Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis

Samenvatting

De transcriptionele heterogeniteit binnen humane adipogeen-afgeleide stromale cellen kan op enkelcellig niveau worden gedefinieerd met behulp van celoppervlaktemarkers en osteogene genen. We beschrijven een protocol dat flowcytometrie gebruikt voor de isolatie van celsubpopulaties met verhoogd osteogeen potentieel, die kunnen worden gebruikt om craniofaciale skeletreconstructie te verbeteren.

Samenvatting

Mesenchymale stromale cellen afkomstig uit beenmerg (BM-MSC's) worden beschouwd als de gouden standaard voor op stamcellen gebaseerde toepassingen in weefselengineering. Echter, het proces waardoor ze moeten worden geoogst, kan gepaard gaan met aanzienlijke morbiditeit op de donorplaats. In tegenstelling daarmee zijn vetafgeleide stromale cellen (ASC's) gemakkelijker beschikbaar en gemakkelijker te oogsten, waardoor ze een aantrekkelijke alternatief voor BM-MSC's vormen. Net als BM-MSC's kunnen ASC's differentiëren in osteogene lijncellen en kunnen worden gebruikt in weefselengineering toepassingen, zoals het zaaien op skeletten voor gebruik bij craniofaciale skeletdefecten. ASC's worden verkregen uit de stromale vasculaire fractie (SVF) van verteerd vetweefsel, wat een heterogene mix is van ASC's, vasculaire endotheel- en muurcellen, gladde spiercellen, pericyten, fibroblasten en circulerende cellen. Flowcytometrische analyse heeft aangetoond dat het oppervlaktemarkerprofiel voor ASC's vergelijkbaar is met dat voor BM-MSC's. Ondanks verschillende gepubliceerde rapporten die markers voor het ASC-fenotype vaststellen, is er nog steeds gebrek aan consensus over profielen die osteoprogenitorcellen identificeren in deze heterogene populatie. Dit protocol beschrijft hoe een subpopulatie van ASC's met verhoogde osteogene capaciteit kan worden geïsoleerd en gebruikt om kritisch-grootte calvariale defecten te repareren.

Inleiding

De heterogene aard van stamcelpopulaties is nog niet volledig begrepen en blijft een grote belemmering voor de ontwikkeling van klinisch effectieve stamcel-gebaseerde therapeutische toepassingen. Een van de meest gebruikelijke manieren om een heterogene populatie van stamcellen te karakteriseren, is door een celsorteermethode te gebruiken, zoals fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), om cellen te scheiden op basis van hun profielen van oppervlaktemarkerexpressie. Naarmate sorteermethoden complexer worden, wordt het mogelijk om meer verschillende functionele subpopulaties van cellen te identificeren. Microfluidische technologieën worden steeds vaker gebruikt bij de analyse van genexpressie op het niveau van één enkele cel. Multiplexed kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) binnen een microfluïdische chip maakt effectieve en betrouwbare hoog-resolutie, transcriptionele analyse op celniveau mogelijk.^1-5

In een eerdere studie met behulp van transcriptionele profilering van 48 genen op celniveau, werd aanzienlijke transcriptionele heterogeniteit waargenomen onder ASC's.⁶ De verdeling van de genen MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 vertoonde echter een sterke associatie met een cluster van cellen met zeer osteogene transcriptionele profielen. Om cellen te isoleren volgens dit osteogene genexpressieprofiel, werden oppervlakte-antigeenexpressiepatronen gecorreleerd met transcriptiepatronen en werd vervolgens ontdekt dat de expressie van het oppervlaktemerker endogline (CD105) nauw correleerde met een verbeterd osteogeen differentiatiepotentieel van ASC's. Onafhankelijk van CD105-expressie, werd ook de expressie van het oppervlaktereceptor Thy-1 (CD90), een glycosyl-fosfatidylinositol-gekoppeld membraaneiwit dat eerder door Chen et al. werd geassocieerd met osteoprogénitorcellen, gecorreleerd met osteogene genexpressie.^6,7 Deze bevindingen bieden de mogelijkheid om prospectief subpopulaties te isoleren binnen de grotere heterogene pool van ASC's met verhoogde osteogene capaciteit voor cel-gebaseerde botweefsel engineering toepassingen.

Protocol

OPMERKING: Alle patiënten monsters werden verkregen met informed consent, en experimentele protocollen werden beoordeeld en door Stanford University Institutional Review Board (Protocol # 2188 en # 9999) goedgekeurd.

