en hun recidief na de operatie, is het belangrijk om lokale darmfactoren na ICR te begrijpen, die intrinsieke invloeden kunnen hebben op de natuurlijke geschiedenis van deze ziekten. Verder is het ook belangrijk om de anastomotische genezing na ICR te overwegen. In de vroege postoperatieve periode kunnen anastomotische lekken verwoestende gevolgen hebben voor patiënten, met herhaalde operaties, het aanleggen van een stoma, aanzienlijke morbiditeit en zelfs mortaliteit als gevolg3. Ondanks het belang van dit onderwerp, is ons huidige begrip van anastomotische genezing nog in de kinderschoenen als onderzoeksonderwerp. Diermodellen van ICR, met name muizen, zijn een uitstekend platform voor het bestuderen van de intestinale en anastomotische genezing na een operatie.
Een muismodel van ICR werd aanvankelijk ontwikkeld door Helmrath et al. om te worden gebruikt als een model voor het syndroom van korte darm4. De auteurs experimenteerden met verschillende diëten en naadgroottes om de overleving van dieren na ICR te optimaliseren. Ze concludeerden dat het voeren van een vloeibare dieet in de perioperatieve periode en het gebruik van 9-0 monofilamentnaden resulteerde in een optimale postoperatieve overleving van 88%. Sinds deze eerste publicatie is ICR bij muizen, waarbij 50% van de dunne darm wordt verwijderd, in verschillende studies gebruikt om de dynamica van massieve kleine darmresectie en de adaptieve groeireactie te onderzoeken in een poging nieuwe therapieën voor het syndroom van korte darm te ontwikkelen5,6.
De eerste toepassing van het ICR-muismodel op de ziekte van Crohn gebruikte het IL-10-/- muismodel, dat spontaan colitis ontwikkelt7. De auteurs ontdekten dat deze dieren na ICR ontsteking ontwikkelden in de neo-terminale ileum, vergelijkbaar met wat wordt gezien bij patiënten met postoperatieve ziekte van Crohn, en dat deze ontsteking afhankelijk was van de aanwezigheid van bacteriën7. Meer recentelijk werd dit model gebruikt om bacteriële veranderingen te onderzoeken die worden geïnduceerd door ICR. Bij de ziekte van Crohn is er een geassocieerde dysbiose met relatieve afnames van bacteriën die bekend staan om hun ontstekingsremmende eigenschappen en toenames van invasieve bacteriesoorten8,9. De associatie geldt ook in gevallen van postoperatieve recidief10. Twee studies probeerden microbiële veranderingen te identificeren als gevolg van ICR. De eerste gebruikte IL-10-null muizen en voerde denaturerende gelelektroforese uit om de bacteriële gelijkenis te vergelijken tussen de dunne darm en dikke darm na ICR11. Deze studie toonde aan dat de bacteriepopulaties in de dunne darm en dikke darm na ICR vergelijkbaar werden. Een volgende studie gebruikte wildtype-muizen en 16s pyrosequencing voor fylogenetische classificatie van bacteriesoorten postoperatief. Deze studie toonde een duidelijke verschuiving in bacteriesoorten als gevolg van alleen chirurgie, met Clostridium-soorten die dominant werden, evenals een toename in γ-proteobacteriën. De resultaten bevestigden ook de bevindingen van de vorige studie met vergelijkbare populaties gevonden in de dunne darm en dikke darm na ICR12.
ICR is een veel voorkomende procedure voor patiënten met colonkanker die de blindedarm en opgaande dikke darm beïnvloedt, en het wordt steeds meer erkend dat de reactie van de gastheer op de operatie waarschijnlijk bijdraagt aan zowel lokale als distale tumorrecidief13. Ondanks deze observatie, zijn modellen van ICR niet gebruikt voor het onderzoek naar colorectale kanker en postoperatieve recidief. Het begrijpen van zowel de systemische als lokale immunologische veranderingen als gevolg van ICR zal belangrijk zijn bij het onderzoeken van toekomstige therapieën. Potentiële routes die betrokken zijn bij kankerrecidief na ICR omvatten upregulatie van groeifactoren, die cellen kunnen redden van apoptose en proliferatie kunnen stimuleren, mechanische tumorverstoring met celverlies en verlies van immuunbewaking door postoperatieve immunosuppressie13,14.
