Methodenartikel

Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen

DOI:

10.3791/52607

⸱

24 maart 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine III, RWTH University-Hospital Aachen, 2IZKF Aachen Core Facility "Two-Photon Imaging", RWTH University-Hospital Aachen, 3Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery, RWTH Aachen University, 4Institute for Pharmacology, RWTH University-Hospital Aachen

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het is een uitdaging om stabiele, intravitale, hoogwaardige beelden van immuuncellen in de lever te maken. Hier bieden we een zeer gevoelige en betrouwbare methode om migratie en cel-cel-interacties van immuuncellen in de muizenlever gedurende langere perioden (ongeveer 6 uur) te bestuderen door middel van intravitale multifoton laser scanning microscopie in combinatie met intensieve zorg monitoring.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lever ontsteking als reactie op letsel is een zeer dynamisch proces dat de infiltratie van verschillende subtypen van leukocyten, waaronder monocyten, neutrofielen, T-cel subsets, B-cellen, natuurlijke killer (NK) en NKT cellen. Intravitale microscopie van de lever toezicht immuun celmigratie is een bijzondere uitdaging vanwege de hoge eisen met betrekking monstervoorbereiding en fixatie, optische resolutie en langdurige dieroverleving. Toch kon de dynamiek van inflammatoire processen, alsmede cellulaire interactie onderzoeken kritische informatie om beter te begrijpen de initiatie, progressie en regressie van inflammatoire leverziekte bieden. Daarom werd een zeer gevoelige en betrouwbare methode vastgesteld migratie en cel-cel-interacties van andere immuuncellen in muizenlever gedurende lange perioden (ongeveer 6 uur) door intravitale twee-foton laser scanning microscopie (TPLSM) studie in combinatie met intensive care monitoring. ent "> Werkwijze ontvangen omvat een zachte preparaat en stabiele fixatie van de lever met minimale verstoring van het orgaan en lange termijn intravitale beeldvorming met multicolor multifoton microscopie met vrijwel geen fotobleken en fototoxische effecten gedurende een periode van maximaal 6 uur, waardoor volgen van specifieke leukocyten subsets en stabiele beeldvorming omstandigheden te wijten aan een uitgebreide controle van de muis vitale parameters en stabilisatie van het verkeer, de temperatuur en de gasuitwisseling.

Om lymfocytenmigratie op leverontsteking onderzoeken CXCR6.gfp knock-in muizen werden onderworpen aan intravitale leverbeeldvorming onder basisomstandigheden en na acute en chronische leverschade geïnduceerd door intraperitoneale injectie (s) van koolstoftetrachloride (CCl4).

CXCR6 is een chemokine receptor expressie op lymfocyten, voornamelijk Killer Natural T (NKT) -, Natural Killer (NK) - en subsets van T-lymfocyten zoals CD4 T-cellen maar ook mucosale Associated invariante (MAIT) T-cellen 1. Naar aanleiding van de trekkende patroon en de positionering van CXCR6.gfp + immuuncellen toegestaan ​​een gedetailleerd inzicht in hun veranderde gedrag op leverschade en dus hun mogelijke betrokkenheid bij progressie van de ziekte.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De visualisatie van cellen en cellulaire functies geheel organen of zelfs hele organismen is van groot belang voor meer dan 50 jaar, waaronder vrijwel alle delen van het lichaam 2. Daarom zijn sommige vroege studies reeds in dienst intravitale beeldvorming van de lever 3,4. Echter, een aantal beperkingen bestaan ​​op de hoogte over de lange termijn een stabiele hoge-resolutie beeldvorming van leverweefsel.

Door de anatomische positie van de lever in nauw contact met het membraan en het maagdarmkanaal 5, het meest voorkomende probleem voor microscopische beeldvorming intravitale beweging door ademhaling en, in mindere mate, peristaltische van het darmkanaal 6. In vergelijking met andere vaste organen, lever chirurgie is een bijzondere uitdaging. Vanwege de dichte microvasculaire structuur, kan chirurgische manipulatie leiden tot massale hemorragische laesies, verminderde microcirculatie 7 en ook de activering van de ingezeten immune cellen zoals Kupffercellen 8. Daarom mechanische fixatie van het weefsel zoals elders gepubliceerd 6,9 waarschijnlijk interfereren met het opklaren beeldvorming.

