Methodenartikel

Een colorimetrische test waarmee specifiek Granzyme B proteolytische activiteit: Hydrolyse van Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

12.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52419

⸱

28 november 2014

 ,  , 
1Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een eenvoudige, kwantitatieve colorimetrische test die specifiek de proteolytische activiteit van humane, muis- of ratten-Granzyme B (GzmB) meet. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast voor het bepalen van de protease-activiteit van andere granuulserineproteasen door de hydrolyse van andere synthetische peptide-substraten met een geschikte herkenningssequentie.

Samenvatting

De serine protease Granzyme B (GzmB) medieert de apoptose van doelcellen wanneer het wordt afgegeven door cytotoxische T-lymfocyten (CTL) of natuurlijke killer (NK) cellen. GzmB is de meest bestudeerde granzyme bij mensen en muizen en daarom hebben onderzoekers specifieke en betrouwbare hulpmiddelen nodig om zijn functie en rol in de pathofysiologie te bestuderen. Dit vereist vooral tests die geen proteasen zoals caspasen of andere granzymen herkennen die structureel of functioneel verwant zijn. Hier passen we GzmB's voorkeur voor splitsing na asparaginezuurresiduen toe in een colorimetrische assay met behulp van het peptidethioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB is de enige serine protease bij zoogdieren die in staat is dit substraat te splitsen. Het substraat wordt met vergelijkbare efficiëntie gesplitst door menselijke, muis- en ratten-GzmB, een eigenschap die niet wordt gedeeld door andere commercieel verkrijgbare peptidesubstraten, zelfs sommige die worden geadverteerd als geschikt voor dit doel. Dit protocol wordt gedemonstreerd met behulp van niet-gefractioneerde lysaten van geactiveerde NK-cellen of CTL en is ook geschikt voor recombinante proteasen die worden gegenereerd in verschillende prokaryotische en eukaryotische systemen, op voorwaarde dat de juiste controles worden gebruikt. Deze assay is een zeer specifieke methode om de potentiële pro-apoptotische activiteit van cytotoxische moleculen in zoogdierlymfocyten en van hun recombinante tegenhangers die door verschillende methodologieën worden geëxpresseerd, vast te stellen.

Inleiding

Granzymen zijn een familie van serine proteasen in de secretoire lysosomen van natural killer (NK) cellen en cytotoxische T-lymfocyten (CTL) 1. Vijf verschillende granzymen aanwezig in mensen (A, B, H, K en M) en tien muizen (A - G, K, M en N) 2,3. Granzyme A en Granzyme B (GzmA, GzmB) zijn de meest voorkomende en zijn uitgebreid onderzocht in de mens en knaagdieren setting.

De klassieke functie van GzmB is de inductie van apoptose in doelcellen uitgevoerd in samenhang met de porievormende eiwit perforin, die granzyme om de doelcel cytosol 4 toelaat. Hoewel GzmB expressie ondubbelzinnig in cytotoxische lymfocyten, hebben recente studies over uiteenlopende andere GzmB expressie celtypen, waaronder maar niet beperkt tot keratinocyten 5, 6 basofielen, mestcellen 7, plasmacytoïde dendritische cellen 8, B-cellen en 9, 10.In dit verband, werden niet-apoptotische GzmB functies geopenbaard variërend van deelname ontstekingsprocessen, weefsel remodellering en andere immuunregulerende eigenschappen 11-14.

Aangezien een breder biologische rol is voorgesteld voor GzmB dan vroeger werd gedacht, onderzoekers vereisen betrouwbare en specifieke instrumenten voor de detectie. Van voordeel is GzmB's specifieke eis aan te hangen aan de car- kant van asparaginezuurresiduen, een eigenschap uniek onder eukaryote serineproteases 15. Muis, mens en rat GzmB structureel zeer vergelijkbaar, maar de uitgebreide substraat specificiteit van muis GzmB subtiel verschilt van die van menselijke en rat 16, hetgeen betekent dat bepaalde algemene substraten met een Asp in de terminal (P1) efficiënt kan worden gesplitst door GzmB van alle drie de soorten, terwijl andere substraten met meer gecompliceerde sequenties stroomopwaarts van P1 kunnen sterk wisselende resultaten geven. Zowel in het verleden en meer recente literature, dit feit aanzienlijke verwarring en misinterpretatie van de biologische betekenis van sommige experimentele resultaten veroorzaakt, hoewel zorgvuldig gecontroleerde hebben kinetische studies getracht om de situatie te 17 corrigeren.