Muismodellen van ICR hebben het potentieel om een krachtig hulpmiddel te zijn voor het onderzoek naar het syndroom van korte darm, de ziekte van Crohn en colonkanker. Ze kunnen ook lessen bieden over hoe vroege postoperatieve anastomotische complicaties kunnen worden voorkomen door de cellulaire en biochemische routes die betrokken zijn bij de genezing van de nieuw aangelegde anastomose verder te definiëren. Een grote belemmering bij het gebruik van het muismodel ICR is de technische moeilijkheid. De intestinale anastomose vereist het gebruik van 8-0 of 9-0 naad, een operatiemicroscoop en training in microchirurgische technieken. Het doel van dit artikel is om duidelijke instructies te geven over hoe ICR bij muizen kan worden uitgevoerd met als doel deze procedure te gebruiken in ziektemodellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Animal gebruik protocollen werden goedgekeurd door de Health Science Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Alberta.
1. Voorbereiding van de instrumenten, Dieren en Operative Setup
- Transfer dieren een nieuwe, schone kooi afwezigheid van vast voedsel 24 uur voorafgaand aan de procedure. Zij vrije toegang tot water en vloeibare voeding ad libitum tot het tijdstip van de procedure.
- Autoclaaf alle instrumenten die nodig zijn voor de procedure. Schoon werkoppervlak en verdoving neuskegel met 70% ethanol.
- Het opzetten van de operationele oppervlakte met operationele microscoop, verdoving machine en benodigdheden op een manier die comfortabel is voor de chirurg. De ellebogen van de chirurg moet worden toegestaan om comfortabel op de operatietafel, met handen en armen onbelemmerd door apparatuur. Instrumenten, hechtingen, wattenstaafjes, en een spuit van 10 ml moet in een locatie die gemakkelijk toegang tijdens de procedure toestaat worden geplaatst.
- Oprichtenoverhead warmtelampen om zowel warmte voor het dier tijdens de procedure en licht voor de operationele oppervlak.
- Vul een 50 ml conische buis met 0,9% zoutoplossing, en een 1,5 ml tube met vaseline en plaats in de buurt van het werkoppervlak.
OPMERKING: Steriliseer alle instrumenten en chirurgische benodigdheden. Omdat de darm wordt doorgesneden, de procedure zelf is niet steriel. Het wordt beschouwd als schoon-besmet. Neem maatregelen om de introductie van exogene bronnen van infectie te voorkomen.
2. ileocecaalresectie met Anastomosis
- Induceren anesthesie door toediening van 4% isofluraan met een zuurstof stroomsnelheid van 2 l / min via neuskegel van de isofluraan vaporizer totdat de dieren ademhaling vertraagt tot ongeveer 30-40 ademhalingen / min. Solliciteer matige druk op de achterste voet van de muis om te zorgen dat er geen pijn reactie voorafgaand aan de inleiding van de procedure. Op dit moment afwijzen isofluraan 2% en zuurstoftoevoer tot 0,5 l / min. Tussenpozencheck pijn respons tijdens de procedure en dienovereenkomstig aan te passen isofluraan debiet.
- Vaseline om de ogen te drogen tijdens de operatie te voorkomen, en te immobiliseren de muis in rugligging met ledematen beveiligd met transparante tape.
- Reinig de buik met povodine / jodium oplossing, en veranderen in nieuwe steriele handschoenen.
- Maak een 1,5 cm huid incisie in de bovenste middellijn van de buik met behulp van scherpe punt ontleden schaar om de fascia en het buikvlies bloot. Open de fasciaal / peritoneale laag op dezelfde wijze door de linea alba de peritoneale inhoud bloot.
- In tegenstelling tot de mens, is de muis blindedarm doorgaans te vinden in de linker bovenste kwadrant van de buik. Eenmaal geïdentificeerd, voorzichtig pak de blindedarm met een pincet en leveren het door de incisie. Gebruik bevochtigde wattenstaafjes uitwaaieren ongeveer 3 cm van het ileum dat zich uitstrekt van de blindedarm dan een steriel gaasje gedrapeerd op de buik oppervlak (Figuur 1A).Zorgen de blootgestelde darm tijdens de gehele procedure vochtig met 0,9% zoutoplossing gehouden.
- Identificeer de Bauhin slagader zich vertakt de mesenterica superior langs de dikke darm (figuur 1A) met behulp van de operationele microscoop. Ontleden de avasculaire weefsels grenzend aan de Bauhin slagader, omcirkelen en afbinden van de slagader met een 5-0 zijden stropdas. Zoek vervolgens de regionale bloedtoevoer naar de terminale ileum en kies een doorsnijding punt 1,5-2 cm proximaal van de Bauhin kruising. Afbinden de takken om dit deel van de dunne darm, zoals hierboven. Verdeel de slagaders met micro ontleden schaar.
