Methodenartikel

Functionele Het oplossen en Channel activiteit Metingen van gezuiverde wildtype en mutante CFTR eiwit

11.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52427

⸱

9 maart 2015

 ,  , 
1Programme in Molecular Structure and Function, Hospital for Sick Children, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Physiology, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschreven is een snelle en efficiënte procedure voor de functionele reconstitutie van gezuiverde wildtype en mutante CFTR-eiwit dat activiteit behoudt deze chloride kanaal, die defect in Cystic Fibrosis. Jodide efflux uit opgelost proteoliposomen gemedieerd door CFTR maakt studies van het kanaal en de effecten van kleine moleculen.

Samenvatting

De Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is een uniek-kanaal vormen lid van het ATP-binding cassette (ABC) superfamilie van transporteurs. De fosforylering en nucleotide afhankelijk chloride kanaal activiteit van CFTR is veelvuldig onderzocht in volledige cel systemen en als enkele kanalen in weggesneden membraan patches. Veel Cystic fibrosis veroorzaken mutaties bleken deze activiteit veranderen. Terwijl een klein aantal zuiveringsprotocollen gepubliceerd, zijn een snelle reconstructie methode kanaal activiteit behoudt en een geschikte methode voor het bestuderen populatie kanaal activiteit in een gezuiverd systeem ontbroken. Hier snelle werkwijzen beschreven voor zuivering en functionele reconstitutie van de volledige lengte CFTR-eiwit in proteoliposomen gedefinieerde lipiden die activiteit behoudt als gereglementeerde halogenide kanaal. Deze reconstructie methode om samen met een nieuw-flux gebaseerde test van de activiteit op het kanaal is een geschikt systeem voorhet bestuderen van de bevolking kanaal eigenschappen van wild-type CFTR en de ziekte veroorzaken mutanten F508del- en G551D-CFTR. Specifiek, de methode bruikbaarheid bij het bestuderen van de directe effecten van fosforylatie, nucleotiden en kleine moleculen zoals versterkers en inhibitoren op CFTR kanaalactiviteit. De werkwijzen zijn ook ontvankelijk voor de studie van andere membraankanalen / transporters voor anionische substraten.

Inleiding

Chloride transport over de apicale membranen van epitheelcellen in dergelijke weefsels zoals de longen, darmen, alvleesklier en zweetklieren wordt voornamelijk gemedieerd door de Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), een ATP-en-fosforylering gereguleerd lid van de ABC (ATP- Binding Cassette) C subfamilie van membraaneiwitten (besproken in 1). Net als andere leden van de subfamilie ABCC, CFTR is een grote multi-spanning integraal membraaneiwit dat ATP bindt op twee nucleotide bindingsplaatsen gevormd op het grensvlak van de nucleotide-bindende domeinen (NBD), waar het bezit geringe ATPase activiteit op één het terrein. Anders dan andere ABCC subfamily leden CFTR heeft zich ontwikkeld als een uniek gereguleerde Cl kanaal niet als een actieve opgeloste stof transporter.

Mutaties in CFTR oorzaak Cystic Fibrosis, een ziekte die meerdere organen zoals de longen, maagdarmkanaal, pancreas en voortplantingsorganen, waardoor Morbidity en mortaliteit bij jonge volwassenen. Longziekten goed typisch voor vroege mortaliteit in Cystic Fibrosis en in de meeste gevallen wordt veroorzaakt door het verlies van CFTR-functie op het oppervlak epitheel van de geleidende luchtwegen. Het ontbreken van CFTR chloride kanaal activiteit veroorzaakt een reductie van zowel Cl - en waterbeweging over het oppervlak epitheel de vloeistoflaag op het apicale oppervlak van de trilhaar respiratoire epitheel wijzigen. Dit resulteert in een oppervlak viskeuze vloeistof luchtweg die het vermogen van trilharen respiratoire epitheelcellen vermindert effectief duidelijk ziektekiemen uit de luchtwegen. Bijgevolg meeste CF-patiënten lijden aan herhaalde aanvallen van longontsteking en longschade als gevolg van ontsteking.

