3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression

Samenvatting

Het bestuderen van medullaire thymische epitheelcellen in vitro is grotendeels onsuccesvol geweest, omdat huidige 2D-kweeksystemen het in vivo scenario niet nabootsen. Het 3D-kweeksysteem dat hierin wordt beschreven - een gemodificeerd organotypisch model voor huidcultuur - heeft zich superieur getoond in het nadoen van mTEC-proliferatie, differentiatie en het behoud van promiscue genregulatie.

Samenvatting

Intra-thymus T cel ontwikkeling vereist een ingewikkelde driedimensionale maaswerk uit verschillende stromale cellen, dwz niet-T-cellen. Thymocyten doorkruisen deze steiger in een sterk gecoördineerde temporele en ruimtelijke orde, terwijl achtereenvolgens passeren verplichte check points, dwz T-cel lineage inzet, gevolgd door T-cel-receptor repertoire generatie en selectie vóór de uitvoer in de periferie. De twee belangrijkste bewoner celtypes vormen deze steiger zijn corticale (cTECs) en medullaire thymus epitheelcellen (mTECs). Een belangrijk kenmerk van mTECs is de zogenaamde promiscue expressie van verschillende weefsel-beperkte antigenen. Deze weefsel beperkte antigenen worden gepresenteerd aan thymocyten direct of indirect onvolwassen door mTECs of thymus dendritische cellen, respectievelijk resulterend in zelf-tolerantie.

Geschikte in vitro modellen emuleren de ontwikkelingstrajecten en functies van cTECs en mTECs zijn lacking. Dit gebrek aan adequate experimentele modellen is bijvoorbeeld bemoeilijkt de analyse van promiscue genexpressie, die nog steeds slecht begrepen op cellulair en moleculair niveau. We pasten een 3D organotypische co-cultuur model tot cultuur ex vivo geïsoleerde mTECs. Dit model werd oorspronkelijk ontworpen om keratinocyten kweken op zodanige wijze dat een huidequivalent in vitro genereren. Het 3D-model behouden belangrijke functionele kenmerken van MTEC biologie: (i) proliferatie en terminale differentiatie van CD80 ^lo, Aire-negatief in CD80 ^hi, Aire-positieve mTECs, (ii) respons op RANKL, en (iii) aanhoudende expressie van FoxN1, aire en weefsel beperkt genen in CD80 ^hi mTECs.

Inleiding

Ontwikkeling thymocyten maken ongeveer 98% van de thymus, terwijl de resterende 2% uit diverse cellen die tezamen vormen het thymus stroma (bijvoorbeeld epitheliale cellen, dendritische cellen, macrofagen, B-cellen, fibroblasten, endotheelcellen). De buitenste corticale epitheelcellen (cTECs) verwerven immigratie van pro-T-cellen van het beenmerg, T cellijn inductie bij multipotente pre-T-cellen en positieve selectie van zelf-MHC beperkte onrijpe thymocyten. De binnenste medullaire thymus epitheelcellen (mTECs) zijn betrokken bij inductie van de thymocyten met hoge affiniteit TCR voor zelf-peptide / MHC-complexen door ofwel induceren negatieve selectie of de afwijking in de regulatoire T-cellijn. In het kader van de centrale tolerantie inductie, mTECs zijn uniek in dat ze drukken een breed spectrum van weefsel beperkt zelf-antigenen (TRA) dus mirroring de perifere zelf. Dit fenomeen wordt promiscue genexpressie genoemd (PGE)^1,2.

De meeste huidige studies over deze fascinerende celtype afhankelijk ex vivo geïsoleerde cellen, diverse korte 2D kweeksystemen steeds resulteerde in het verlies van PGE en belangrijke regulator moleculen zoals MHC klasse II, FoxN1 en Aire binnen de eerste 2 dagen ^3-6 . Het bleef echter onduidelijk welke bepaalde componenten en eigenschappen van het intacte 3D maaswerk van de thymus ontbraken in 2D modellen. De re-aggregatie thymus orgaankweek (RTOC) heeft tot nu toe de enige 3D-systeem dat de studie van T-celontwikkeling mogelijk maakt, enerzijds, en stromale celbiologie, daarentegen is, in een intacte thymus micromilieu ^7. Toch RTOCs bepaalde beperkingen, dat wil zeggen, zij bevatten reeds een complex mengsel van cellen, input nodig foetale bindweefselcellen en doorstaan ​​een maximale kweekperiode van 5-10 dagen.

