Methodenartikel

Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie

12.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52654

⸱

31 januari 2015

 ,  , 
1Davis Center for Regenerative Biology and Medicine, MDI Biological Laboratory

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een protocol voor het vastleggen van de dynamica van regeneratie van de staartvin van zebravislarven op een volledige weefselschaal met behulp van stereomicroscopie op basis van helder veld. Deze techniek maakt het mogelijk om de regeneratiedynamica met een enkele celresolutie vast te leggen. Deze methodologie kan worden aangepast aan elke stereomicroscoop uitgerust met een CCD-camera en time-lapse software.

Samenvatting

De staartvin van het zebravislarve is ideaal voor het bestuderen van weefselregeneratie vanwege de eenvoudige architectuur van de larvale vinplooi, die bestaat uit twee lagen huid die ongedifferentieerd mesenchym omsluiten, en omdat de staartvin van het larve zich snel regenereert binnen 2-3 dagen. Met behulp van dit systeem demonstreren we een methode voor het vastleggen van de reparatiedynamiek van de geamputeerde staartvin met time-lapse video brightfield stereomicroscopie. We laten zien dat vinamputatie een contractie van de amputatieswond en extrusie van cellen rond de wondrand veroorzaakt, wat leidt tot hun vervolgens vrijmaken. Vinregeneratie verloopt van proximale naar distale richting na een korte vertraging. Bovendien kan de ontwikkelingsgroei van de larve tijdens alle stadia worden waargenomen. De gepresenteerde methode biedt een mogelijkheid om gedragingen op het hele weefselniveau, zoals vinontwikkeling en groei, te observeren en te analyseren in een eenvoudige microscoopopstelling, die gemakkelijk kan worden aangepast aan elke stereomicroscoop met time-lapse-mogelijkheden.

Inleiding

Het vermogen van een organisme om weefselreparatieprocessen na een verwonding te coördineren, is cruciaal voor zijn overleven 1. Hoewel alle dieren de capaciteit hebben om hun wonden te genezen, verschilt de mate waarin weefsels regenereren sterk tussen soorten. Gewervelde soorten zoals zebravissen, salamanders en kikkervisjes hebben het opmerkelijke vermogen om verloren weefsels te regenereren, inclusief hun ledematen, delen van hun ogen, hart en centraal zenuwstelsel 2-4. Zoogdiersoorten, zoals de Afrikaanse stekelmuis en konijnen, zijn in staat om gaten in hun oorschelpen te regenereren 5-7, en mensen en muizen regenereren delen van hun lever evenals hun vingertoppen tijdens foetale en jeugdige stadia 8-12. Hoewel het nog niet goed begrepen is waarom en hoe bepaalde soorten weefsels effectiever regenereren dan andere, suggereert de aanwezigheid van vergelijkbare genetische paden dat deze mechanismen slapend kunnen liggen in soorten zonder groot regeneratievermogen 13,14. Het verduidelijken van weefselreparatie- en regeneratiemechanismen in soorten met bevredigende regeneratieresultaten zal dus ten goede komen aan regeneratie bij mensen.

We hebben de staartvin van de larve van de zebravis gekozen als een paradigma om zijn regeneratie te demonstreren met behulp van time-lapse brightfield stereomicroscopie. De staartvin van de zebravislarve is anatomisch eenvoudig in vergelijking met de complexere structuren van volwassenen, bestaande uit een tweelaagse, ingeplooide epitheellaag met somatosensorische axonen die de huid rondom mediaal gelegen mesenchymale cellen innerveren 15. Ondanks de anatomische verschillen is de regeneratie van de staartvin van de larve enigszins vergelijkbaar met de regeneratie van de volwassen vin in termen van moleculaire signaturen en uitgroeireacties 16,17. In vergelijking met de volwassen vin heeft het beeldvormen van de regeneratie van de staartvin van de larve echter verschillende voordelen: 1) de regeneratie van de staartvin van de larve is binnen 2-3 dagen voltooid 16, 2) larven kunnen worden gemonteerd in low-melt agarose, en 3) larven hebben geen voeding nodig tot ongeveer 5 dagen na bevruchting (dpf) vanwege de aanwezigheid van de dooierzak. Dit maakt zebravislarven ideaal voor het observeren van weefselreparatiedynamiek in vivo.