Zoals verwacht, studies van het werkingsmechanisme van de normale CFTR-eiwit primair gericht op gedetailleerde elektrofysiologische studies zijn kanaal gating activiteit. Enkel kanaal studies hebben aangetoond direct dat CFTR functioneert als een PKA-afhankelijke Cl- Kanaal dat een ATP-gereglementeerde poort 2 bezit. Gedetailleerde elektrofysiologische studies veel informatie over één CFTR kanalen 1,3, maar er kan zorg of de kenmerken van een bepaald afzonderlijk kanaal dat is onderzocht weerspiegelt de gehele bevolking van CFTR kanalen en derhalve de enkelkanaals resultaten moet altijd worden beschouwd, samen met methoden om de macroscopische bevolking te bestuderen. Directe test van de bevolking kanaal activiteit van gezuiverd CFTR heeft de potentie om inzicht te geven in de moleculaire defect in verband met ziekte-veroorzakende mutaties en ontdekking van chemische modulators die reparatie gemuteerde CFTR-eiwitten rijden. Tot op heden zijn er meer dan 1900 verschillende mutaties in CFTR gedacht te veroorzaken Cystic Fibrosis 4. De belangrijkste mutatie, F508del-CFTR, bij ten minste één allel in ongeveer 90% van de patiënten in Noord-Amerika en Europa leidt tot een eiwit misfoldingnd retentie in het endoplasmatisch reticulum 5. F508del-CFTR heeft ook andere gevolgen, waaronder defecte kanaal activiteit 6-9. De resulterende afwezigheid van CFTR van het celoppervlak geassocieerd met ernstige ziekte. G551D-CFTR, een minder voorkomende mutatie wordt gedacht goed nog gevouwen disfunctioneel als chloride kanaal op het celoppervlak 6. Het ontwikkelen van moleculen correctors en versterkers heeft als doel het corrigeren vouwen en / of handel van mutanten zoals F508del CFTR naar het celoppervlak, en versterkende of verhogen van de kanaalactiviteit van mutaties zoals G551D wanneer aanwezig op het celoppervlak respectievelijk . Terwijl de correctors VX-809 en VX-661 (nog niet goedgekeurd voor gebruik bij patiënten, de potentiator Kalydeco (ivacaftor, VX-770) wordt gebruikt bij 150 mg elke 12 uur bij CF-patiënten> 6 jaar met ten minste één G551D -CFTR mutatie, en meer recent voor patiënten met een van G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pen G1349D. Kalydeco zowel veilig en resulteert in verbetering van de klinische metingen van CF ziekte 10, maar het werkingsmechanisme van deze kleine moleculen is slecht begrepen bij de FDA goedgekeurd voor gebruik bij patiënten.

Een handvol CFTR zuiveringsmethoden zijn eerder beschreven 2,11-18, waarvan vele vereisen een aanzienlijke tijd in beslag. In een recente publicatie 19, werd een unieke snelle zuivering en reconstitutie werkwijze beschreven voor CFTR overexpressie in de Sf 9 cellen expressiesysteem en het gezuiverde eiwit in bepaalde lipide systemen gebruikt om CFTR halogenide kanaalactiviteit assay te ontwikkelen voor een populatie van CFTR moleculen. De assay recapituleert de bekende effecten van fosforylering, nucleotiden en inhibitoren op CFTR-functie. Het systeem werd gebruikt om de effecten van de potentiator ondervragen VX-770 / Kalydeco op gew- (wild-type), F508del- en G551D-CFTR en werd voor het eersttijd dat het geneesmiddel direct een interactie met het CFTR-eiwit te zijn kanaal activiteit in een ATP-onafhankelijke wijze versterken, demonstreren het nut en de toepasbaarheid van deze werkwijzen voor het bestuderen van de interactie van CFTR en mutanten met nucleotiden en kleine moleculen uit een populatie perspectief beantwoorden klinisch relevante vragen over het eiwit. De werkwijzen zijn ook gebruikt om andere versterkingsmiddel moleculen en derivaten daarvan 20, alsook de effecten van een klein molecuul corrector op de activiteit van het eiwit 21 te bestuderen.

Efflux assay zijn gebruikt in vele studies die eerder voor de activiteit van CFTR mutanten en de effecten van CFTR-modulerende verbindingen op de activiteit, met inbegrip van hele cel assays met elektroden radioactieve tracers en fluoroforen 22,23, membraan blaasjes met ion selectieve elektroden 24 onderzoeken en gezuiverd gereconstitueerde CFTR met radioactieve tracers 25. Echter the gebruik van ion-selectieve elektroden aan gezuiverde gereconstitueerde CFTR studie werd voor het eerst onlangs 19 gemeld. Een aanpassing van de huidige methode is gebruikt voor de bereiding en functionele karakterisatie van twee membraaneiwitten in Pseudomonas aeruginosa, een gemeenschappelijk CF pathogeen. Reconstitutie van gezuiverde alge buitenmembraan eiwit gekoppeld jodide efflux metingen werden gebruikt om een model van anionische alginaat secretie ondersteunen door deze transporteur 26. Reconstitutie en jodide efflux metingen werden toegepast op gezuiverde Wzx eiwit, waardoor een model voorgesteld dat een H + -afhankelijke antiport mechanisme lipiden gekoppelde oligosaccharide translocatie over het bacteriële binnenmembraan suggereert van dit eiwit 27. In beide gevallen werd jodide gebruikt als een surrogaat voor de anionische substraat, zij het in lagere doorvoersnelheid dan men zou verwachten voor een native substraat. De werkwijze kan geschikt zijn voor aanpassing aan andere eiwitten met zijn cationic vervoer of geleidingsroutes voor anionische substraten.

