Voorbereiding van de Single-cell Charms voor Cytofluorimetric Analyse van verschillende Mouse Skin Regio

Samenvatting

De huid is de thuisbasis van een complex netwerk van immuuncellen. We beschrijven een efficiënte methodologie voor het verteren van muizenhuid, uit verschillende delen van het lichaam van het dier, om een enkele celsuspensie te verkrijgen en de verschillende leukocytenpopulaties die in de huid aanwezig zijn te analyseren door middel van flowcytometrie.

Samenvatting

De huid is een barrière-orgaan dat interactie heeft met de externe omgeving. Omdat het voortdurend wordt blootgesteld aan mogelijke microbiële invasie, herbergen de dermis en epidermis een verscheidenheid aan immuuncellen in zowel homeostatische als inflammatoire omstandigheden. Hulpmiddelen om huidcelrelease te verkrijgen voor cytofluorimetrische analyses zijn daarom zeer nuttig om het complexe netwerk van immuuncellen dat in de huid verblijft en hun reactie op microbiële stimuli te bestuderen. Hier beschrijven we een efficiënte methodologie voor de vertering van muizenhuid om snel en efficiënt enkele-cel suspensies te verkrijgen. Dit protocol maakt het onderhoud van maximale cellevensvatbaarheid mogelijk zonder de expressie van oppervlakte-antigenen aan te tasten. We beschrijven ook hoe u huidmonsters kunt nemen en verteren van verschillende anatomische locaties, zoals het oor, de romp, de staart en de voetkussen. De verkregen suspensies worden vervolgens gekleurd en geanalyseerd door middel van flowcytometrie om onderscheid te maken tussen verschillende leukocytenpopulaties.

Inleiding

De huid is een van de grootste organen van het lichaam en het grote oppervlak ervan is voortdurend blootgesteld aan de externe omgeving. Daarom moet de huid het organisme beschermen tegen mogelijke bedreigingen om de homeostase te behouden, zowel door fysieke middelen als door actieve bescherming tegen mogelijke binnendringen van pathogenen. Op een vergelijkbare manier als de darm- en longmembraan, herbergt de huid een verscheidenheid aan immuuncellen die voortdurend interageren met het epitheel om immuunbewaking te behouden. Dit complexe systeem dat zowel immuun- als niet-immuuncellen van de huid omvat, is erkend sinds de vroege dagen van de immunologie, toen in 1978 de term "Huid-geassocieerd lymfoïde weefsel" (SALT) ¹ voor het eerst werd bedacht om een dergelijke complexiteit te beschrijven.

Het grote aantal immuuncellen dat in de huid verblijft, helpt het organisme niet alleen om potentiële invasies te bestrijden, maar ook om wondgenezing te coördineren en tolerantie te behouden ten opzichte van zelf-antigenen en de huidmicrobiota ^2,3.

Onder de in de huid residerende immuuncellen spelen dendritische cellen (DC's) een cruciale rol bij het vormgeven van immuunresponsen en het behoud van homeostase ⁴. Dermale DC's en Langerhans-cellen reageren snel op pathogene invasies en activeren, na migratie naar lymfeklieren, T-cellen en induceren de expressie van huid-homeing-receptoren op de nieuw gegenereerde effectieve T-cellen ⁵. DC's spelen ook een fundamentele rol bij het reguleren van huidhomeostase. DC's die in homeostatische omstandigheden van de dermis naar de lymfeklieren migreren, transporteren in het huid opgesloten antigenen met als doel T-celtolerantie te induceren, meestal door de differentiatie van regulatorische T-cellen (Tregs) specifiek voor huidantigenen ^6-8.

T-cellen vertegenwoordigen de meest voorkomende populatie immuuncellen in de huid. Ze infiltreren niet alleen de huid tijdens een infectie, maar vertegenwoordigen ook een stabiele populatie onder de in de huid residerende lymfocyten ^9,10. Zowel CD8⁺ als CD4⁺ residentiegeheugen (rm) T-cellen verblijven in de huid en kunnen, na een infectie, reageren lang voordat effectieve T-cellen uit het bloed worden gerekruteerd. In de huid verblijft ook een populatie van in het weefsel residerende Tregs die in staat zijn tolerantie te behouden ten opzichte van huidantigenen en weefselhomeostase. Deze cellen worden snel en krachtig geactiveerd na blootstelling aan hun cognate antigeen en zijn daarom gedefinieerd als geheugen Tregs ^11,12.

Samen met DC's en T-cellen bevolken veel aangeboren immuuncellen, zoals NK-cellen, gamma delta T-cellen, groep 2 ILC's ¹³, mestcellen en macrofagen de huid en dragen ze bij aan bescherming van de gastheer. Om een dergelijk complex milieu te analyseren, is het verplicht om eencellulaire suspensies van huidspecimens met hoge efficiëntie te verkrijgen, terwijl tegelijkertijd de expressie van oppervlaktemarkers wordt behouden voor flow cytofluorimetrische analyse of sortering.