1. Cell Isolatie en Cultuur:

1. Verkrijgen menselijk onderhuids vetweefsel van gezonde vrouwelijke patiënten die een electieve lipoaspiration de buik, flank, en / of de dij regio onder plaatselijke / algemene verdoving. Zorg ervoor dat Institutional Review Board (IRB) goedkeuring is verkregen voor het protocol van het isoleren van ASC's van menselijke weefsels en volg voorzorgsmaatregelen institutionele veiligheid tijdens het werken met deze stoffen.
2. De SVF uit de lipoaspirated vetweefsel verkrijgen wassen op de lipoaspirate driemaal met gelijke volumina 1x steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Zorgvuldig te zuigen en de onderste waterlaag weggooien.
3. Bereid de collagenase spijsvertering buffer: 0,075% type I collagenase in Hank'sBalanced Salt Solution (HBSS). Bereid FACS-buffer: 2% FBS, 1% P188 en 1% Pen-Strep in PBS. Filter beide oplossingen met behulp van een in de handel verkrijgbaar 0,22 pm poriegrootte snelle doorstroming polyethersulfone filter.
4. De gewassen vetweefsel verteren, voeg een gelijk volume van collagenase digestie buffer en plaats ontsluitvat stevig in een schuddend waterbad gedurende 60 minuten bij 37 ° C (ongeveer 180 shakes / min).
   LET OP: Het beste is om een groter volume ontsluitvat gebruiken dan nodig is, omdat dit zorgt voor maximale vertering tijdens het schudden (dat wil zeggen, 250 ml collagenase spijsvertering buffer, 250 ml gewassen vetweefsel in een 1L steriele kolf).
5. Neutraliseer enzymatische activiteit door toevoeging van een gelijk volume FACS buffer en waardoor zitten bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Vervolgens centrifuge bij 233 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
6. Zorgvuldig aspireren en gooi het supernatant, het verzorgen van de high-density SVF pellet niet te verstoren.
7. Resuspendeer de pellet in 5-10 ml RT roodcellysis buffer basis van korrelgrootte. Laat oplossing zitten bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en centrifugeer bij 233 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
8. Zuig supernatant en resuspendeer de pellet door het toevoegen van 5-10 ml van de traditionele groeimedia, gebaseerd op korrelgrootte (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% penicilline-streptomycine oplossing [pen-strep]).
9. Filter de suspensie door een 100 um nylon cel zeef om cellulaire vuil te verwijderen.
10. Centrifugeer bij 233 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren.
11. Resuspendeer de pellet in 5-10 ml traditionele groeimedia basis van korrelgrootte.
12. Plaats 2 x 10 ⁶ cellen in een 15 cm kweekschaal standaard en primaire kweken O / N vast bij 37 ° C / 21% _O2, 5% _CO2. Handhaaf op sub-samenvloeiende niveaus spontane differentiatie bij 37 ° C / 21% _O2, 5% _CO2 in groeimedia voorkomen.
    OPMERKING: Celdichtheid in een volledigsamenvloeiende 15 cm plaat is ongeveer 4-6 x 10 ⁶ cellen.

2. kleuring

1. Cultuur ASC in traditionele groeimedium bij 37 ° C / 21% _O2, 5% _CO2 gedurende 36 uur voor kleuring / sortering.
2. Lift ASC uit selkweekplaten behulp Accutase (volgens het protocol van de fabrikant).
3. Was de cellen eenmaal met FACS buffer (PBS met 2% FBS en 1% pen-strep).
4. Centrifugeer bij 233 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
5. Giet het supernatans zonder verstoring van de pellet. Resuspendeer de cellen in 0.5-1 ml FACS buffer (afhankelijk van het aantal cellen en de hoeveelheid antilichaam gewenst).
   Opmerking: Het volume van de celsuspensie, overeenkomstig aanbevelingen van de fabrikant FACS antilichaam bepaalt antilichaamconcentratie. Echter, titratie van antilichaamconcentratie, met een beginconcentratie van 1: 100 wordt gewoonlijk aangeraden als het de eerste keer een antilichaam te gebruiken.
6. Tel het aantalcellen met een hemocytometer.
7. Reserve 100 ul aliquots in 1,5 ml centrifugebuizen worden gebruikt voor een ongekleurde monster en eenkleurige controles (afhankelijk van het aantal fluorescente antilichamen gebruikt).
8. Voeg de juiste fluorescent gemerkte monoklonale antilichamen (met vooraf bepaalde concentraties instructies van de fabrikant) en incubeer gedurende 20-30 minuten op ijs, afgeschermd van licht.
   1. Osteogene subpopulatie labelen: Verdun anti-CD90 (APC anti-humaan CD90 (Thy1)) of anti-CD105 (FITC anti-humaan CD105 (endoglin)) in FACS-buffer tot een concentratie van 1:50.
   2. Voor andere celpopulaties (bijvoorbeeld hematopoietische en endotheelcellen) label: Verdun anti-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), anti-CD34 (anti-menselijk CD34 APC), en / of anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) in FACS buffer tot een concentratie van 1:50.
   3. Als u geen direct geconjugeerde antilichamen, gebruik dan een gebiotinyleerd primair antilichaam met een passende streptavidine- geconjugeerde tweedeary antilichaam, zoals Streptavidine PE-Cy7, bij een verdunning van 1: 100.
9. Na incubatie was de cellen tweemaal: vul buizen met FACS buffer en centrifugeer bij 233 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, bovenstaande vloeistof opzuigen.
10. Resuspendeer de cellen in 400-500 pi FACS buffer en filter monsters door een 70 micrometer nylon zeef cel naar cel klonten te verwijderen.
11. Overdracht gelabelde cellen in FACS buisjes met filter dak en houdt monsters op ijs voor de duur van de analyse.

3. fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting

OPMERKING: De volgende stappen mandaat voorkennis in fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) of de hulp van een vakman.

1. Met behulp van de juiste FACS software, ontwerp analyse percelen aan voorwaartse verstrooiing (FSC), zijwaartse verstrooiing (SSC) te onderzoeken, fycoerythrine (PE) -Texas Rood, Pacific Blue, fluoresceïneisothiocyanaat (FITC), allophycocyanine (APC) en eventuele andere fluorofoor gebruikd om cellen te labelen.
2. Voorafgaand aan het laden in de cel sorter, kort vortex elk monster om de cellen opnieuw in suspensie.
3. Beginnen met een analyse van de niet-gekleurde monster om poorten te stellen voor de totale celpopulatie, cellulaire puin uit te sluiten, en de uitgangswaarde autofluorescentie bepalen.
4. Voeg propidium jodide (PI) aan de ongekleurde monster en analyseren om de populatie van levende cellen te visualiseren in de totale celpopulatie. De bouw van een hek rondom deze populatie.
5. Analyseer een eenkleurige controlemonster voor elke fluorochroom om fluorescentie schadevergoeding in te stellen.
6. Analyseer de gekleurde monster om de positie van de poorten voor het sorteren.
7. PI toe te voegen aan het gekleurde monster om dode cellen te kleuren.
8. Sorteer de gelabelde cel populaties. Sorteren op hetzij 1,5 ml centrifugebuizen of conisch (15 ml) kweekmedium.
9. Handmatig ophouden sorteren zodra de benodigde hoeveelheid cellen is verkregen.
10. Onsing FACS, voeren een zuiverheid controle door het analyseren van een kleine fractie (bijv., 500 cellen) van de overgenomen celpopulatie.
    OPMERKING: Deze stap bevestigt de zuiverheid van de gesorteerde celpopulaties. Idealiter zuiverheid van meer dan 90-95%.
11. Centrifugeer cellen bij 233 g gedurende 5 min bij 4 ° C onmiddellijk na de voltooiing van sorteren en resuspendeer in 1 ml vers medium bevattende 10% FBS.
    OPMERKING: De hoeveelheid gebruikte medium kan worden verhoogd op basis van de grootte van de cel pellet.
12. Plaat gelatine beklede platen om cellevensvatbaarheid te verbeteren. Afhankelijk eindcelconcentratie opbrengst plaat 300.000 cellen per putje in een 6-wells plaat, 100.000 cellen per putje in een 12-wells plaat.

Resultaten

Met CD90 als een merker voor cellen met verhoogde osteogenesis leidt tot isolatie van een sterk verrijkte populaties van humane ASC (Figuur 1A, 1B). ASC werden gekleurd met Pacific Blue-geconjugeerd anti-humaan CD45 FITC-geconjugeerd anti-humaan CD105 en APC-geconjugeerd anti-humaan CD90. Na het sorteren, de zuiverheid groter dan 98%, zoals gekwantificeerd door post-sort analyse.

Het definiëren van groepen van cellen op basis van transcriptionele profielen toegestaan ​​voor ...

Discussie

Momenteel is de isolatie van homogene subpopulaties van ASC's uit de SVF van menselijk vetweefsel blijft een uitdagende wel wenselijk doel. Isolatie van pro-osteogene ASC subpopulaties is bijzonder wenselijk, omdat dergelijke cellen kunnen worden gebruikt om de vorming en homeostase van skeletale weefsels te bestuderen. De SVF van vetweefsel herbergt opmerkelijke heterogeniteit wat celcapaciteit en differentiatie potentieel stam. ¹¹ De moleculaire basis voor deze heterogeniteit is niet begrepen worden uit...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Disposable 250 ml Conical Tubes	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin	Gibco	16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution	Stem Cell Technologies	7920
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences