Functionele en morfologische beoordeling van Diafragma Innervatie door diafragma Motor Neuronen

Samenvatting

De opname van samengestelde spieractiepotentialen beoordeelt kwantitatief de functionele diafragma-innervatie door frenicus motorneuronen. Immunohistochemie van het hele diafragma beoordeelt de morfologische innervatie op individuele neuromusculaire kruispunten. Het doel van dit protocol is om aan te tonen hoe deze twee krachtige methodologieën kunnen worden gebruikt in verschillende knaagdiermodellen van ruggenmergziekte.

Samenvatting

Dit protocol richt zich specifiek op hulpmiddelen voor het beoordelen van de frenicus motorische neuron (PhMN) innervatie van het diafragma op zowel elektrofysiologisch als morfologisch niveau. Opname van samengestelde spieractiepotentiaal (CMAP) na stimulatie van de frenicuszenuw kan worden gebruikt om de functionele diafragma innervatie door PhMN's van het cervicale ruggenmerg in vivo bij geanesthetiseerde ratten en muizen kwantitatief te beoordelen. Omdat CMAP's een gelijktijdige opname vertegenwoordigen van alle myofibers van het hele hemidiafragma, is het nuttig om ook de fenotypes van individuele motorische axonen en myofibers bij de diafragma NMJ te onderzoeken om ziekte- en therapie-relevante morfologische veranderingen zoals gedeeltelijke en volledige denervatie, regeneratieve uitlopervorming en reïnnervatie te volgen. Dit kan worden bereikt via gehele-mount immunohistologie (IHC) van het diafragma, gevolgd door gedetailleerd morfologisch onderzoek van individuele NMJ's door het hele spierweefsel. Het combineren van CMAP's en NMJ-analyse biedt een krachtige benadering voor het kwantitatief bestuderen van diafragma innervatie in knaagdiermodellen van CZS- en PNS-ziekten.

Inleiding

Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) is een slopende motor neuron ziekte die is geassocieerd met het verlies van zowel de bovenste en onderste motorische neuronen en daaropvolgende spierverlamming. Bij de diagnose, overleving van de patiënten gemiddeld slechts 2-5 jaar ^1. Diafragma motor neuron (Phmn) verlies is een cruciaal onderdeel van de pathogenese van ALS. Patiënten uiteindelijk sterven als gevolg van het verlies van Phmn innervatie van het diafragma, de belangrijkste spier van inspiratie ^2,3. Traumatisch ruggenmergletsel (SCI) is ook een ernstig probleem met bijbehorende ademhalingsmoeilijkheden. Ongeveer 12.000 nieuwe gevallen van SCI zich elk jaar ⁴ als gevolg van traumatische beschadiging van het ruggenmerg. Ondanks ziekte heterogeniteit wat locatie, het type en de ernst, de meeste gevallen gaat SCI trauma aan het ruggenmerg, wat vaak leidt tot slopende en persistent respiratoire compromis. Naast ALS en SCI, andere centrale zenuwstelsel (CNS) ziekten geassocieerd wet middenrif respiratoire dysfunctie ^5,6.

Het diafragma zenuw is een efferente motorische zenuw die de ipsilaterale hemi-diafragma innerveert en dat afkomstig is uit Phmn cellichamen zich in het C3-C5 niveaus van de ipsilaterale cervicale ruggenmerg. Phmn uitgang wordt bestuurd door aflopende bulbospinal input van de hersenstam in een gebied dat bekend staat als de rostral ventrale respiratoire groep (rVRG) ^7. De rVRG-Phmn-membraan circuit staat centraal in de controle van inspiratoire ademhaling, en andere niet-beademing membraan gedrag. Diverse traumatische letsels en neurodegeneratieve aandoeningen die deze circuits invloed kan leiden tot een diepe daling van de longfunctie en de patiënt de kwaliteit van leven. Oplopende input voor PhMNs van de rVRG, Phmn overleving, phrenicus integriteit en de goede innervatie bij het middenrif neuromusculaire junctie (NMJ) zijn noodzakelijk voor een normale diafragma-functie. Het is daarom belangrijk om technieken gebruiken diekunnen kwantitatief evalueren van dit circuit in vivo in knaagdiermodellen van ALS, SCI en andere CNS ziekten.