Het ontbreken van reductionistisch in vitro kweeksystemen heeft de studie van belemmerdverschillende aspecten van de T-cel ontwikkeling en thymus organogenese niet in het minst de moleculaire regulatie van PGE en haar relatie tot de ontwikkelingsbiologie van mTECs.

Door de nauwe verbondenheid van de gestructureerde organisatie van de epitheelcellen van de huid en de thymus, hebben we gekozen voor een 3D organotypische cultuur (OTC) systeem dat oorspronkelijk was ontwikkeld om de differentiatie van keratinocyten in vitro na te bootsen en zo een dermale equivalent. De OTC bestaat uit een inerte scaffold matrix bedekt met dermale fibroblasten die zijn gevangen in een fibrinegel, waarop keratinocyten geënt ^8,9. Hier hebben we vervangen keratinocyten met gezuiverd mTECs. Terwijl de fundamentele kenmerken van dit model, we geoptimaliseerd bepaalde parameters.

In de vastgestelde OTC model mTECs verspreidden, onderging terminale differentiatie en onderhouden Mtec identiteit en PGE, dus nauw nabootsen in vivo mTECs ontwikkeling ^{10. Deze technische notitie geeft een gedetailleerd protocol waardoor de stapsgewijze set-up van de thymus OTC's.}

Protocol

Deze studie is goedgekeurd door de ethische commissie van het Regierungspräsidium Karlsruhe. Alle dieren werden gehuisvest onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden bij de Duitse Cancer Research Center (DKFZ). Voor alle kweekexperimenten muis pups van 1 tot 7 dagen oud werden gebruikt.

1. Isolatie van mTECs van Thymus

Opmerking: De volgende digestie stappen werden uitgevoerd zoals eerder is beschreven ¹ onder steriele omstandigheden met enkele wijzigingen, opgenomen.

1. Onthoofden de muis pups en verwijder de thymus. Plaats de thymi op ijs in een Petri plaat met RPMI 1640 medium (met 5% FCS).
2. Snijd de thymi in fijne, reepjes en plaats in een buis met ronde bodem ~ 5-30 ml RPMI-medium en voorzichtig roeren met een magneet voor 10 min bij kamertemperatuur.
3. Daarna, decanteren de bovenstaande die hoofdzakelijk thymocyten en te verteren de resterende weefsel opeenvolgend met een ronde van COLLAGENAse type IV (0,2 mg / ml en 57 U / ml uiteindelijk concentartion) gedurende 15 min elk bij 37 ° C, gevolgd door collagenase / dispase (0,2 mg / ml en 1,2 U / ml eindconcentratie) gedurende 25 min elk bij 37 ° C in een waterbad onder magnetisch roeren totdat de thymi volledig gedigereerd. Met 1 ml enzyme per 2-3 thymi.
4. Schud het weefsel eens 7-10 minuten met een Pasteur pipet. Pool de collagenase / dispase breuken en filteren door middel van een 70 um gaas.
5. Verrijk de mTECs door magnetische celsortering (MACS). Voer de zuivering van mTECs door magnetische celsortering zoals eerder ¹¹ beschreven en is getoond in figuur 1.
   OPMERKING: Bij magnetische sortering van mTECs gebruikten we de volgende antilichamen: anti-CD80-PE (16-10A1, gebruikt bij 1: 100 verdunning) en anti-EpCAM-bio (G8.8, gebruikt bij 1: 100 verdunning) ^12. Onvolwassen en volwassen mTECs met MACS werden gedefinieerd als: CD45 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^- en CD45 ^- CD80 ⁺ respectively.
6. Na MACS zuivering (zuiverheid van onrijpe mTECs = 83,1 ± 6,3% en volwassen mTECs = 79,23 ± 3,42%), het zaad van de mTECs op de organotypische culturen zoals hieronder beschreven (paragraaf 2.3).
7. Alternatief sorteren mTECs met FACS (met 100 um nozzle) na CD45 MACS depletie met de volgende antilichamen: anti-CD45-PerCP (30-F11, gebruikt bij 1: 100 verdunning), anti-Ly51-FITC (6C3, gebruikt bij 1 : 100 verdunning), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, gebruikt bij 1: 500 verdunning) en anti-CD80-PE (16-10A1, gebruikt bij 1: 100 verdunning). Uitsluiten dode cellen met behulp van propidiumjodide (1: 5.000) (dag 4). Onvolwassen en volwassen mTECs met FACS werden gedefinieerd als: PI ^- CD45 ^- Ly51 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^- en PI ^- CD45 ^- Ly51 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^+, respectievelijk.