- Verdeel het ischemische porties ileum en colon zodat er voldoende bloedtoevoer naar de doorgesneden uiteinden (figuur 1B). Het is vaak nuttig om het ileum spatulate door het verdelen in een hoek van 30 graden aan de diameter van het lumen te vergroten zodat deze beter overeenkomt met de colon. Zodra de Bauhin deel van de darm is verwijderd, plaatst u dedoorgesneden uiteinden van ileum en colon op het gaas, waardoor het mesenterium grenzen van elke uitgelijnd.
- Construeer de anastomose door de onderlinge aanpassing van de doorsneden einde van de dunne darm naar de doorsneden einde van de dikke darm met behulp van onderbroken 8-0 polypropyleen hechtingen (figuur 1C). De eerste steek wordt geplaatst op de mesenteriale rand, gevolgd hechtingen geplaatst om de 0,5 mm tot Ileocolic anastomose waterdicht. Bij het passeren van de hechtdraad naald door het ileum en colon, ervoor zorgen dat de snijrand niet wordt gegooid, en naald beten zijn 0,5 mm van de snijranden van de darm. Een typische anastomose 14-16 onderbroken hechtingen vereisen. Test de integriteit en de doorgankelijkheid van de anastomose na voltooiing door het rollen van een wattenstaafje proximaal naar distaal over de dunne darm om de inhoud te dwingen via de anastomose. Kleine darminhoud moet vrij kunnen overgaan in de dikke darm zonder naadlekkage.
- Spoel de blootgestelde darm met 3-4 ml 0,9% zoutoplossing uit de injectiespuit 10 mlweg te wassen ontlasting van het oppervlak van de darm en lever darm terug in de peritoneale holte. Met behulp van 2 ml van 0,9% zoutoplossing spoelen van de buikholte, en laat vervolgens deze vloeistof door het toepassen van lichte druk op de buikwand lateraal.
- Sluit de incisie met een 3-0 zijden hechtdraad lopen, en stop de stroom van isofluraan. Dien 0,1 mg / kg van de langwerkende opiaten -buprenorphine- subcutaan voor postoperatieve pijnbestrijding.
- Observeer de dieren onder de warmtelamp totdat ze mobiel vervolgens overbrengen naar een continu opgewarmd kooi.
3. Post-operatieve Zorg en Monitoring
- Monitor dieren in een continu opgewarmd kooi tekenen van ongerief voor de rest van de dag. Transfer dieren terug naar het dier zorginstelling in een nieuwe steriele kooi met toegang tot vloeibaar dieet en water ad lib. Dieren kunnen worden gehuisvest in groepen van 3-4.
- Voer een controle op de post-operatieve dieren de volgende ochtend,zorgen voor de dieren niet in nood. Feed alleen vloeibaar dieet. Als ze verschijnen ongemakkelijk (dwz, gebogen houding of minimale activiteit) toedienen van een extra dosis subcutaan buprenorfine. Bij de dieren opnieuw in de namiddag op postoperatieve dag 1.
- Op de ochtend van de dag na de operatie 2 de dieren moeten verschijnen volledig hersteld. Bewijs van de voedselconsumptie en stooling zijn positieve tekenen van herstel. Nu, weer een solide chow voeding voor de dieren.
OPMERKING: Tekenen van nood zijn onder gebogen houding, slechte verzorging, en minimale activiteit. Als tekenen van nood zijn prominent de dieren moeten worden gedood. - Euthanaseren de dieren bij het induceren diepe anesthesie met 4% isofluraan in een O2 debiet van 2 l / min tot dieren reageren op voetdruk. Voer cervicale dislocatie, en observeren op tekenen van een goede euthanization.
- Richtlijnen variëren, dus raadpleeg de instellingen aanbevelingen met betrekking tot indicatiesvoor en passende methoden van euthanization bij muizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Sterftecijfers en gewichtsverandering post-op.
Sterftecijfers volgende ICR in 129S1 wild-type muizen zijn over het algemeen ~ 5%. De meest voorkomende oorzaak van de moraal is darmobstructie bij de anastomose. Andere doodsoorzaken zijn onder anastomotische lek en interne hernia leidt tot obstructie darmen.
Gewichtsverlies kan postoperatief gezien worden tot 14 dagen, maar is over het algemeen niet-significant. Muizen meestal preoperatieve gewicht volledig herwinnen van postop...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De muizen ICR is een krachtig model dat kan worden gebruikt om de effecten van chirurgie in darmziekten bestuderen. Dit artikel beschrijft een werkwijze voor het uitvoeren ICR muizen met een slagingspercentage van 95% en geen problemen met groeiachterstand zoals blijkt uit stabiel gewicht tot 28 dagen na de procedure. De belangrijkste uitdagingen voor succesvolle ICR omvatten het vermijden darm obstakels op de anastomose en anastomose lekken.