Met dit protocol, het doel is experimentele hulpmiddelen beschrijven voor het beoordelen Phmn innervatie van het diafragma op zowel elektrofysiologische en morfologische niveau. Compound spier actiepotentialen (Cmappen) worden geregistreerd door het stimuleren van alle efferente motor neuron axonen van een bepaalde motorische zenuw en vervolgens analyseren van de uitgelokte depolarisatie reactie van de doelgroep myovezels. Deze techniek kan in vivo in verdoofde ratten en muizen functionele innervatie van de hemi-membraan door PhMNs ⁸ kwantificeren. Vanwege het feit dat Cmappen vertegenwoordigen gelijktijdig opnemen van alle (of althans veel / de meeste) spiervezels van de gehele hemi-membraan, is het nuttig om ook de fenotypen van afzonderlijke motor axonen en spiervezels in het membraan NMJ onderzoeken om ziekte te volgen - en therapie-relevante morfologische veranderingen, zoals gedeeltelijke en complete denervatie, regeneratieve kiemen en reïnnervatie. Dit kan worden bewerkstelligd via whole-mount immunohistochemie (IHC) van het membraan, gevolgd door een gedetailleerde morfologische beoordeling van individuele NMJs gehele spier ^9. De combinatie Cmappen en NMJ analyse biedt een krachtige aanpak voor het kwantitatief bestuderen middenrif innervatie in knaagdiermodellen van de ziekte CNS en PNS.

Protocol

Experimentele procedures werden goedgekeurd door de Thomas Jefferson University institutionele dierlijke zorg en gebruik Comite en uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen Richtlijn (2010/63 / EU, 86/609 / EEG en 87-848 / EEG), de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren, en de Society for Neuroscience Beleid inzake het gebruik van dieren in Neuroscience Research.