2. 3D Organotypische Co-culturen (OTC)

LET OP: De 3D-dermal constructies voor organotypische teelt van keratinocytes werden bereid zoals eerder beschreven ^9,13. Bij alle stappen werden cellen geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO _2. De OTC's gebruiken mTECs werden als volgt bereid met geringe modificaties.

1. Voorbereiding van de menselijke fibroblasten
   OPMERKING: De menselijke dermale fibroblasten werden verkregen uit explantkweken van-de epidermised dermis zoals eerder ⁹ beschreven.
   1. Kortom, gesneden stroken menselijke huid (~ 5 cm lang) en behandel met thermolysine (0,5 mg / ml in zoutoplossing met 10 mM Hepes pH 7,4) O / N bij 4 ° C.
   2. Daarna, scheid de epidermis van de dermis behulp van een tang.
   3. Fijn gesneden de dermis in kleine stukjes, plaats in een 10 cm Petri plaat en laten drogen gedurende 1-2 uur onder een steriele luchtstroom. Vul het explantaten regelmatig DMEM met 20% FBS.
   4. Splits de-out groeiende fibroblasten wanneer confluent (meestal rond de 3 weken) met 0,1% trypsine ervoor te zorgen dat de explantaten blijven houden aan de plaat voor verdere conopeenvolgende rondes van uitgroei.
   5. Vouw de fibroblasten uit dezelfde explantaten tot 3 maal in DMEM met 10% FBS en cryo-behouden ze ^14. Gebruik dezelfde partij fibroblasten voor elke experimentele serie.
      LET OP: De fibroblasten werden niet bestraald voor de set-up van de dermale equivalenten.
2. Bereiding van de steiger
   1. Snijd de 0,4-0,6 mm dik viscose, geweven vezelmateriaal (productdetails in de ondersteuning van excel sheet) in goed afgebakend cirkels met een scherp 11 mm diameter metalen puncher om precies te passen in 12 goed filter inserts. Plaats deze dan in de 12- goed filter insert (polyester capillaire porie membraan, 3 micrometer poriegrootte) als een schavot. Plaats het volledige filter opstelling in een steriele 12-well plaat.
   2. Bereid de fibrine gel met een fibrinelijm-kit voor chirurgie bestaande uit een combinatie van fibrinogeen en trombine. Pre-verdun het fibrinogeen en de thrombine-component van de kit tot 8 mg / ml en 10eenheden / ml, respectievelijk. Voor een enkel putje van een 12-well plaat als volgt.
      1. Verdun 100 pi fibrinogeen (8 mg / ml) met 100 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca ₂ ⁺ en _Mg2 ^+, pH 7,0. Verdun 100 ui thrombine (10 eenheden / ml) met 100 ul FCS bevattende 270.000 fibroblasten.
      2. Breng 200 pi van het thrombine met fibroblasten cell-mix op de scaffold waaraan 200 pi fibrinogeen toe (1: 1 mengsel), resulterend in een uiteindelijke concentratie van fibrinogeen van 2 mg / ml en 2,5 eenheden trombine / ml. Meng goed en verdeel gelijkmatig over het hele gebied van de steiger door zachte pipetteren (dag 1).
         OPMERKING: Na 30 min bij 37 ° C een prop omsluit de fibroblasten wordt gevormd, vult volledig de binnenruimten van de steiger en het vormen van een glad bovenvlak.
3. Co-cultuur met mTECs
   1. Voor pre-cultuur, dompel het orgel culturenDMEM met 10% FBS, 50 ug / ml L-ascorbinezuur en 1 ng / ml TGF-β1 met een mediumverversing om de dag gedurende 4-5 dagen.
   2. Op de dag van MTEC zaaien Vervang het medium rFAD medium (1: 1 DMEM + DMEM / F12) met 10% FBS, 10 ^-10 M choleratoxine, 0,4 mg / ml hydrocortison, 50 ug / ml L-ascorbinezuur, RANK-ligand (0,1 ug / ml) en 500 eenheden / ml aprotinine, waardoor vroegtijdige fibrinolyse door serine proteasen vanuit fibroblasten voorkomen.