In een gezonde lever, 10-15% van het totale bloedvolume bevindt in de lever vaatstelsel en het orgaan ontvangt ongeveer 25% van de totale hartminuutvolume 10, waardoor het orgaan zeer gevoelig voor veranderingen in de bloedsomloop (bijv bloeddrukschommelingen ). Daarom zal storingen in de doorbloeding van de lever als gevolg van bv, shear stress, verplaatsing, verwondingen door overmatige weefsel behandeling of gecentraliseerde circulatie leiden tot kunstmatige veranderingen in leukocyten trekgedrag, verminderde lever- zuurstofvoorziening en daarom verdere beschadiging van de lever, waardoor de lever immuunreacties alsook als orgaanpreservatie en totale levensduur van het dier.

Vroege microscopisch werden gebaseerd op intravitale epifluorescentie microscopy, maar een aantal technische beperkingen, zoals foto bleken en indringdiepte laag beperk het gebruik van deze techniek voor de lange termijn lever beeldvorming 4,11,12. Met de ontwikkeling van multifoton microscopie in de jaren 1990 werden de beperkingen van foto bleken of indringdiepte hoofdzakelijk opgelost omdat deze nieuwe methode technisch staat om imaging studies uitgevoerd in vrijwel alle organen in reële situaties 13-15. De belangrijkste resterende problemen inzake leverbeeldvorming waren: ademhaling bewegingen, autofluorescentie van leverweefsel, vastzetten ongewijzigd bloedstroom in de lever sinusoïden, en vooral stabiele beeldvorming voor langere perioden van enkele hr 16.

Hoewel verschillende studies ingegaan op de functie en de migratie van diverse leukocyten in de lever 17, bijvoorbeeld, NKT-cellen 18-20, T-cellen 21,22, lever macrofagen 23,24 of neutrofielen 25, op lange termijn multifoton microscopy imaging nog niet tot stand is gebracht, een taak nog moeilijker bij dieren met acute of chronische leverziekte door de bestaande schade en derhalve hogere gevoeligheid voor verdere schade 26. Echter, monitoring trekgedrag en cellulaire functie van leukocyten in de lever in real time mogelijk maakt nieuwe inzichten in hun specifieke rol in de lever homeostase en ziekte 27.

De chemokine receptor CXCR6 wordt uitgedrukt op verschillende lymfocyten en natuurlijke killer (NK) cellen, NKT-cellen en een aantal T-celpopulaties 18,28. Voorafgaande studies bij muizen hebben aangetoond dat CXCR6 en zijn verwante ligand CXCL16 het patrouilleren van NKT cellen kunnen controleren op de lever sinusoïden tijdens homeostase. Bijgevolg heeft het gebruik van CXCR6.gfp muizen (die een knock-in groen fluorescerend eiwit [gfp] in de CXCR6 locus) beschreven de migratie van lymfocyten onderzocht in diverse organen zoals hersenen 29alsmede lever 18,20, met verhoogde infiltratie van CXCR6.gfp cellen na ontsteking.

Met de in deze studie methode was het mogelijk deze processen gedurende een lange periode onder stabiele omstandigheden te volgen. De intravitale multifoton gebaseerde procedure toegestaan ​​beeldvorming die zeer reproduceerbaar met minimale verstoring van het dier en het orgel was; geoptimaliseerd voor de lange termijn dier overleven door een uitgebreide controle, gevolgd door een nauwgezette controle van de ademhaling en de bloedsomloop; en zeer flexibel en gemakkelijk te nemen ook andere parenchymale organen zoals nieren en milt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wetgeving inzake dierproeven na de 'Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren' (NIH publicatie, 8e editie, 2011) en de Richtlijn 2010/63 / EU betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden (Publicatieblad van de Europese Unie, 2010). Officieel toestemming is verleend uit de gouvernementele dier zorg en gebruik op kantoor (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Duitsland).