In dit document hebben wij getracht deze punten met twee commercieel beschikbare substraten, namelijk Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl en N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilide illustreren. De twee reagentia genereren verschillende reactieve groepen na splitsing (vrije sulfhydrylgroep versus een fluorescerende vrij paranitroanilide), maar dit heeft geen gevolg van proteolytische splitsing. De beschreven protocol is een modern aanpassing van een zeer oud protocol 18, maar moet helpen onderzoekers verschillende substraten GzmB passende wijze gebruik en ook een methodologisch kader voor het detecteren van de activiteit van andere granzymen, zoals GzmA en GzmH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: milten werden afgeleid van muizen (6-10 weken oud) en alle dierproeven werden uitgevoerd volgens het dier ethische richtlijnen van de Peter MacCallum Cancer Centre (E486).

1. Voorbereiding van de monsters.

  1. Bereiding van muizen geactiveerde NK-cellen.
    1. Isoleer primaire naïeve NK-cellen uit eencellige suspensies van de milt van C57BL / 6 of B6.GrzmB - / - (GzmB gen null) muizen door negatieve selectie met behulp van in de handel verkrijgbare kits.
    2. Volg protocol van de fabrikant. Kort magnetisch label "niet-NK" cellen zoals T- en B-cellen, dendritische cellen, granulocyten, macrofagen en rode bloedcellen met biotine geconjugeerde antilichamen tegen hun specifieke oppervlakte merkers. Gebruik magnetische scheiding met anti-biotine beads "niet-NK" cellen te verminderen.
    3. Geïsoleerde cultuur NK cellen gedurende 5-7 dagen in medium bevattende IL-2 (1000 U / ml) bij 700.000 cellen / ml in platen met 24 putjesbij 37   ° C.
    4. Alternatief gebruik geactiveerde T-cellen 19, primaire antigeen-beperkte CTL van OT1 T-celreceptor transgene muizen 20, CTL gegenereerd in gemengde lymfocytculturen 21 of supernatanten van geactiveerde NK-cellen de activiteit van uitgescheiden GzmB 19 bepalen.
  2. Onderhoud van menselijke NK-cellijn en isolatie van primaire NK-cellen.
    1. Handhaaf humane NK leukemie (YT-cellen) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum. Alternatief zuiveren primaire NK-cellen uit het perifere bloed van gezonde proefpersonen en stimuleren 2-3 dagen in medium dat IL-2 bij 100 U / ml zoals eerder beschreven 22.
  3. Generatie van cellysaten.
    1. Was de cellen drie keer in PBS (pH 7,4), daarna schorsen Nonidet P-40 lysis buffer (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Idealiter lyseren minste 5 x 10 6 NK-cellen of 1 x 10 7 T-cellen in 100 pl buffer. Gebruik proteaseremmers niet toevoegen, zoals velen irreversibele remmers van serine proteasen, in het bijzonder tryptasen zoals GzmA. Incubeer op ijs gedurende 20 min en vervolgens pellet de kernen in een microcentrifuge bij 15.000 xg gedurende 10 min. Gooi de nucleaire pellet en breng het supernatant naar een nieuwe buis.
  4. Bepaal de eiwitconcentratie van de lysaten.
    1. Gebruik een in de handel verkrijgbaar protocol van keuze, zoals, Bradford of bicinchoninezuur (BCA) en bepalen van de eiwitconcentratie. Zorg ervoor dat de concentratie is ~ 2 mg / ml minimum. WINKEL lysaten bij -20 ° C totdat ze nodig waren (granzyme activiteit stabiel gedurende vele maanden bij -20 ° C).

2. Granzyme B Activity Assay

  1. Bereiding van reagentia
    1. Bereid een 10 mM voorraadoplossing van de substraten (Boc-AAD-S-Bzl of Ac-IEPD-pNA) in DMSO (~ 5 mg / ml) en bewaar in monsters bij -20 & #176; C. Bereid werkverdunningen vers en gooi deze na elke dag, zoals Boc-AAD-S-Bzl gedeeltelijk hydrolyseert op opslag in DMSO.
    2. Bereid een 250 mM voorraad van de colorimetrische reagens (5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoëzuur), DTNB) in DMSO (0,09 g / ml) en bewaar bij -20 ° C. Bereid een frisse werkende verdunning elke dag. Dit reagens is alleen vereist voor ondergronden met SBzl indicator groepen, niet pNA.
    3. Make up verse buffer (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl2, pH 7,3) om de 2-3 weken.
  2. Breng DTNB en synthetische substraten kamertemperatuur. Verdun substraten (01:16, bijvoorbeeld 100 ul in 1,6 ml buffer) en DTNB (1: 250, bijvoorbeeld 10 ul in 2,5 ml buffer) en meng.
  3. Verdun minste 100 ug eiwit lysaat van elk monster in buffer tot een eindvolume van 160 pl. Met een multichannel pipet voeg 50 ul per putje in drievoud (~ 33,3 ug / putje) in een 'U' 'bottom vinyl 96-well plaat.Onder andere een "alleen-buffer" control (ook in drievoud).
  4. Voeg 100 ul van verdund DTNB om de monsters / buffer controle (deze stap overslaan bij het werken met Ac-IEPD-pNA.
    OPMERKING: Splitsing van Ac-IEPD-pNA door GzmB direct releases fluorogeen pNA (Figuur 4B).
  5. Gebruik een meerkanaalspipet om snel 50 pi verdund substraten toe te voegen aan elke set van drievoud, te beginnen met de buffer dan de negatieve controles en afwerking met verwachte positieve monsters.
  6. Plaats de plaat in de plaat lezer. Meet Asp-ase activiteit door hydrolyse van Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA in een microplaat lezer bij OD 405 nm. Gebruik een kinetische assay protocol, nemen 25 lezingen, elke 15 sec (ca. 6 min totale leestijd).
  7. Gebruik de absorptieaflezingen gegenereerd op elk tijdstip handmatig berekenen de snelheid van substraatsplitsing als software het plaatvormige lezer niet kan genereren waarde Vmax.