De gepresenteerde methode maakt het mogelijk om de gedetailleerde dynamiek onderliggend aan de vroege processen van vinregeneratie vast te leggen. Veel studies hebben fluorescentie-gebaseerde confocale microscopie gebruikt om cellulaire en subcellulaire biologische processen in embryo's en larven van zebravissen te bestuderen. Geavanceerde confocale beeldvormingsopstellingen zijn echter vaak niet voor iedereen toegankelijk en zeer duur in vergelijking met andere beeldvormingstechnieken. In tegenstelling hiertoe maakt de gepresenteerde methodologie gebruik van een Discovery V12 stereomicroscoop uitgerust met Axiovision-software en een time-lapse-module, waardoor het een meer betaalbare alternatief biedt voor dure beeldvormingsapparatuur om weefselgedrag te onderzoeken. We demonstreren dat deze methode kan worden gebruikt voor het beeldvormen van weefselregeneratie met hoge temporele resolutie tegen minimale kosten. De implicaties van deze methode kunnen zich uitstrekken tot voorbij de basisbiologie om studies naar regeneratie bij zoogdieren te bevorderen met behulp van orgaanculturen, voor therapeutische ontwikkeling door farmacologische en genetische screenings, en het kan dienen als een lesmiddel in een klasomgeving.

Protocol

Zebravis (parelmoer stam) werden gefokt en opgegroeid volgens vastgestelde protocollen. Alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren, met behulp van 0,4 mM tricaïne voor anesthesie en 1 mM tricaïne voor euthanasie. Zebravis embryo's en larven werden in strikte overeenstemming met goede dierenpraktijk behandeld zoals goedgekeurd door de bevoegde commissie (MDI Biological Laboratory dier kern IACUC nummer 13-20). Deze studie werd goedgekeurd door de National Human Genome Research Institute Animal Care en gebruik Comite, MDIBL Institutionele Assurance # A-3562-01 onder protocol # 14-09.

Opmerking: De beeldopname die fin regeneratie larvale zebravis wordt samengevat in de volgende stappen vangt:

1. Verhoging van de zebravis te larvale stadia

  1. Het verzamelen van de eieren en zet ongeveer 50 eieren in een 100 x 25 mm petrischaal met 0,03% Instant Ocean zout in gedeïoniseerd water aangevuld met 0,00004% methyleenblauw. Incubeer O / N in een 28,5 ° C incubator.
  2. De volgende ochtend verwijder de dode embryo's met een glazen pipet en spoel de eieren in een zeef met 0,03% Instant Ocean zout in gedemineraliseerd water (genoemd embryo gemiddeld).
    Opmerking: Medium zoals Ringers 18 Hanks 18, E2 19, E3 20 en Danieau 21 mei voorkeur.
  3. sup> Voeg verse embryo medium om de schotel. Bij gebruik van gepigmenteerde stammen, eventueel toevoegen van 0,2 mM 1-fenyl-2-thioureum (PTU), zoals PTU melanogenese en daarmee pigmentatie van de larven te voorkomen. Laat de embryo's verder te ontwikkelen in de couveuse tot 2 dagen na de bevruchting of andere gewenste larvale stadium.

2. Voorbereiding van de Imaging Kamer

  1. Methode 1: Imaging raakvlakken gemaakt van PVC of Teflon buis (figuur 1)
    Opmerking: Deze methode is vergelijkbaar met Concha en Adams (1998) 22.
    1. Verwerven drinkwater grade plastic of Teflon slang van een hardware-winkel met een 25 mm buitenste eenda 20 mm binnendiameter. Snij de buis ringen van ongeveer 10 mm dik maken met een vlak oppervlak aan elke zijde. Gebruik> 200 korrel schuurpapier om de randen glad.
    2. Maak de ringen met warm water en 70% ethanol en laat ze drogen.
    3. Met een pipetpunt toepassing siliconenvet de helft van een ring en bevestig de ring op een 75 mm x 25 mm dekglaasje. U kunt ook gebruik maken van een 3 ml injectiespuit gevuld met siliconen vet in plaats van een pipet tip.
      Opmerking: Omdat het moeilijk is om het siliconenvet voegen in de spuit 3 ml, voeg het siliconenvet een 30 ml spuit eerste en deze voor het vullen van de spuit 3 ml.
  2. Methode 2: Bereiding van een petrischaal als imaging kamer.
    1. Verwerven 35 of 60 mm petrischalen met een glazen dekglaasje aan het deksel (Figuur 2A). Alternatief, zoals getoond in figuur 3 van Distel & Koester (2007) 23, boor een opening klein genoeg houd een dekglaasje in het deksel van een kleine petrischaal en siliconenvet van toepassing op de buitenkant met een spuit 3 ml. Met behulp van een schone pipetpunt voorzichtig voeg een ronde of vierkante dekglaasje van gewenste dikte naar buiten (Figuur 2B).
  3. Om de agarose worden gebruikt voor het monteren blijft stevig vastzitten in de beeldvormingsprocedure, voeg een boete plastic gaas in de ring. Eerst snijd de mazen van vensterscherm verkregen uit een ijzer, in de omvang van de binnenring diameter met fijne schaar met een hoek. Snijd een kleine rechthoek> tweemaal de grootte van de larve in het midden van de maas (figuur 1, 2).
  4. Breng vier kleine puntjes van niet-toxisch siliconenvet aan het grensvlak tussen het dekglaasje en de kamer ring (Figuur 1A).
  5. Tang om het gaas stevig aan de onderkant van de glazen dekglaasje.