1. Compound Muscle actiepotentialen (Cmappen)

1. Voorbereiden van het dier:
   1. Verdoven van de rat met behulp van een inhalatie (isofluraan) op 1-2% geleverd aan-effect of door middel van injectie (ketamine, xylazine, acepromazine). De dosering van injecteerbare verdoving als volgt: 95,0 mg / kg ketamine, 10,0 mg / kg xylazine, 0,075 mg / kg acepromazine.
      LET OP: Wij gebruiken met succes zowel inhalatie en injecteerbare verdoving benadert bij het uitvoeren van deze CMAP opname protocol, zonder voorkeur.
   2. Het dier moet op het juiste een worden gehandhaafdnesthetic diepte voor de operatie wordt begonnen, door het sluiten van de operatie, en tot postoperatieve buprenorfine van kracht is geworden. Bevestig de juiste verdoving door korte teen knijpen om te bepalen dat een terugtrekking reactie niet wordt opgewekt. Bovendien, het testen van de cornea reflex met een wattenstaafje. Gedurende de chirurgische procedure, vaststellen dat de hartslag en de ademhaling niet verhoogd, wat suggereert dat verdoving diepte te licht is geworden.
   3. Breng een dierenarts zalf op de ogen van het dier tot droog te voorkomen tijdens het onder narcose.
   4. De chirurg zou haar wassen / zijn handen met een desinfecterend middel (chloorhexidine scrub) voor het begin van de operatie. De chirurg dient steriele handschoenen, gezichtsmasker, en toga of schone laboratoriumjas dragen. Alle instrumenten moeten worden gewassen en geautoclaveerd voor de operatie. Voeg een sterilisatie indicator strip in het instrument kit voor autoclaveren ter hoogte van de instrumenten om te controleren of sterilisatie is voltooid. De chirurg moetcontroleren of de gehele lijn op de strip is zwart voor het begin van de operatie. Tape de buitenkant van de doos met vermelding van autoclaaf tape ook. Als een operatie moet worden uitgevoerd op verschillende dieren op dezelfde dag, het reinigen van de instrumenten tussen de operaties en steriliseren in een glazen kraal sterilisator. Eventueel steriliseren beide uiteinden van het instrument in de glaskraal sterilisator door het plaatsen van het handvat van het instrument in de sterilisator gedurende de geschikte tijd, het instrument verwijderd met een steriele hemostaat, koelen in een steriele omgeving en plaatsen van het functionele eind het instrument in de glazen kraal sterilisator voor de passende periode.
   5. Zodra dier is verdoofd, kan plaatsvinden op chirurgische bord met dorsale oppervlak naar beneden en de buik naar boven gericht, zodat tape worden gebruikt om de voorpoten dier vast aan chirurgische boord.
   6. Scheren buikoppervlakte caudaal beginnen bij de basis van de schedel, en ervoor zorgen dat het gebied rond de buik aan beide zijden van de middellijn is shAved afhankelijk van hemi-membraan wordt opgenomen. Breng povidonjood het geschoren huidoppervlak.
2. Voorbereiding voor CMAP opnames:
   1. Volgende dierlijke voorbereiding, plaats aardelektrode subcutaan in de staart (Figuur 1).
   2. Plaats de referentie-elektrode subcutaan in de contralaterale onderbuik.
   3. Plaats geleidende gel op zelfklevende oppervlak strip of schijf registratie-elektrode (afmetingen van het oppervlak strip elektrode: 0,5 x 3 cm), en plaats dan oppervlakte elektrode dwars langs de eenzijdige ribbenboog.
   4. Plaats prikkelelektroden transcutaan 0,5 cm uit elkaar lateraal trachea en superieur aan de clavicula. De twee elektroden van ongeveer 1,0 cm diep door de huid. Maak de elektroden van de hand, zodat hun locatie niet beweegt met de daaropvolgende stimuleringen.
      OPMERKING: Hoek prikkelelektroden 90 ° ten opzichte van de huid op de plaats van insertion.
3. Compound Muscle Actie Potential (CMAP) opnames:
   1. Verkrijgen elektrofysiologische opnames met een stimulator / versterker gevolgd door computergestuurde data-analyse.
   2. De stimulans parameters van enkele pull stimulatie moet 0,5 msec, 1,0 Hz supramaximale pulsen. De amplitude van de stimulus moet tussen 6,0 en 8,0 V (Figuur 2A) zijn.
      OPMERKING: Binnen een experiment, gebruik dan een stimulus intensiteit met dezelfde amplitude over dieren. Doel is de responsamplitude maximaliseren met de minimale amplitude van de stimulatie. Het is belangrijk op te merken dat de eerste reactie die optreedt ten tijde van stimulatie is een stimulatie artefact. Voorts dient men een CMAP respons die wordt voorafgegaan door een stabiele / flat basislijn na de stimulatie artefact, die vervolgens wordt gevolgd door de snelle CMAP respons te verkrijgen. Om dergelijke respons te verkrijgen kan het nodig zijn de stimulatie verplaatsen en / ofregistrerende elektroden.
   3. Wacht 30 sec tussen de stimulatie, en herhaal 10 stimulaties in een rij om de gemiddelde respons (Figuur 2B - C) te verkrijgen. Meet de amplitude van baseline tot piek (Figuur 2A). Gedrag phrenicus stimulatie tijdens de fase van de cyclus van het dier luchtwegen wanneer de diafragma zenuw / diafragma niet is geactiveerd. De procedure kan worden herhaald op hetzelfde dier voor contralaterale hemi-membraan.
   4. Na de laatste CMAP opnamesessie, perfuseren het dier als NMJ kleuring zal worden uitgevoerd. Voer CMAP opnamen telkens op hetzelfde dier ongeveer eens per week (of interval van keuze).
   5. Na survival CMAP opnames, laat dier te herstellen op een circulerende warm water verwarming pad, en continu bewaken tijdens het herstel tot wakker en sternally ligfiets. Heeft een dier dat een operatie om het gezelschap van andere dieren heeft ondergaan totdat volledig hersteld niet meer terug.
   6. Eenmaal sternally ligfiets, bewaken het dier elke 12 uur voor de eerste 48 uur (eenmaal daags daarna). Indien het dier blijkt gedehydrateerde (slappe huid, lusteloosheid) zijn, dienen vloeistoffen (lactaat Ringers oplossing, subcutaan, 1-2 ml per injectie, waarbij de locaties geroteerd, 2 maal per dag) tot postoperatieve gewicht en vloeistofverlies stabiliseert. Zorg voor dieren met een zacht voedsel in kleine gerechten tijdens de acute post-operatieve periode indien nodig aan te moedigen eten als ze de draad bar deksel feeder niet kunnen bereiken.
   7. Dien buprenorfine in een dosis van 0,05 mg / kg voor het einde van de operatie en daarna bij 12 uur gedurende de eerste 24 uur (en afhankelijk van tekenen van pijn / spanning daarna) via subcutane injectie (site gedraaid). Als tekenen van pijn of benauwdheid daarna zijn opgevallen, behandel dieren met buprenorfine. Tekenen indicatief pijn / distress onder gebrek aan activiteit, geluiden, gebrek aan eten of drinken (uitdroging), overmatig gewichtsverlies, het bewaken, excessive knagen of krassen op de site van de incisie. Aanvullende criteria gebruikt bij het bepalen van pijn en verdriet onder ongevoeligheid aan uitwendige prikkels, voorbijgaande of niet-uitgelokte stemgebruik, moeizame of abnormale ademhaling, aanhoudende roodbruine neus-occular ontlading, gemarkeerd piloerectie. Ook controleren bewijs van slechte hygiëne die zieke dieren zou suggereren. Als dier nog steeds waargenomen in nood na 72 uur behandeling (volgens de pijn / spanning criteria aangeven hierboven en na het analgetische hierboven beschreven protocol) inslapen het dier.

2. Membraan Neuromusculaire Junction (NMJ) Analyse

1. Animal dissectie:
   1. Dien het dier een overdosis injecteerbare anesthesie (3 maal dosis bovenstaande gebruikte: ketamine bij 285,0 mg / kg xylazine op 30,0 mg / kg, acepromazine op 0,225 mg / kg, intraperitoneaal). Na een overdosis, moeten alle dieren een tweede methode van euthanasie (thoracotomie) hebben to zorgen voor de dood. De dood moet worden bevestigd door het observeren van hart- en ademstilstand en door op te merken vaste en verwijde pupillen van het dier.
   2. Voer een laparotomie met scalpel of dissectie schaar verlengen van de uitsnijding van de zyphoid proces caudaal langs de middellijn. Zorgvuldig scheiden de huid en het bindweefsel van het onderliggende spier met behulp van scalpel en pincet.
   3. Terwijl omhoog te trekken op de zyphoid proces, gebruiken dissectie schaar om hele membraan te verwijderen, zodat het diafragma blijft gehecht aan omliggende bot. Dit is belangrijk omdat beschadiging van de middenrifspier voorkomt, zal zorgen voor een succesvolle dissectie van het gehele membraan en zal helpen bij het reinigen spieren voor daaropvolgende kleuring.
      NB: Op dit punt, kan dier worden geperfuseerd indien nodig.
2. Reiniging en kleuring van het membraan:
   1. Vastpinnen het hele ontleed middenrif, superieure oppervlak naar boven, om siliconen rubber in een glas van 100 mm petrischaal in4% paraformaldehyde (in 1% met fosfaat gebufferde zoutoplossing - PBS) gedurende 20 min onder toepassing van een stereomicroscoop. Rek het membraan om het strak maken en gebruiken insect pennen, pinnen het omringende weefsel te vermijden pinning de middenrifspier zelf (figuur 3).
   2. Reinig voorzichtig bindweefsel van alleen de superieure oppervlak van de spier met # 5 pincet en een klein schaartje.
      OPMERKING: Voer alle volgende stappen van deze kleuringsprotocol langzaam schommelen bij kamertemperatuur gedekt uit licht, tenzij anders aangegeven. Zorg ervoor dat het middenrif spier wordt altijd volledig ondergedompeld in een vloeistof om uitdroging te vermijden uit.
   3. Voorafgaand aan kleuring bereiden nodige reagentia: 1 x PBS, 2% runderserumalbumine (BSA) / PBS, 0,1 M glycine in 2% BSA / PBS, 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS en 0,2% TBP (0,2 % Triton X100 in 2% BSA / PBS). Zorg ervoor dat u pre-cool methanol bij -20 ° C.
   4. Was 3 x gedurende 10 minuten in 1 x PBS.
   5. Incubeer in 0,1 M glycine (in 2% BSA / PBS) gedurende 30 min.
   6. Incubeer in RBTX (rhodamine geconjugeerde α-bungarotoxine) oplossing gedurende 15 min. Oplossing voor RBTX is als volgt: Rhodamine-geconjugeerde alfa-bungarotoxine 1: 400 verdunning in 1 x PBS.
      Opmerking: In dit protocol, Rhodamine wordt gebruikt, maar iedere fluorofoor naar keuze kan worden gebruikt voor kleuring.
   7. Was 3 x gedurende 10 minuten in 1 x PBS.
   8. Bij -20 ° C diepvriezer, incubeer met MeOH gedurende 5 min.
      OPMERKING: Weet MeOH niet toevoegen voordat u de spieren in de vriezer, en onmiddellijk te verwijderen oplossing na de incubatietijd.
   9. Was 3 x gedurende 10 minuten in 1 x PBS.
   10. Block in 0,2% TBP gedurende 1 uur (0,2% Triton in 2% BSA / PBS).
   11. Incubeer met primaire antilichaamoplossing (in 0,2% TBP) bij 4 ° C gedurende de nacht terwijl schommelen. Verdunningen van antilichamen als volgt: SV2 (01:10) en SMI-312 (1: 1000).
   12. Was 3x 10 min met 0,2% TBP.
   13. Incubeer met secundaire antilichamen gebruikt 1: 100 verdunning van FGM1 (FITC-geconjugeerd geit anti-muis IgG1; in 0,2% TBP), terwijl schommelen gedurende 1 uur.
       OPMERKING: Beschermen tegen licht voor de rest van het protocol voor vlekken.
   14. Was 3x gedurende 10 min met 1x PBS.
   15. Re-clean omliggende bindweefsel op de superieure (zie boven) oppervlak van de spieren voorafgaand aan de montage en afdekken.
       NB: Het is aanbevolen om schoon te maken en vervolgens direct monteren monster na kleuring. Indien nodig, monster worden behandeld in 1x PBS, omwikkeld met parafilm om verdamping te voorkomen en bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week, wisselende PBS per dag.
   16. Bij montage op glasplaatje, dekglaasje met niet-hardset Vectashield. Seal randen van dekglaasje met duidelijke nagellak om uitdroging te voorkomen. Store dia's plat in mappen karton dia in -20 ° C voor de lange termijn.
3. Analyse en Confocal Imaging:
   1. Kwantitatief analyseren de morfologie van de gekleurde en gemonteerd hemi-membraan onder 20x en 40x vergroting van het gebruik van een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop.
      OPMERKING: Omdat het membraan wordt gekleurd en in een geheel-mount manier geanalyseerd, de spier is vrij dik. Bijgevolg meeste fluorescentie kleuring helemaal onscherp wanneer een stilstaand beeld wordt gemaakt met behulp van niet-confocale fluorescentiemicroscopie. Daarom is het het beste om de NMJ analyse in real-time de microscoop te voeren zoals dit laat een continu concentreren "omhoog" en "omlaag" door de spier aangeven welke morfologie van elk van de afzonderlijke NMJs. Met deze aanpak kan men gemakkelijk volgen de beweging van de individuele motor axonen terwijl ze door het weefsel in ruimtelijke relatie met de postsynaptische receptor clusters.
   2. Door het meten van de ventrale naar dorsale lengte van de spier, verdelen de spier in 3 afzonderlijke secties voor analyse op basis van topografische innervatie patronen van specifieke ruggenmerg niveaus (Figuur 4H).
   3. Beginnend bij het ventrale gebied van de spier en moving dorsaal, analyseren allemaal een eigen gezicht NMJs gelegen op het oppervlak van spiervezels. Niet analyse spiervezels dieper dan de eerste 3-4 vezels uit het oppervlak uitlegging moeilijk kan zijn vanwege slechtere antilichaam penetratie (RBTX dringt dieper in de spier als gevolg van de kleine omvang van het toxine vergeleken met de grotere antilichamen die labelen neuronen).
   4. Duid elke NMJ intact als de pre-eindstandige axon van het neuron is dik in diameter en alle gebieden van het zenuwuiteinde volledig overlappen met de onderliggende spier acetylcholinereceptoren (AChR).
   5. Identificeer elke NMJ als gedeeltelijk gedenerveerde als een gebied van de onderliggende spier AChRs onbezet is met bijbehorende zenuwuiteinde.
   6. Duid elke NMJ zo volledig als gedenerveerde spier AChRs niet corresponderen zenuwuiteinde (het is ook belangrijk om andere NMJs met gemerkte neuronen in hetzelfde gebied van focus, zodat men zeker dat gebrek aan zenuwuiteinde niet alleen wegens poor antilichaam penetratie in die regio van de spier).
   7. Identificeer elke NMJ als vermenigvuldigen geïnnerveerd als er meer dan een pre-terminal axon innerveren een individuele NMJ (dit geeft aan dat er een zekere mate van denervatie en waarschijnlijk pogingen van reïnnervatie is geweest op dit kruispunt).
   8. Duid elke NMJ zo dun geïnnerveerd als de NMJ heeft volledige overlap tussen zenuwuiteinde en onderliggende AChRs, maar een dunne preterminaal axon (dit is ook indicatief voor een zekere mate van denervatie en pogingen tot reïnnervatie).
   9. Analyse verricht voor elk van de 3 geïdentificeerde gebieden voor alle hierboven NMJ categorieën voor elk dier. Het gemiddelde van de gegevens van elk dier met resultaten van andere dieren uit dezelfde experimentele groep. Ongeveer 200-300 knooppunten in rat hemi-middenrif spieren en 150-200 in de muis hemi-diafragma moet worden gekwantificeerd in ten minste 3 (bij voorkeur 5-6 of meer) dieren per experimentele groep.
   10. Verkrijgen van hoge-resolutie confocale beelden, gebruikd voor publicatie, met een confocale microscoop.
   11. Verkrijgen Z-stacks 0,3 urn stapgrootte van 20-40 urn diepte, en laat andere optische secties boven en onder elk knooppunt zodat de gehele synaptische profiel is opgenomen.
   12. Gebruik acquisitie software om z-serie beelden te reconstrueren in maximale intensiteit projecties.

Resultaten

Volwassen Sprague-Dawley-ratten kregen ofwel laminectomie alleen (niet gewonde controle) of unilaterale hemi-contusie SCI bij de C4 ruggenmerg level ^10-12. Op 5 weken na de operatie, opgenomen piek CMAP amplitude van de hemi-diafragma ipsilateraal aan de laminectomie / letsel plaats werd in SCI ratten (figuur 2C) aanzienlijk verminderd in vergelijking met slechts-laminectomie controle (Figuur 2B). Alle NMJs in de hemi-membraan waren volledig intact in control niet zieke wildt...

Discussie

Als ademhaling is aangetast in zowel traumatische SCI en ALS, het ontwikkelen van therapieën die de ademhaling en in het bijzonder het middenrif innervatie richten zijn klinisch relevant ^5,6. Om uitvoerig bestuderen respiratoire functie, moet een gecombineerde aanpak methode worden gebruikt. Cmappen meten de mate van functionele innervatie van het membraan door middel van externe phrenic zenuwstimulatie, maar niet endogene bulbospinal luchtwegen schijf ^8. Bovendien hebben deze opnamen niet mogelijk...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Paraformaldehyde	Fisher	T353-500	Maak eerst een 10% oplossing in gedeïoniseerd gedistilleerd water; maak 4% met 1x PBS, pas pH aan tot 7,4
1x Phosphate buffered saline, pH 7,4	Invitrogen	10010049
2% Bovine serum albumin (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Los 2 g BSA op in 100 ml van 1x PBS
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (blocking buffer)	Sigma-Aldrich	T9284-100mL	Los 0.2 ml/100 ml 2% BSA/PBS op
0.1 M Glycine	Sigma-Aldrich	G-7126	Voeg 0.185 g toe aan 25 ml van 2% BSA/PBS
α-bungarotoxin	Invitrogen	T1175	Concentratie 1:400
SMI-312	Sternberger Monoclonals	SMI312	Concentratie 1:1.000
SV2	Developmental Studies Hybridoma Bank	SV2-Supernatant	Concentratie 1:10
FITC goat anti-mouse IgG1	Roche	3117731001	Concentratie 1:100
Silicone rubber	Sylgard, Dow Corning	Part # 184	Volg de instructies die bij het kit horen: kan meerdere maten kweekschaaltjes gebruiken (30 mm, 60 mm, 100 mm) afhankelijk van de behoeften
Vectashield fluorescent mounting medium	Vector laboratories	H-1000	Dit is geen hard-set medium. Je zult de dekglas moeten vastzetten met doorzichtige nagellak.
Kleine veerscharen	Fine Science Tools	15002-08
Dissectietang	Fine Science Tools	11295-51
Software voor CMAP opnames	Scope 3.5.6; ADI
Diskoppervlakte elektroden	Natus neurology	019-409000
Subdermale naaldelektroden	Natus neurology	019-453100
Geleidend gel	Aquasonic	122-73720
Stimulator/opnamesysteem voor CMAP opnames	ADI Powerlab 8SP stimulator
Versterker voor CMAP opnames	BioAMP