Hier een snelle zuiveringsprocedure beschreven voor het CFTR-eiwit en reconstitutie in proteoliposomen gedefinieerde lipide. De snelle reconstitutie procedure kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met CFTR gezuiverd door andere methoden, mits het soort wasmiddel bij de zuivering vatbaar is voor verwijdering door de hier gebruikte methoden of kan worden vervangen door een geschikt reinigingsmiddel voor de reconstitutie procedure. Het jodide efflux Werkwijze voor het meten van kanaalactiviteit van gezuiverd en gereconstitueerd CFTR-eiwit wordt beschreven en enkele typische resultaten die kunnen worden verkregen uit deze werkwijze worden gepresenteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Zuivering van CFTR

OPMERKING: Zie de tabel van materiaal en apparatuur voor een lijst van apparatuur en materialen die worden gebruikt in dit protocol. Een gedetailleerd protocol bestaat overexpressie van humaan WT-CFTR en mutanten in Sf 9-baculovirus expressiesysteem 17,28. Overexpressie van CFTR en pellets, van S f 9 cellen volgens dit protocol te bereiden.

  1. Ruwe membraanbereiding
    1. Verkrijgen van een vers of ontdooien van een bevroren Sf 9 celpellet van een kweek van 500 ml van cellen over-expressie wildtype-, F508del- of G551D CFTR-eiwit met een C-terminale His-tag 10, gekweekt door standaard celkweek werkwijzen, zoals eerder beschreven 17,28. Celpellets een volume van ongeveer 5 ml en een nat gewicht van ongeveer 5 g hebben.
    2. Resuspendeer Sf 9 cellen in 20 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 met protease inhibitor cocktail (1 tablet per 50 ml) bij 4 ° C, zodat demonster verschijnt visueel homogeen en geen klonten van cellen blijven.
    3. Lyse cellen met behulp van een hoge druk cel disruptor (tabel van materialen en apparatuur), het bereiken van een minimum van 10.000 psi (bij voorkeur 15.000-20.000 psi) gedurende 2 minuten per passage. Houd het monster bij 4 ° C gedurende lysis.
      1. Verzamel het monster in een buis op het ijs na de lysis periode direct daarna herladen het monster in de cel disruptor. Herhaal lysis procedure 3 keer. Onderzoek onder een microscoop te waarborgen minder dan 10% intact blijft.
        OPMERKING: andere methodes lyseren cellen, zoals glasparels, enz. Zijn niet strikt voor dit systeem onderzocht hoewel een gebruiker te klikken een alternatieve methode geschikt is.
    4. Centrifuge cellysis materiaal bij 4 ° C in een hoge snelheid centrifuge bij 2000 xg gedurende 20 min. Gebruik de bovenstaande vloeistof en gooi de pellet. Verdeel het supernatant tussen 20 en centrifugeer de monsters gedurende 1 uur bij 4 ° C bij 125.000 xg in een tafelblad ultracentrifuge.
    5. Verwijderen en gooi het supernatant, zorg dat u de pellet, en op te slaan pellets in dezelfde buizen bij -80 ° C niet te verstoren voor minder dan 2 maanden tot gebruik, of te behouden op ijs en ga verder met de zuivering onmiddellijk.
  2. CFTR oplosbaar
    1. Verkrijgen 1-4 vers of bevroren Sf 9 ruwe membraanpellets en resuspendeer elk in 1 ml buffer 1 (2% fos -choline; zie Tabel 1 voor de volledige receptuur) bij 4 ° C op ijs, met een 25 G naald en 1 ml spuit totdat de oplossing homogeen oog zonder zichtbare celmembraan klonten. Wanneer meer dan één pellet wordt oplosbaar blijven elk monster de instructies voor een enkele korrel parallel behandelen hieronder bundeling van monsters in stap 1.3.2.
    2. Los 1 mini proteaseremmer tablet 1 ml van Buffer 2 (10 mM imidazool, zie tabel 1) dat fos -choline 14 detergens mist (proteaseremmers 10x concentgewaardeerd dan hun aanbevolen verdunning op dit punt) en voeg 100 ul aan de geresuspendeerde onzuivere membraanpellet (proteaseremmers zijn dan de aanbevolen verdunning op dit punt). Ingesteld op ijs voor 45-60 min met het mengen door inversie 5 keer om de 5 min.