OPMERKING: Stappen die kan worden weggelaten voor de korte termijn beeldvorming (bv snap shots, 3-D stapels of ook korte duur time-lapse microscopie) zijn gemarkeerd met een sterretje (*) aan voorbereidingstijd te verminderen en de chirurgische protocol te vereenvoudigen. Visualisatie kan ook worden uitgevoerd zonder uitgebreide bewaking en controle circulatie eventueel echter overlevingstijd wordt aanmerkelijk verminderd.

1. Microscoop Setup en Pre-operatie Voorbereiding (5-10 min)

  1. Switch systeem op (microscoop, macht Lab, laser, verwarming pad, klimaatkamer, webcam, injectiepomp apparaat, gasmasker).
  2. Sluit O 2 levering aan Isoflurane Vapor en stel Isoflurane niveau tot 1,5 Vol% (v / v), aan te sluiten op een klein dier gasmasker.
    1. Voor de korte termijn beeldvorming, onderhouden van de anesthesie met behulp van isofluraan pas na de eerste ip anesthesie inductie (zie stap 2.2). Maak dan gebruik van 2 Vol% (v / v) Isoflurane, en houden de beeldvorming tijd onder de 2 uur tot stabiele lever microcirculatie garanderen.
  3. Stel ademhaling tot ademhaling 120-140 cycli / min met een volume van 150-200 gl.
  4. Opgezet muis agarose podium. Maak 100 ml 3% (w / v) agarose, gieten in een schaal (ongeveer 10 cm x 15 cm base) in een hoek van 40 °.
  5. Opgezet chirurgische werkgebied het verzamelen van de benodigde instrumenten. Om microbiële infectie te voorkomen, desinfecteren instrumenten met een 1% -oplossing van Sekusept Forte S (9,9% w / v) Glutaral 9,8% w / v, Formaldehyde gedurende 5 minuten voor het experiment (figuur 1A).
  6. Verkrijgen overige bestanddelen: huiddesinfectans (bijvoorbeeld 10% povidon-joodoplossing), lever fase (stacks en bruggen), agarose oplossing (3% (w / v) in PBS), spuitpomp met 5% (w / v) glucoseoplossing (G-5), spuitpomp met anestheticum I (ketamine 0,1 mg / ml, xylazine 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 ug / ml), wattenstaafjes, n-butyl-2-Cyanoacrylat en 1x PBS. Zet agarose stadium gerecht in incubatiekamer voor het voorverwarmen.

2. tracheotomie (10-15 min)

  1. Gebruik C57BL / 6 muizen uit in het huis van de fokkerij met een gewicht van 25-28 g. Het huis van de muizen onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden in overeenstemming met de FELASA richtlijnen, in een temperatuur- en luchtvochtigheid gecontroleerde omgeving met een 12 uur licht / 12 uur donker cyclus. Toestaan ​​dat dieren vrije toegang tot standaard muizen dieet (Sniff Standard knaagdierendieet) en water ad libitum.
  2. Verdoven van de muis door initial intraperitoneale (ip) injectie van 250 ui van anestheticum II (ketamine 0,1 mg / ml, xylazine 1 mg / ml, Buprenorfine 10 ug / ml).
    1. * Voor onderhoud tijdens intravitale beeldvorming voortdurend anestheticum I toedienen via continue ip injectie (ketamine 0,1 mg / ml, xylazine 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 ug / ml) met een spuit pompinrichting met een stroomsnelheid van 0,2 ml / uur in combinatie met inhalatief isofluraan 0,5 vol% (v / v).
    2. Controleer reflexen na 5 min (bijv knijpvoet pad met een pincet), ontsmet de huid voor tracheotomie, start de voorbereiding als de muis is in chirurgische tolerant anesthesie staat.
    3. Solliciteer eye beschermende crème (bv Dexpanthenol 50 mg / g) aan het hoornvlies uitdroogt (Figuur 1B).
  3. Fixeren muis op de voorbereiding tafel bloot buikzijde met plakband voor de extremiteiten; zacht uitrekken hals, fixeren in deze positie, bijv. door middel van een rubberen band verslaafd to de snijtanden.
    1. Ontsmet de huid en vacht met behulp van povidonjood-oplossing, door het aanbrengen van een ontsmettingsmiddel met een wattenstaafje.
  4. Voeren initiële huid gesneden (0,5-1 cm lengte) direct onder de kin (figuur 1C)
    1. Ontleden bindweefsel tussen de speekselklieren (figuur 1D) voorzichtig.
    2. Openscheuren spierbuis omliggende luchtpijp (figuur 1E, F) voorzichtig.
  5. Plaats chirurgische draad onder de luchtpijp voor later ventilatiebuis fixatie (figuur 1G).
    1. Open luchtpijp met micro-schaar tussen kraakbeen ringen uitvoeren van een T-vormige insnijding (Figuur 1H)
  6. Plaats ventilatiebuis in luchtpijp door de incisie (-0,5 cm). Aan de buis naar voren te duwen, grijpen caudale einde met kleine anatomische pincet en voorzichtig vooruit de buis in de luchtpijp (Figuur 1I)
  7. Fixeer buis met chirurgische draad (bv , 5-0) met schroefdraad geplaatst in Stap 2.5 koppelverkoop een knoop rond buis in de luchtpijp; presteren tweede craniale fixatie van de buis op de huid om toevallige depositioning (Figuur 1J, K) te vermijden.
  8. Verbinding gesneden met weefsellijm (bijvoorbeeld n-butyl-2-Cyanoacrylat) (Figuur 1L).
  9. Fixeer buis op het hoofd met behulp van plakband.