   3. 7-8 uur later, set-up van de co-kweken van zaaien 250.000 mTECs (hetzij volledig mTECs of CD80 en CD80 ^{hi lo} subsets), in een volume van 100 gl per putje bovenop de fibroblast scaffold. Tel de cellen met behulp van een Neubauer kamer (dag 4).
      LET OP: Te allen tijde de thymus 3D organotypische culturen worden ondergedompeld in de media in tegenstelling tot de huid OTC's die voorzien zijn opgeheven.
   4. Na 24 uur incubatie, leveren de culturen met medium (totaal medium uitwisseling) zoals hierboven (stap 2.3.2) genoemd nu containing verlaagde bedragen van aprotinine, 250 eenheden / ml (Dag 5).
   5. Om de proliferatieve activiteit van mTECs beoordelen voeg edu (6,7 uM / ml, dat wil zeggen, 10 pM / putje) aan OTC's voor 4 uur voor beëindiging van het kweken. Voer de kleuring van OTC cryo-profielen zoals beschreven in de EDU Beeldverwerkingskit combinatie met co-kleuring van keratine 14. Bepaal de proliferatieve indices van mTECs, hetzij door het tellen van de K14 ⁺ EDU ⁺ cellen in twee secties van elke kweek specimen of de stroming cytometrie (EDU flowcytometrie, paragraaf 1.7 maar in plaats van Ly51-FITC gebruikt CDR1-PB ¹⁵ bij een 1: 100 verdunning en 2.3.6.4).
   6. Na 4-7 dagen van de co-cultuur, beëindigen de OTC's en het proces voor de RNA-isolatie, cryo-snijden of FACS-analyse (dag 8-11).
      1. Beëindig de kweken met een pincet, het scheiden van de scaffold / dermale equivalenten voor filter van de put insert.
      2. Voor cryo-snijden, insluiten het gehele OTC in OCT verbinding en bevriezen in liquid stikstofdamp voordat cryo-snijden. Bereid 5-7 pm dikke secties OTC behulp van een cryostaat en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. Voor immuno-histochemie van cryo-sectioned OTC's gebruiken anti-keratine 14 (AF64 gebruik bij 1: 1000 verdunning), en anti-vimentine (GP53, gebruikt bij 1: 100 verdunning) antilichamen. Voer de indirecte immuno-histochemie kleuring met behulp van respectieve secundaire antilichamen.
      3. Voor RNA-isolatie, voeg 1 ml denaturerende oplossing (bevattende fenol en guanidinium thiocyanaat) in een schroefdop van 2 ml RNase-free tube. Snijd de gehele OTC in stukken met een scalpel en voeg in de buis bevattende denaturerende oplossing. Mechanisch versnipperen de OTC's met FastPrep instrument tweemaal gedurende 30 seconden bij een snelheid van 6,0, plaatsen tussen op ijs gedurende 2 minuten (het monster kan worden opgeslagen bij -80 ° C na dit punt). Indien bij -80 ° C ingevroren, ontdooid op ijs. Centrifugeer de buizen bij 11,500-13,000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C. Breng het supernatant naar een nieuwe buis, incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en fOLLOW RNA-isolatie protocollen middels zuur guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie zoals beschreven door de fabrikant.
      4. Voor FACS analyse, verwijder het schavot en scheiden de membraan van de fibrine / fibroblast / Mtec gel. Fijngesneden de gel met een scalpel en verteren in een FACS buis ~ 20 minuten of totdat het volledig gedigereerd met 2 ml collagenase / dispase bij 37 ° C in een waterbad onder magnetisch roeren. Schud de enzymoplossing met een Pasteur pipet eens 5 min. Na volledige digestie, filter de celsuspensie door een 70 urn filter; vlek de enkele celsuspensie met de antilichamen zoals beschreven in 1.7 en geanalyseerd door flow cytometrie.