Muishuid presenteert een buitenste epidermale laag, die voornamelijk bestaat uit keratinocyten, Langerhans-cellen en dendritische epidermale T-cellen; en de dermale laag eronder. De dermis herbergt de meeste immuuncellen en bestaat uit een extracellulaire matrix waarin collageenvezels het meest overvloedig zijn, met name collageen-I en collageen-IV. In tegenstelling tot menselijke huid is muishuid bedekt met vacht en dus meer bevolkt met haarzakjes. Het is ook veel dunner dan menselijke huid en bevat een spierlaag, de panniculus carnosus, die wondgenezing helpt ¹⁴. Deze kenmerken maken het moeilijker om het collageennet van de dermis efficiënt te verstoren om immuuncellen te verkrijgen.

In dit artikel bieden we een geschikte methode voor het verteren van de extracellulaire matrix die vertrouwt op een cocktail van hoogzuivere collageenase 1 en 2 en thermolysine. Bovendien, aangezien de analyse van huid uit verschillende regio's verschillende experimentele procedures vereist, zullen we verschillende methoden laten zien om efficiënt huidmonsters te verkrijgen van de voetkussentjes, staart, oor en romp. We zullen de monsters vervolgens labelen om de aanwezigheid van DC's (MHCII⁺CD11c⁺CD45⁺) Macrofagen (CD11b⁺F4/80⁺CD45⁺), CD8⁺, en CD4⁺ T-cellen te evalueren.

Protocol

Studie goedkeuring: De experimentele protocollen werden door het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid (Rome, Italië) volgens de Decreto goedgekeurde legislativo 27 gennaio 1992 n. 116 "Attuazione della Direttiva n. 86/609 / EEG in materia di protezione degli animali utilizzati een fini sperimentali ad altri fini scientifici."

1. Verkrijgen huidmonsters

1. Euthanaseren de muizen door cervicale dislocatie.
2. Oor:
   1. Knip de haarloze deel van de oren van de muis.
   2. Aparte rug- en buikzijde door ze uit elkaar te trekken met een pincet. Verwijder eventuele kraakbeen door voorzichtig schrapen de binnenkant van de oren met een tang.
3. Trunk huid:
   1. Scheer de hele huid van het dier, beide met een elektrisch scheerapparaat en met delicate ontharingscrème lotion.
   2. Snijd de gewenste sample huid (van 2 cm ² tot en met de hele huid dier).
      1. Als het afsnijden van de gehele rug- en ventraal muis huid, maak een verticale snede in het midden van de muis heen en snijd langs de grenzen van de geschoren gebieden rond de muis lichaam.
      2. Voorzichtig scheiden de huid van het buikvlies en rugspieren, nog steeds houden van de huid monster met de tang terwijl het scheiden van het monster huid met het gesloten rondje kanten tips van een chirurgische schaar of een scalpel.
   3. Bereid een 100 mm celkweek plaat met 10 ml ijskoude PBS.
   4. Elimineer onderhuids vet door onderdompeling van het monster huid in PBS in de plaat bereid in stap 1.3.3 en schrapen het monster huid met een tang.
4. Staart:
   1. Afgesneden van de staart van de muis.
   2. Voeg een verticale snede op de staart van een chirurgische schaar of chirurgische scalpel, vanaf de staartbasis en tot aan de punt van de staart.
   3. Gebruik een tang om de huid van de staart los. Pak de rand van de snede aan de basis van de staart en trek in de richting van de punt terwijl u deorgaan van de staart met een tang.
   4. Verwijder overtollig vet door zachtjes schrapen van de huid monster.
5. struikrover
   1. Knip de hele muis voet met chirurgische schaar. Het vermijden van het snijden van alle behaarde huid.
   2. Snijd de huid van de voet in langsrichting van de enkel naar het begin van de cijfers.
   3. Houd de enkels met een pincet of met de hand, terwijl grijpen de huid met een tang en trek de huid in de richting van de cijfers als het opstijgen een handschoen.

2. Spijsvertering

1. De voorbereiding van de spijsvertering cocktail van de voorraad-oplossing (bereid zoals in Materials List) met het volgende recept: Enzyme mix (zie Materialen List voor specificaties) 300 ug / ml, DNAse1 50 U / ml. Verdund in RPMI 5% FBS.
2. Hak monsters huid met een schaar in kleine stukjes in een 35 mm petrischaal met 2 ml Spijsvertering Cocktail (Voor trunk huid: 2 ml Spijsvertering Cocktail elke 2 cm ² van de huid, tot 3 ml totaal).
3. Incubeer bij 37 ° C gedurende 90 min. Schud de petrischaal 1-2 keer tijdens de incubatie.
4. Pour gedigereerd huidmonsters op een 70 urn zeef in cel 66 mm petrischaal met 1 ml RPMI1640 5% FBS.
5. Was de zeef met 5 ml van RPMI 1640 5% FBS.
6. Knijp het monster door de cel zeef met een zuiger.
7. Flush plunjer petrischaaltje zeef met 20 ml RPMI1640 5% FBS, overbrengen naar 50 ml buis.