3. laparotomie (15-20 min)

  1. Plaats de muis op de verwarming pad om onderkoeling te voorkomen. Scheren buik, verwijder voorzichtig het haar uit de huid. Ontsmet geschoren huid en vacht met behulp van povidonjood-oplossing.
  2. Voer een kleine huid onder het borstbeen met behulp van chirurgische schaar (Figuur 2A) te snijden. Verleng de snede zijdelings onder de ribben aan beide kanten, alle zichtbare bloedvaten dichtschroeien om het bloeden te voorkomen.
  3. Voeren voorzichtig een klein sneetje in de linea alba onder het borstbeen, het openen van het buikvlies (Figuur 2B). Verleng de cut om beide kanten met behulp cauterizatie tot bloeden (figuur 2C, D) te voorkomen.
  4. Plaats de muis in agarose stadium schaal (figuur 2E). Plaats stapels geschikte hoogte aan beide zijden van de muis (meestal 12-14 dekglaasjes) (figuur 2F).
  5. Plaats respiratoire triggersensor eronder bovenrug om de microscoop met de ademhaling te synchroniseren. Activeer trigger-eenheid (figuur 2G).
  6. Plaats chirurgische draad (5-0) door het borstbeen ribben (figuur 2I) in te trekken.
  7. Knip ligament verbinden lever en middenrif (falciform ligament) en lever en het maag-darmkanaal met gekromde chirurgische schaar. Snijd de falciform ligament tot in de aorta (Figuur 2J).

4. Steekproef Setup (10-15 min)

  1. Plaats muis naar de rechterkant met een hoek van 45 ° voor gemakkelijke toegang tot grote lever kwab.
  2. Voeg enscenering brug onder de ribben, die de buikholte. Vervaardigen van een brug met behulp van een standaard dekglas met plakband coating om scherpe randen (figuur 2K) te dekken.
  3. Plaats grote lever kwab op het podium. Zorgvuldig slip dubbele bal stylus sonde of een gewatteerde spatel onder de lever en houd de bovenkant van het orgel met een nat wattenstaafje of nat weefsel. Til kwab op de glijbaan en zachtjes te slepen. Kwab kan worden gebogen of gevouwen. Voorzie extra zorg slechts zachte manipulatie van de lever (Figuur 2L).
  4. Plaats laterale ondersteuning staken, bijvoorbeeld stapels kleine dekglaasjes (20 mm x 20 mm), ongeveer dezelfde hoogte van de lever kwab ernaast om dekglas ondersteunen.
  5. Plaats grote dekglas (24 mm x 50 mm) op de lever kwab. Zorg ervoor dat dekglas is gericht zoveel mogelijk horizontaal (figuur 2M).
    OPMERKING: Het dekglas moet in contact met het weefsel zonder erin te knijpen. Controleer op zichtbare tekenen van verminderde doorbloeding (wit weefsel). Als Microcircning wordt verstoord, voeg verdere ondersteuning van inzet.
  6. * Plaats twee onafhankelijke intraperitoneale katheters (Figuur 2 N) voor de lange termijn anesthesie en G-5 toepassing. Installeer katheters zijdelings in de onderbuik naast de achterste ledematen.
    OPMERKING: De intraperitoneale katheters zelfgemaakte door verbinding 27 G naalden met flexibele siliconen buis (figuur 3) zijn.
  7. * Fixeer de naald met een lus van 5-0 chirurgische draad aan de huid om onbedoelde verplaatsing te voorkomen.
  8. * Bevestig de spuit pomp met verdoving oplossing die ik tot katheter 1, ingesteld debiet tot 0,2 ml / uur; hechten spuit pomp met G-5 tot katheter 2, ingesteld debiet tot 0,1 ml / uur.