    3. Centrifugeer geresuspendeerde ruwe membraanpellet in een tafelblad ultracentrifuge gedurende 25 min bij 125.000 xg en 4 ° C. Bewaar de supernatant, die opgeloste CFTR bevat en de pellet weggooien.
  3. Column binding, fosforylering en elutie
    1. Was 400 ul van nikkel-NTA (nitrilotriazijnzuur) agarose slurrie of gelijkwaardige hars met 1 ml van Buffer 2 (10 mM imidazool, zie tabel 1) dat detergens mist, te verwijderen oplosmiddel en buffer bij 4 ° C. Herhaal wassen twee keer meer.
    2. Combineer oplosbaar CFTR, resterende proteaseremmer (900 ui) en nikkel hars (400 pl suspensie) tot een totaal van 10 ml met buffer 2 (10 mM imidazol; zie Tabel 1) which mist elke toegevoegd schoonmaakmiddel. De fos -choline 14 concentratie effectief verdund tot 0,2% (w / v) bij deze stap. Als er meerdere buizen zwembad alle monsters die oplosbaar CFTR, proteaseremmers, nikkel-NTA-hars en 0,2% (w / v) fos -choline-14 op dit punt. Incubeer gedurende 60 min bij 4 ° C onder zacht schudden.
    3. Pass CFTR-proteaseremmer-nikkel-NTA-oplossing in een kleine screening kolom (tabel 1) of een gelijkwaardige lege kolom.
    4. Was de nikkel NTA hars, die wordt vastgehouden in de kolom met 4 ml per initiële pellet buffer 3 (10 mM imidazool + DDM; zie tabel 1) dat fos -choline 14 mist maar bevat 1 mM DDM (dodecylmaltoside detergent), bij 4 ° C. Toevoeging van DDM reinigingsmiddel niet significant verandert de pH van deze buffer.
    5. Bereid PKA-MgATP door toevoeging van 25 ul (5 mM, eindconcentratie) van MgATP, 2500 U van cAMP-afhankelijke proteïne kinase A katalytische subeenheid (PKA) 475 gl buffer 3 (10 mM imidazool + DDM; zie tabel 1) op de kolom. Fosforyleren eiwitten door het afdichten van het ondereinde van de kolom met een pet of Parafilm, en het toevoegen van 500 pi van PKA-MgATP oplossing van elke eerste pellet gebruikt.
    6. Incubeer bij kamertemperatuur (20 ° C) gedurende 20 minuten onder zacht mengen en opnieuw suspenderen van de hars met een 1 ml pipet elke 2 minuten opdat PKA is in contact met het gehele oppervlak van de nikkel-NTA hars.
    7. Verwijder de dop en elueren de PKA / MgATP oplossing uit de kolom. Was de kolom met 2 ml buffer 3 (10 mM imidazool + DDM zie tabel 1) bij 4 ° C.
    8. Vermenigvuldig het aantal korrels in het experiment 4. Was de kolom met het aantal ml buffer 4 (50 mM imidazol + DDM zie tabel 1) bij 4 ° C door toevoeging van 4 ml buffer aan de kolom, waardoor dat het door en direct verwarmd toevoegen komende 4 ml portie aan de kolom.
    9. Elueer het eiwit door het passeren van 1 ml van buffer 5 (600 mM imidazol + DDM zie tabel 1) bij 4 ° C per initiële pellet gebruikt door de kolom, 1 ml per keer zonder pauze om de kolom te drogen, en verzamel de volledige eluaat met gezuiverde CFTR in een enkele buis.
    10. Concentreer eiwitmonster om imidazool en laag moleculair gewicht afbraakproducten te verwijderen met behulp van een centrifuge filter apparaat (100.000 moleculair gewicht cut-off), zoals in de tabel van materialen en apparatuur of ander soortgelijk apparaat beschreven, in een totaal van 10 ml buffer 6 (75 mm KI + DDM; zie Tabel 1) of andere buffer van keuze die 1 mM DDM (zoals buffer 7 voor niet-jodide efflux experimenten, 25 mM HEPES + DDM; zie Tabel 1), door centrifugeren bij 2000 xg en 4 ° C ongeveer 20 min tot het monster geconcentreerd tot 200 pl. Verdun het monster tot 10 ml en herhaal de concentratie stap.
      LET OP: In onze ervaring (niet gepubliceerd), imidazool aanzienlijk inhibeetjes de ATPase activiteit van CFTR en dient deze stap door verdunning en concentratie worden verwijderd minste tweemaal indien het monster wordt gebruikt voor functionele metingen.
    11. Verzamel geconcentreerde gezuiverd CFTR. Bewaar bij 4 ° C in aanwezigheid van DDM buffer tot gebruik binnen 1-2 dagen verder onmiddellijk aan de reconstitutie stap. Niet in de vriezer het gezuiverde eiwit, zoals in onze ervaring die we waarnemen verminderde activiteit.