3. Analyse van de Data

OPMERKING: De gegenereerde gepresenteerd maximale snelheid data, gedefinieerd als verandering van OD tijd (mOD / min).

  1. Om de gegevens te analyseren, bepalen de maximale snelheid van substraat splitsing, die wordt berekend op basis van de mate van verandering in absorptie. Doe dit automatisch met behulp van de plaat lezer software, die meestal heeft deze optie.
  2. U kunt ook na het bekijken van de kinetische percelen van verandering in absorptie, die ontstaan ​​tijdens de kinetische assay op de plaat lezer, handmatig selecteren van de data punten die de steilste rechte lijn te geven. Voor de meeste tests de maximale snelheid wordt bereikt binnen de eerste 2 minuten van de test.
  3. Trek de aanvankelijke OD lezen vanaf het hoogste OD lezen op deze rechte lijn en delen door het tijdsinterval. Transfer ruwe data naar Microsoft Excel / Graph pad voor statistische analyse en grafische weergave.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De Boc-AAD-S-Bzl substraat specifiek voor GzmB

De serine protease GzmB een hoofdbestanddeel van cytotoxische lymfocyten (CTL en NK-cellen) en is hoofdzakelijk verantwoordelijk voor het induceren van snelle apoptotische dood in doelwitcellen, zoals in geïnfecteerde of getransformeerde cellen. Dit is grotendeels te wijten aan het substraat voorkeur voor splitsing na bepaalde asparaginezuurresidu in geselecteerde eiwitten, een kenmerk gedeeld met caspasen, die ook splitsen na a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Historisch gezien granzymen werden geïdentificeerd als belangrijke effector moleculen van cytotoxische lymfocyten (CTL en NK cellen) kan induceren een snelle apoptotische dood in doelwitcellen. Dit was voornamelijk te wijten aan de werking van GzmB, waarvan bedoelde substraat moleculen gesplitst op aspartaat (D) residuen en derhalve kon de caspase cascade activeert zowel splitsen pro-caspasen, evenals verscheidene hun stroomafwaartse doelwitten. Het is echter nu duidelijk zijn dat GzmB expressie niet beperkt tot lymfoïd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk ontving ondersteuning via subsidie HA 6136/1-1 van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Duitse Onderzoeksgemeenschap) aan MH. JAT wordt ondersteund door Programma- en Projectsubsidies van de National Health and Medical Research Council van Australië.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Boc-Ala-Ala-Asp-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASMSB05Granzyme B substraat (muis en mens)
Ac-IEPD-pNA SM Biochemicals LLC, CASMPNA009Granzyme B substraat (alleen mens)
N-α-CBZ-L-lysine-S-BzlSigma-AldrichC3647Granzyme A substraat
Suc-Phe-Leu-Phe-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASB025Granzyme H substraat
5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) Sigma-AldrichD8130DTNB, Ellman’s Reagens
NK cell isolation kit II muisMiltenyi Biotec GmbH130-096-892negatieve selectie kit
NK cell isolation kit mensMiltenyi Biotec GmbH130-092-657negatieve selectie kit
Plate readerBiorad iMarkBiorad Microplate Manager Software Versie MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plateCorning, MA, USA2797

Referenties

  1. Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
  2. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
  3. Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
  4. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
  5. Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
  6. Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
  7. Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
  8. Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
  9. Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
  10. Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
  11. Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
  12. Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
  13. Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
  14. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
  15. Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).
  16. Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
  17. Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
  18. Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
  19. Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
  20. Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
  21. Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
  22. Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
  23. Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
  24. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
  25. Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
  26. Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
  27. Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
  28. Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
  29. Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
  30. Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
  31. Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Granzym B activiteitNK cellysaatmeting van proteolytische activiteitsubstraatspecificiteitDTNB reactiemicroplatelezergranzym B knock outcytotoxische lymfocyten

Gerelateerde artikelen