Technische elementen om de operatie te voorkomen ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
We willen de financiële bijdragen van de Canadian Surgical Research Fund, de Edmonton Civic Employees Research Assistance Fund en het Alberta IBD Consortium middels een subsidie van Alberta Innovates graag erkennen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injectiekwaliteit zoutoplossing |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glazen plaat | Voor operatieoppervlak | ||
| Wattenstaafjes | |||
| Micro Castroviejo Naaldhouder, gebogen | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo rechte schaar | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissectieschaar | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 zijde voorgesneden hechtdraad | Ethicon | A182H | Voor vaatligatie |
| 8-0 Prolene op BV130-5 naald | Ethicon | 8732H | Voor anastomose |
| 3-0 Zijde op FS-2 naalden | Ethicon | 8665G | Voor buikwandsluiting |
| Vaselin | Vaseline | ||
| 10 ml spuit | BD biosciences | ||
| Povidon-jodium 7,5% chirurgisch scrub | betadine.com | ||
| Warmtelampen | |||
| buprenorfine 0,3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
Referenties
- Hallet, J., Zih, F. S., Lemke, M., Milot, L., Smith, A. J., Wong, C. S. Neo-adjuvant chemoradiotherapy and multivisceral resection to optimize R0 resection of locally recurrent adherent colon cancer. European Journal of Surgical Oncology. 40 (6), (2014).
- Rutgeerts, P., Geboes, K., Vantrappen, G. Natural history of recurrent Crohn's disease at the ileocolonic anastomosis after curative surgery. Gut. 25 (6), 665-672 (1984).
- Davis, D., Rivadeneira, D. Complications of colorectal anastomoses: leaks, strictures, and bleeding. The Surgical clinics of North America. 93 (1), 61-87 (2013).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Dekaney, C. M., Fong, J. J., Rigby, R. J., Lund, P. K., Henning, S. J., Helmrath, M. A. Expansion of intestinal stem cells associated with long-term adaptation following ileocecal resection in mice. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 293 (5), (2007).
- Speck, K. E., De Cruz, P., et al. Inflammation enhances resection-induced intestinal adaptive growth in IL-10 null mice. The Journal of surgical research. 168 (1), 62-69 (2011).
- Rigby, R. J., Hunt, M. R., et al. A new animal model of postsurgical bowel inflammation and fibrosis: the effect of commensal microflora. Gut. 58 (8), 1104-1112 (2009).
- Kostic, A. D., Xavier, R. J., Gevers, D. The Microbiome in Inflammatory Bowel Disease: Current Status and the Future Ahead. Gastroenterology. , 1-11 (2014).
- Gevers, D., Kugathasan, S., et al. The Treatment-Naive Microbiome in New-Onset Crohn's Disease. Cell host & microbe. 15 (3), 382-392 (2014).
- Ahmed, T., Rieder, F., Fiocchi, C., Achkar, J. P. Pathogenesis of postoperative recurrence in Crohn's disease. Gut. 60 (4), 553-562 (2011).
- Borowiec, A., Sydora, B., et al. Small bowel fibrosis and systemic inflammatory response after ileocolonic anastomosis in IL-10 null mice. Journal of Surgical Research. 178 (1), 147-154 (2012).
- Devine, A. A., Gonzalez, A., et al. Impact of Ileocecal Resection and Concomitant Antibiotics on the Microbiome of the Murine Jejunum and Colon. 8 (8), (2013).
- Bij, G. J., Oosterling, S. J., Beelen, R. H. J., Meijer, S., Coffey, J. C., van Egmond, M. The perioperative period is an underutilized window of therapeutic opportunity in patients with colorectal cancer. Annals of surgery. 249 (5), (2009).
- Scott, A. D., Uff, C., Phillips, R. K. Suppression of macrophage function by suture materials and anastomotic recurrence of Crohn's disease. The British journal of surgery. 80 (3), (1993).
- Kiernan, J. A. Intestinal anastomosis in the rat facilitated by a rapidly digested internal splint and indigestible but absorbable sutures. Journal of Surgical Research. 45, 427-431 (1988).
- Andersen, T. L., et al. Action of matrix metalloproteinases at restricted sites in colon anastomosis repair: an immunohistochemical and biochemical study. Surgery. 140 (1), 72-82 (2006).
- Thompson, S. K., Chang, E. Y., Jobe, B. A. Clinical review: Healing in gastrointestinal anastomoses, Part I. Microsurgery. 26 (3), 131-136 (2006).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