2. Reconstructie van CFTR

  1. Lipidepreparaat
    OPMERKING: CFTR is met succes opgelost in ei PC, POPC, 2: 1 (w / w) ei PC: POPC (1: 1 w / w) mengsel of een mengsel van PE: PS: PC: ergosterol, 5: 2 2: 1 (w / w).
    1. Voor jodide efflux experimenten, droge 5 mg Egg PC (200 ul van 25 mg / ml bouillon, zie Tabel van materialen en apparatuur) onder een stroom van argon gas gedurende 20 min bij kamertemperatuur in een Pyrex of andere stevige (niet-borosilicaat ) glazen buis.
    2. Met absorptie bij 280 nm, een ELISA eenssay of andere wijze, de mogelijke concentratie van de gezuiverde CFTR eiwit monster. Voor jodide efflux experimenten met wildtype CFTR, gebruikt een eiwit: vet verhouding van 1: 300-1: 3000 (w / w) om een ​​voldoende signaal te produceren. Voor G551D- en F508del-CFTR gebruikt een eiwit: vet verhouding van ongeveer 1: 200-1: 1200 (w / w) om efflux te detecteren.
    3. Optimaliseer het eiwit: lipide-ratio voor elke specifieke systeem. Bereken de hoeveelheid gezuiverde eiwit nodig. Bereken het volume van buffer met 1 mM DDM vereist om een uiteindelijke volume van 1 ml, dat wil zeggen 1 ml maak - (volume eiwitoplossing vereist) = volume buffer.
      1. Voeg de berekende volume van de gewenste buffer-systeem met 1 mM DDM naar de gedroogde lipide (maar niet toe het CFTR-eiwit op dit moment) en bedek de glazen buis met Parafilm. Voor jodide efflux experimenten, opnieuw in suspensie lipiden in Buffer 6 (75 mM KI + DDM; zie tabel 1). Voor andere experimenten opnieuw in suspensie in buffer 8 (25 mM HEPES + DDM, zieTabel 1) of een andere gewenste interne buffer bevattende 1 mM DDM.
      2. Vortex gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur te helpen bij suspensie van het lipide in de buffer DDM. Alternatief Verwarm het monster tot 37 ° C gedurende 1-2 min voor vortexen.
    4. Suspendeer het lipide herhaaldelijk bij kamertemperatuur met een 1 ml spuit en 25 G naald totdat geen lipide film zichtbaar aan de zijkanten van de buis. Vermijd het injecteren van lucht in de oplossing die fijne bubbels zou produceren en te helpen bij de oxidatie van jodide en lipiden.
    5. Ultrasone trillingen de geschorste lipide in de Parafilm bedekt buis voor een 20 sec uitbarsting in een badsonificeerinrichting met ijs, en dan meteen over te dragen aan ijs gedurende 1 min. Herhaal dit 3 keer.
      OPMERKING: Intense sonicatiebuffer blijkt jodide oplossingen geel als gevolg van oxidatie. Vermijd daarom te hoge geluidsgolven. Bewaak het monster voor kleur verandert. Als een kleurverandering wordt opgemerkt, gooi het monster en opnieuw voor te bereiden. De kleurverandering door oxidatie van sommigehet jodide zou leiden tot oxidatie van de lipiden onder dezelfde omstandigheden. Het verplaatsen van de lucht uit de buis met argongas voor sonificeren de oplossing helpt oxidatie van lipiden en jodide voorkomen. Intense geluidsgolven kan een slechte kwaliteit of bekraste glazen buizen resulteert in het verlies van het monster te breken.
    6. Voeg de hoeveelheid gezuiverde CFTR berekend in stap 2.1.3 het lipide gesoniceerd monster een een eindvolume van 1 ml te bereiken. Meng het eiwit met de lipide en schoonmaakmiddel door resuspensie 10 keer met een 25 G naald en 1 ml spuit.
    7. Stel lipiden en eiwitten monster op ijs gedurende 30 minuten met wervelende van de buis tot 5 keer om de 5 min mengen.
  2. -Detergent bindend column voorbereiding
    1. Zorg voor een eenmalig gebruik commercieel-detergent bindend spin-kolom (zie tabel van materialen en apparatuur) met een 1 ml volume capaciteit en breek het tabblad onderaan te beginnen met de kolom stroomt.
    2. Centrifugeer de kolom gedurende 2 min bij 2.000 xg om de opberg verwijderenUffer, en gooi deze buffer.
    3. Voeg 5 ml buffer 7 (75 mM KI, zie tabel 1) op de kolom en centrifugeer bij 200 xg gedurende 4 min aan de wasbuffer elueren. Herhaal deze stap nog 2 maal voor een totaal van 3 wassingen om alle sporen van de opslagbuffer te verwijderen. Gooi alle doorstroming.
      LET OP: Het is cruciaal dat de buffer gebruikt om de kolom te wassen NIET DDM of enige andere reinigingsmiddel bevat. De kolom heeft een eindige bindingscapaciteit voor detergens en als een buffer die detergens wordt gebruikt, wordt de kolom effectief bij het verwijderen van het detergens uit de eiwit-lipide-detergens monster.
    4. Aliquot zorgvuldig alle 1 ml van het lipide-detergens-eiwitmonster op de top van de kolom hars en incubeer monster bovenin de kolom gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Centrifugeer het monster bij kamertemperatuur gedurende 4 min bij 2000 xg en verzamel de troebel proteoliposome monster in een schone 1,5 of 2 ml microcentrifugebuis of een glazen buis en plaats de samPLE op ijs.
    6. Verzamel resterende proteoliposomen in de kolom door toevoeging van 200 ul buffer 7 (75 mM KI, Tabel 1) of andere buffer (zonder detergens) naar de top van de kolom en herhaal de centrifugatiestap gedurende 2 min.
    7. Voeg de tweede eluaat naar de proteoliposome monster als het ziet er bewolkt.
    8. Bewaar het monster bij 4 ° C overnacht of onmiddellijk gebruiken jodide efflux metingen.