3. Antilichamen en Labeling

1. Was de verkregen suspensie tweemaal met 5 ml PBS 1% FBS (of BSA).
2. Label de verkregen celsuspensie met de gewenste antilichamen.
   1. Resuspendeer de monsters in 100 ul / monster van een mengsel dat 2 ug / ml aCD16 / CD32 (kloon 2.4G2) verdund in PBS 1% FBS.
   2. Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C om niet-specifieke binding van de gewenste antilichamen via Fc-receptoren te blokkeren.
   3. Voeg de in tabel antilichamen1.
      1. Bereid een mengsel verdunnen de gewenste antilichamen in 100 ul / monster PBS 1% FBS in een concentratie van 4 ug / ml.
      2. Voeg 100 ul van het mengsel bereid in stap 3.2.3.1 elk monster zodat in de buis, zal een volume van 200 gl antilichaam mix in een eindconcentratie van 2 ug / ml.
   4. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C en dekken tegen licht.
3. Wassen met 1 ml PBS 1% FBS, centrifugeer 5 min bij 400 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer in 300 ul PBS 1% FBS.
4. Voeg DAPI bij een uiteindelijke concentratie van 2 pg / ml en incuberen bij 4 ° C, beschermd tegen licht gedurende 10 minuten.
5. Analyseer de monsters verkregen door FACS.
   1. Om leukocyten te isoleren, gebruikt u de volgende gating strategie:
      1. elimineren eerst alle dode cellen door gating op de DAPI- bevolking.
      2. Selecteer singlets in de FSC-A vs. FSC W plot zoals aangegeven in figuur 1 .
      3. De Poort van de cellen op basis van grootte en granulariteit typisch voor de leukocyten van belang.
      4. Selecteer CD45 + cellen in de FSC-A CD45 grafiek zoals in figuur 1.
   2. Onderscheid de verschillende populaties van leukocyten door de expressie van oppervlaktemarkers als volgt:
      1. Identificeren DCs als CD11c ⁺ MHC II ⁺ cellen. Deze kunnen later worden geanalyseerd op de expressie van CD207 op Langerhanscellen en CD207 + dermale DCs onderscheiden CD207- Dermaal DCs.
      2. Identificeer Macrofagen als CD64 + F4 / 80 + cellen.
      3. B-cellen identificeren als CD19 + MHCII + cellen.
      4. Identificeer T-cellen als CD8 + of CD4 + cellen.

Resultaten

Huid ander gebied van het lichaam werd verteerd volgens de beschreven en gekleurd met de aangegeven antilichamen protocol. De gating strategie is in Figuur 1. Eerst selecteert levende cellen (DAPI- cellen) en poort aan singlets (FSC-A versus FSC-W) en lymfocyt cellen met morfologie (FSC-SSC-A vs. A). Wanneer aangegeven, worden CD45 ⁺ cellen van hematopoietische afkomst geselecteerd.

DCs zijn voorzie...

Discussie

We hebben een werkwijze beschreven voor de bereiding van enkelvoudige celsuspensies van verschillende muizen huidgebieden. De werkwijze van de spijsvertering we hebben aangenomen, geeft niet alleen een hoge opbrengst, maar behoudt ook de expressie van oppervlakte-markers, dat fundamenteel is voor de volgende FACS analyse.

Het gebruik van een cocktail van collagenase I en II en thermolysine, garandeert een minimale charges verschillen in enzymactiviteit maken deze werkwijze zeer reproduceerba...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagenten
Supplemented RPMI 1640 medium			RPMI1640 aangevuld met L-glu, pen-strep zonder beta mercapto ethanol
PBS
FBS
Liberase TM (Enzyme Mix)	Roche	5401119001	opnieuw opgelost [2,5 mg/ml] in dH2O; bewaar aliquots bij -20 °C
Dnase I	Sigma	D4263-1VL	opnieuw opgelost in RPMI 1640 zonder serum [1.000 U/ml]
Materialen
Chirurgische schaar
Chirurgische pincet
Chirurgisch scalpel
35 mm Petri schotels
66 mm Petri schotels
100 mm Petri schotels
70 µm Cell Strainers	BD	352350
Digestiecocktail			Verdun in RPMI 5% FBS
LIberase TM			300 µg/ml
DNAse1			50 U/ml
Antilichamen
Naam	Bedrijf	Kloon	Label
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-Cy7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-Cy7
aCD207		4C7	APC