5. Mouse Monitoring

  1. * Plaats ECG-elektroden in de voorste en achterste ledematen (figuur 4A).
  2. * Bevestig verstrijken slang aan op 2-niveau sensor co.
  3. Voeg externe temperatuursensor aangesloten op warmte-pad (Figuur 4C).

6. Inbedding en fixatie van het weefsel (5-10 min)

  1. Maak 100 ml 3% (w / v) agarosegel in 1 x PBS. Insluiten lever wanneer de temperatuur bij 41 ° C met een 5 ml spuit en een 18 G naald (figuur 5A).
  2. Giet resterende agarose op dekglaasje en rond de muis (Figuur 5B, C). Wacht tot agarose volledig is ontsloten.
  3. Verwijder overtollig agarose met de Heidemann spatel bereiden van een Viewfield groot genoeg om de bereide lever kwab (Figuur 5D, E) scannen.

7. Imaging

  1. Breng de muis naar microscoop klimaatkamer.
  2. Voeg 50-100 ml 1x PBS (voorverwarmd op 37 ° C).
  3. Dek de schaal voor monsters om te voorkomen dat de verdamping (Figuur 5F).
  4. * Aantal inhalatief isofluraan 0,5 vol% (v / v).
  5. * Start monitoring software, opname ECG, hartslag en expiratoire CO2.
  6. Start beeldvorming: openen laser rolluiken, identificeren uitzicht aandachtsgebieden, te definiëren bovenste en onderste grens voor Z-stacks, en start time lapse-opname. Bijstellen Z-stacks zo nodig Z-drift corrigeren (bijv. Als gevolg van veranderingen in bloeddruk of temperatuurschommeling figuur (5G).
    OPMERKING: Na voltooiing van de beeldvormende periode of wanneer de circulatie of verdoving van de dieren instabiel, offeren muizen door cervicale dislocatie (zonder ontwaken uit de anesthesie).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om onze intravitale TPLSM benadering te valideren, we onderworpen CXCR6 GFP / + muizen om intravitale TPLSM beeldvorming. Muizen werden ofwel onbehandeld als basislijn controles of onderworpen aan een enkele intraperitoneale injectie van tetrachloorkoolstof (CCl 4) om acute leverschade 20 induceren.

Video sequenties werden genomen over een periode van 2-5 uur, en cellen werden getraceerd tijd vanwege hun groene fluorescentie. Om algemene cellulaire beweeglijk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van onze studie was een zeer gestandaardiseerde, stabiele en reproduceerbare werkwijze voor intravitale TPLSM beeldvorming van de lever ontwikkelen. Intravitale beeldvorming in het algemeen heeft waardevolle inzichten in cellulaire gedrag onder real life omstandigheden volgende homing en interactie van verschillende leukocyten bevolkingsgroepen in ontwikkeling, homeostase en ziekte gegeven. De bosweg anatomische positie van de lever, waardoor respiratoire en intestinale peristaltische beweging direct worden doo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken de Centrale Dierfaciliteit van het Universitair Ziekenhuis Aken voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) en door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) Aken. Dit werk werd verder ondersteund door de Kernfaciliteit ”Two-Photon Imaging”, een Kernfaciliteit van het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) Aken binnen de Faculteit Geneeskunde van de RWTH Aken Universiteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anesthetics
BuprenorfineEssex Pharma997.00.00Analgeticum, 0.1 mg/kg
FentanylRotex Medicacharge: 30819
Fluovac-anesthesiesysteemHarvard Apparatus34-1030
Glucose 5%Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) verdamperEickemeyer4802885
IsofluraneForene AbbottB 506
Isotone (0,9%) NaCl-oplossingDeltaSelect GmbHPZN 00765145
Ketamine 10%cevaCharge: 36217/09
Xylazin 2%medistarCharge: 04-03-9338/23
Verbruiksartikelen
20 ml spuitBD Plastipak
250 ml ErlenmeyerkolfSchott Duran21 226 36
25 ml Beker 2xSchott Duran50-1150
2 ml spuitBD Plastipak
4-0 Vicryl-naaldEthiconV7980
AgaroseCommercieel verkrijgbaar
Bepanthen oog- en neuszalfBayer Vital GmbH6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery KitFine Science Tools Inc.18010-00
GaasjesFuhrmann GmbH32014
Dekglas 24x50 mmROTH1871
Durapore-zijdetape3M1538-1
Feather wegwerp-scalpelFeather02.001.30.011
Fine Bore Polyethyleenbuis 0,58 mm IDSmiths medical800/100/200
HistoacrylBraun10500525x 0,5 ml
LeukoplastBSN Medical Inc.
MicroscopenglazenROTH1879
Poly-alcohol Haut…farblos AntisepticumAntiseptica GmbH72PAH200
Sterican-naald 18 G x 1B. Braun304622
Sterican-naald 27 3/4 G x 1B. Braun4657705
WeefselpapierCommercieel verkrijgbaar
Chirurgische instrumenten
Amalgaam polijstmachine 3PLGatz0110?
Blair retractoren (4-taks (bot)) x2Storz&KleinS-01134
Dumont nr.7 pincetFine Science Tools Inc.91197-00
Graefe pincet gebogen x1Fine Science Tools Inc.11151-10
Graefe pincet recht x2Fine Science Tools Inc.11050-10
Heidemann spatel HD2Stoma2030.00
Naaldhaakjes MathieuFine Science Tools Inc.12010-14
SchaarFine Science Tools Inc.14074-11
Semken pincetFine Science Tools Inc.11008-13
Kleine chirurgische schaar gebogenFine Science Tools Inc.14029-10
Kleine chirurgische schaar rechtFine Science Tools Inc.14028-10
Standaard pincetFine Science Tools Inc.11000-12
Vannas veerscharenFine Science Tools Inc.15000-08
Apparatuur
ECG-triggereenheidRapid Biomedical3000003686
MICROCAPSTAR eind-expiratoire koolstofdioxide-analysatorAD Instruments
Minivent Typ 845Harvard Apparatus73-0043
Multifoton-microscoop Trimscope ILaVision
Perfusor CompactB. Braun
PowerLab 8/30 8-kanaals recorderAD InstrumentsPL3508
Temperatuurgeregeld verwarmingskussenSygonix26857617
TemperatuursensorCommercieel verkrijgbaar
Temperatuurgeregeld systeem voor microscopen -Cube&BoxLife Imaging Services

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
  3. Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955(1969).
  4. Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
  5. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
  6. Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
  7. Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
  8. Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
  9. Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
  10. Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
  11. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
  12. Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
  13. Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
  14. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
  15. Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
  16. Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
  17. McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
  18. Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
  19. Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
  20. Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
  21. Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
  22. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
  23. Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
  24. Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805(2010).
  25. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  26. Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
  27. Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
  28. Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
  29. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  30. Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
  31. Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
  32. Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
  33. Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
  34. Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
  35. Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
  36. McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
  37. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
  38. Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
  39. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
  40. Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693(2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Intravital MicroscopyLiver ImagingCXCR6 Gfp MiceLeukocyte MigrationCell Cell InteractionsLong Term ImagingTissue StabilizationVital Parameter MonitoringLaser Scanning Microscopy

Gerelateerde artikelen