3. Jodide Efflux Metingen voor Gezuiverd, Bereide CFTR

  1. Genereren van een jodide gradiënt over de proteoliposomal membraan
    1. Pre-swell Sephadex G50 kralen in buffer 9 (75 mM K-Glu kaliumglutamaat, zie tabel 1), (ongeveer 5 g droge korrels in 50 ml buffer) of gewenste externe buffer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur of 4 ° C gedurende de nacht.
    2. Bereid 4 Sephadex G50 kolommen verzadigd Buffer 9 (75 mM K-Glu, zie tabel 1) of anderebuffer in kleine screening kolommen geladen hars tenminste ¾ in de kolom.
    3. Centrifugeer gedurende 4 min bij 2000 xg om overtollige buffer van de hars te verwijderen. Er moet ongeveer 2,25 ml verpakt gehydrateerd hars in de kolom aan het einde van de centrifugatiestap.
      OPMERKING: Hars moet licht worden gehydrateerd maar niet ondergedompeld in vloeistof en een daaropvolgende korte draai mag niet significant volume van de buffer te elueren. Het is van cruciaal belang voor de succesvolle elutie van de proteoliposome monster dat de kolom hars is niet te nat en niet te droog en de gebruiker kan het nodig zijn om te experimenteren met de kolommen om vertrouwd te raken met de meest succesvolle bufferuitwisseling voorwaarden geworden.
    4. Voeg voorzichtig 125-150 pl proteoliposome monster aan de bovenkant van elke kolom en centrifugeer gedurende 4 minuten bij 2000 x g.
    5. Pool proteoliposome eluaten samen voor onmiddellijk gebruik in jodide efflux of andere experimenten.
      OPMERKING: De geëlueerd volume van elke kolom moet ongeveer zijn150 pi en het monster moet enigszins bewolkt, maar minder bewolkt dan de oorspronkelijke monster. Grotere volumes of duidelijk eluaten suggereren dat de kolommen onvoldoende zijn gedroogd, of gedroogd zijn te veel respectievelijk, en niet tot een succesvolle jodide efflux experiment.
  2. Jodide efflux assay
    1. Was een jodide selectief micro-elektrode (Tabel van materialen en apparatuur) uitgebreid met gedeïoniseerd water, en vervolgens incubeer gedurende 20 minuten voor het experiment in buffer 10 (15 uM KI, zie tabel 1). Was de elektrode weer uitgebreid met gedeïoniseerd water.
    2. Voeg 150 ul geneesmiddel (20 uM gebruikelijke concentratie tot een uiteindelijke concentratie van 10 uM in de assay te produceren) in buffer 9 (75 mM K-Glu, zie tabel 1) of voertuig buffer 9 op een putje van een plaat met 96 putjes met een kleine vlo roerstaafje.
      1. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Gebruik een pipet tip verdwaalde te verwijderenbubbels. Als een geneesmiddeloplossing wordt gebruikt, zorgen dat de uiteindelijke DMSO-concentratie in de put minder dan 1% (v / v) (meestal 0.1-0.2% (v / v)).
    3. Voeg 150 pi van gereconstitueerd CFTR-eiwit die in paragraaf 3.1 werd in buffer 9 (75 mM K-Glu, zie Tabel 1) om de put met geneesmiddel of buffer tot een totaal volume van 300 pl produceren in de put van de plaat.
    4. Plaats de plaat met 96 putjes op een roerplaat en roer bij 130 rpm (of bij een matige snelheid van ongeveer ¼ van de maximale snelheid).
    5. Steek de punt van de jodide elektrode voorzichtig in de put met het monster zodanig dat de punt niet raakt de bodem van de put of aanstoten door de roerstaaf. Zorg ervoor dat de referentie-elektrode, indien afzonderlijk, ook in contact met de oplossing in de put.