Resultaten

We heeft een 3D organotypische co-cultuur model (3D OTC), die oorspronkelijk was ontwikkeld voor in vitro lange termijn cultuur van keratinocyten ^9. MACS-verrijkte mTECs (zie MACS verrijking schema Figuur 1) werden gezaaid op een steiger bestaande uit een fibrine gel en ingesloten fibroblasten. De fibroblasten geven de essentiële extracellulaire matrix (ECM) ondersteunen mTECs in vitro. MTECs werden in OTC's gekweekt voor 4-14 dagen in de aanwezigheid van RANKL in onderg...

Discussie

Naast RTOCs zijn de 3D ​​OTC's qua TEC differentiatie en PGE onderhoud / inductie (Tabel 1) in vergelijking met andere (i) "vereenvoudigde 3D ​​cultures 'met verreweg superieur - fibroblasten alleen zonder het skelet; (Ii) 2D systemen met - fibroblasten / feeder-cellen samen gekweekt met TEC ^10, (iii) 3T3-J2 cellen waarbij TEC klonen ontwikkelen, maar PGE verloren, (iv) Matrigel of (v) ECM componenten (ongepubliceerde gegevens). PGE werd gehandhaafd voor maximaal 7 dagen in de 3D...

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Zwangere C57BL/6 muizen	Charles River WIGA
LS kolommen	Miltenyi Biotec	130-042-401
MS kolommen	Miltenyi Biotec	130-042-201
CD45 Microbeads, muis	Miltenyi Biotec	130-052-301
Anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Streptavidine Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 en -biotine)	Ref. 12
CD80-PE antilichaam	BD Pharmingen	553769
CD45-PerCP antilichaam	BD Pharmingen	557235
Ly51-FITC antilichaam	BD Pharmingen	553160
CDR1-Pacific Blue	Ref. 15
Keratine 14 antilichaam	Covance	PRB-155P
Vimentin antilichaam	Progen	GP58
Cy3-geconjugeerd AffiPure Geit anti-Konijn IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-003
Alexa 488-geconjugeerd AffiPure F(ab')2 Fragment Geit anti-Guinee-Varken IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	106-546-003
Geit anti-Konijn IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488-conjugaat	Molecular Probes (Invitrogen GmbH)	A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Invitrogen	C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10425
12-wels filter inserts (thincerts)	Greiner bio-one	657631
12-wels plaat	Greiner	665180-01
Jettex 2005/45	ORSA, Giorla Minore, Italië
Fibrinogeen TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
Trombine TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
PBS	Serva	47302.03
DMEM	Lonza	BE12-604F
DMEM/F12	Lonza	BE12-719F
HEPES	Gibco	15630-049
FBS Gold	GE Healthcare	A11-151
Aprotinine (Trasylol)	Bayer	4032037
Cholera toxin	Biomol	G117
Hydrocortison	Seromed (Biochrom)	K3520
L-ascorbinezuur	Sigma	A4034
TGF-ß1	Invitrogen	PHG9214
RANKL	R&D systems	462-TR-010
Thermolysine	Sigma Aldrich	T-7902
OCT Compound	TissueTek	4583
Trizol (ook bekend als Denaturerende oplossing - Acid guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie)	Invitrogen	10296028
FastPrep FP120	Thermo Scientific
Collageenase Type IV	CellSystems	LS004189	0,2 mg/ml en 57U/ml eindconcentratie
Neutrale Protease (Dispase)	CellSystems	LS002104	0,2 mg/ml en 1,2U/ml eindconcentratie
DNase I	Roche	11 284 932 001	25 µg/ml eindconcentratie

```