    6. Record traces met behulp van een zelfgemaakte of commerciële computerprogramma dat interfaces met de elektrode (zie tabel van materiaal en apparatuur voor details).Gebruik een sampling rate van 2 Hz, met filtering van het signaal door een laagdoorlaatfilter.
    7. Laat het monster equilibreren 5 minuten om een ​​stabiele vlakke of bijna stabiel basislijn produceren tijdens het opnemen.
    8. Voeg 3 ul MgATP (100 mM stock bereid in dH 2 O en ingesteld op pH 7 met KOH, 1 mM eindconcentratie) verdund om het eiwit te activeren. Laat ~ 5 min naar een nieuwe stabiele basislijn te bereiken. Altijd de pH van de 100 mM MgATP stock neutraal voor gebruik om veranderingen in de pH van de externe buffer vermijden.
    9. Voeg 3 ul van valinomycine voorraad (2 uM, 20 nM eindconcentratie) verdund veranderingen in potentiaalverschil opgewekt door jodide-selectieve geleiding door CFTR shunt. Noteer de dalende helling (afname in mV) door CFTR-gemedieerde jodide efflux activiteit ten minste 5 min.
    10. Om het vangen van jodide in het proteoliposoom lumen voldoende, voeg 3 ui 10% (v / v) Triton X-100 aan het monster. Significant en jodide onmiddellijke afgifte aangeeft dat voldoende jodide is gevangen in de vesicles zodat vangen niet de beperkende factor voor de veranderingen in helling bepaald 3.2.9 maar het CFTR-gemedieerde activiteit.
    11. Was de elektrode en roerstaaf grondig met gedeïoniseerd water na behandeling van de monsters met drugs of Triton X-100 te garanderen alle sporen van deze reagentia zijn verwijderd om verontreiniging van het volgende monster te voorkomen.
    12. Bereid een reeks verdunde KI concentraties in het micromolaire tot nanomolaire gebied in buffer 9 (K-Glu buffer, zie Tabel 1). Noteer de mV respons van de elektrode elke concentratie van 0 tot de hoogste concentratie bereid. Teken een standaard curve waarin de probe response (mV) uitgezet tegen log van de molaire concentratie jodide. Gebruik de standaardcurve de mV respons van de sonde zetten tijdens de efflux experiment concentratie jodide vrijgegeven.
      OPMERKING: Bereid een kalibratie curve wekelijks totdat een gebruiker zeker van hoe snel de reactie van de sonde verandert. Er zal een drift in de reactie en gevoeligheid van de probe in de tijd. Omdat de probe ouder wordt, reactie afgebroken. Dit kan gedeeltelijk worden ingetrokken door het veranderen van de interne oplossingen regelmatig en uitgebreid wassen van de sonde in het water na gebruik, die waarschijnlijk grenzen hechting van moleculen aan de sonde oppervlak.
    13. Bepaal de gemiddelde helling van de lijn van de concentratie versus tijdgrafiek per proteoliposoom monster gedurende de laatste 30 seconden vóór toevoeging van MgATP en na toevoeging van valinomycine maar vóór toevoeging van Triton X-100. Aftrekken van de basislijn helling van de valinomycine naar het CFTR-gemedieerde jodide efflux activiteit voor dat monster te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Beschreven in deze schriftelijke publicatie zijn methoden om te zuiveren, te reconstrueren en te meten gereglementeerde kanaal activiteit van het CFTR-eiwit. Figuur 1a toont de workflow voor de zuivering, de bereiding en jodide efflux procedures. Werkwijzen voor de bereiding en kanaalactiviteit metingen via jodide flux zijn ook nader weergegeven in de bijbehorende video.

Zuivering en reconstitutie van CFTR in proteoliposomen

CFTR kan functioneel ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn een beperkt aantal zuiveringsprotocollen volledige lengte, functioneel CFTR afgezonderd, uit verschillende cellulaire overexpressie systemen. De hier beschreven methode is voordelig omdat hiermee snelle zuivering van WT-CFTR of hoog verrijkt F508del- en G551D-CFTR in matige hoeveelheden die zeer functioneel in assays zoals ATPase en directe metingen van kanaalfunctie, waaronder enkel kanaal metingen vlakke dubbellaag systemen en bewezen maatregelen van CFTR bevolking kanaal functie die zeer relevant zijn voor de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs erkennen het advies van Dr. Mohabir Ramjeesingh tijdens de ontwikkeling van de zuiveringsmethoden hier beschreven. Deze studies werden ondersteund door exploitatiesubsidies aan CEB van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) en Cystic Fibrosis Canada (CFC). PDWE werd mede ondersteund door Fellowship awards door de CIHR en CFC. De auteurs erkennen het verstrekken van corrector, potentiator en remmer verbindingen van Dr. R. Bridges (Rosalind Universiteit van Geneeskunde en Wetenschap) en de distributie door de Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT). De auteurs ook een uitstekende service te erkennen door de Baylor Cell Culture Facility (NIH-subsidie ​​P30 CA125123) in het uiten van Wt en gemuteerde CFTR eiwit met behulp van de baculovirussysteem. De inactieve VX-770 analoge, V-09-1188, was een geschenk van Vertex Pharmaceuticals.

Dankbetuigingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
fos-choline 14 detergentAnatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)F312Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-vrije protease inhibitor cocktail tablettenRoche (www.roche-applied-science.com)04 693 132 001EDTA-vrije Protease inhibitor cocktail tabletten (1 in 50 ml of mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-vrij, EASYpack Roche (www.roche-applied-science.com)05 892 791 001
Ni-NTA AgaroseQaigen GmbH1018240
Fisherbrand Screening kolommenFisher Healthcare11-387-50
Amicon Ultra Centrifugaal filters, Ultracel-100KMillipore (www.millipore.com)UFC910008
cAMP-Afhankelijke Proteïne Kinase A (PKA), Katalytische SubunitNew England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)Peirce PKA is ook geschikt
PC, Chicken EggAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)840051C
POPCAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)850457C
PS, Porcine BrainAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)840032CCFTR is succesvol gereconstitueerd in Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, of een mengsel van PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken EggAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)841118C
ErgosterolSigma (www.sigmaaldrich.com)45480
Pierce Detergent verwijdering spin columnThermo Scientific877791 ml capaciteit kolommen
valinomycinSigma (www.sigmaaldrich.com)V-0627
VX-770 (ivacaftor)Selleck ChemicalsS1144
jodide selectieve microelektrodeLazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)LIS-146ICM 
 
 
 
 
 
[header]
Clampex 8.1 softwareAxon Instruments (www.axon.com)we gebruiken componenten van het ClampX systeem met een zelfgemaakte filter om het antwoord op onze elektrode te monitoren en te registreren
Alternatieve Software: ArrowLabb Systeem Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)LIS-146LICM-XSLazar Research verkoopt een meter die kan interfacen met een computer en software om het sondeverloop te registreren.  Deze software zou een soortgelijke functie moeten hebben als onze setup.
kleine roerbarsBig Science Inc (www.stirbars.com)SBM-0502-CMBkies een roerbaar klein genoeg om gemakkelijk in een putje van een 96-well plate te passen
Sephadex G50, fijnGE Health Care (www.gelifesciences.com)17-0042-01
SonicatorLaboratory Supplies Co, Inc.G112SP1GBath sonicators van andere fabrikanten zouden ook geschikt moeten zijn

Referenties

  1. Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
  2. Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
  3. Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
  4. Genetic Analysis Consortium. , http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
  5. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  6. Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
  7. Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
  8. Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
  9. Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
  10. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
  11. Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
  12. Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
  13. Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
  14. Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
  15. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
  16. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
  17. Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
  18. Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
  19. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
  20. Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
  21. Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
  22. Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
  23. Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
  24. Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
  25. Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
  26. Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
  27. Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
  28. Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. , Academic Press. 337-357 (2010).
  29. Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
  30. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
  31. Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
  32. Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
  33. Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
  34. Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
  35. Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
  36. Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Zuivering van CFTR eiwitreconstitutie in proteoliposomenjodideflux assayCFTR kanaalactiviteitwildtype CFTRF508del CFTRG551D CFTRfosforyleringsafhankelijke activatienucleotide regulatiescreening van modulator moleculen

Gerelateerde artikelen