3. Montage en beeldvorming van de Pre-injreerd Larve (Deze stap is optioneel)

Opmerking: Deze stap is geschikt voor vergelijkingen tussen de geamputeerde en geregenereerd vin lengte, als de amputatie vliegtuig na fin regeneratie is niet herkenbaar in de zebravis larven.

  1. Bereid een 0,5-1,2% laag smeltpunt agarose-oplossing in embryo medium voor immobilisatie van het monster.
  2. Verwarm de agarose in een magnetron en breng de oplossing agarose in 1,5 ml buizen die zijn voorverwarmd tot 42 ° C in een verwarmingsblok.
  3. Laat de hete agarose afkoelen tot 42 ° C, die kan worden gehandhaafd gedurende enkele weken bij deze temperatuur. Vermijd pipetteren de larven in agarose boven 42 ° C, aangezien daardoor het dier zal zijn.
  4. Verdoven verscheidene larven met 10 ml 0,4 mM tricaïne (pH 7) in embryo medium in een 60 mm petrischaal. Bereid de tricaïne volgens de zebravis Book Recepten 18.
    1. Alternatief gebruik 10 ml van een 1: 1000 verdunning van 99% 2-fenoxyethanol in een 60 mm petrischaal. Poke de larven met een bedekte microloader pipettip hun aanslagreactie alvorens verder te gaan beoordelen. Gebruik alleen niet-responsief larven.
  5. Transfer één larve in de 42 ° C agarose-oplossing met behulp van een glas Pasteur pipet. Oefen geen overmatige vloeistof niet overdragen naar de agarose, anders wordt de agarose zal ook worden verdund en niet stollen.
  6. Gooi de resterende vloeistof uit de pipet en breng de larve met één druppel agarose in een kleine petrischaal (35 of 60 mm diameter). Plaats de larve op zijn kant voor de beeldvorming van de staartvin.
  7. Laat de agarose stollen. Beoordeel de agarose met een plastic pipet tip; de tip zal onderdompelen in de agarose als het te vloeibaar. Zodra de agarose gestold is, zal een kleine inkeping zichtbaar na het aanraken met een pipet tip. Naar aanleiding van het stollen, voeg tricaïne oplossing en ga verder met de stereomicroscoop die later zal worden gebruikt voor time-lapse imaging.
    Opmerking: Deze stap kan ook worden uitgevoerd door het plaatsen van het verdoofde larve op een petrischaal bekleed met 1,5% agarose in embryo medium.
  8. Gebruik een stereomicroscoop met time-lapse-software. Selecteer een geschikte objectieve en vergroting, die later zal worden gebruikt voor time-lapse imaging. Hier, gebruik dan een 3,5 x 16 mm werkafstand objectief op een stereomicroscoop. Naar wens gebruik alternatieve microscopen en objectieven maar kies juiste vergroting verantwoorden mogelijke xy-drift en groei van de vin in de beeldvormingsprocedure.
  9. Selecteer de camera detectie functie op de microscoop.
  10. In de software, selecteert u de 'live' modus om de larve op het scherm te bekijken.
  11. Open het venster 'Eigenschappen' om de helderheid automatisch te detecteren.
  12. Handmatig aanpassen van het contrast bij de microscoop trans-verlichting basis.
  13. Beweeg de larve uit het gezichtsveld en selecteer de Shading Correction functie op de achtergrond geen minimaliserenise.
  14. Plaats de larve terug in het gezichtsveld en een momentopname. Sla de afbeelding.
  15. Verwijder de agarose uit de larve door eerst te schrapen de agarose het hoofd af. Op deze manier de larve kan uit de agarose worden geschoven door zachtjes te trekken het hoofd weg van de resterende agarose met een bedekte microloader pipet tip of een insect pin.
  16. Met een glas Pasteur pipet overdracht van de larve in de frisse tricaïne oplossing.

4. Amputatie Assay

  1. Bereid een 1,5% agarose-oplossing met embryo medium en giet een dunne laag in een petrischaal. Laat de agarose stollen.
  2. Onder een stereomicroscoop, plaatst de larve zijwaarts op de gestolde agarose en amputeren de staartvin met een 23 G naald van de spuit met lichte druk (figuur 3A).

5. Montage van de Larve voor Time-lapse Imaging

  1. Ga te werk zoals beschreven in de stappen 3,1-3,5 (Figuur 3B).
  2. Breng een druppel van 0,5-1,2% vloeibare agarose bij 42 ° C met de larve in de beeldvorming kamer ring (stap 2.1), oriënteren de larve en laat de agarose stollen. Vul de ring met tricaïne oplossing. Als alternatief, als de petrischaal kamer (stap 2.2) wordt gebruikt, monteer de larve op het deksel dekglaasje en vul het deksel met tricaïne oplossing.
  3. Voor een goede wondgenezing of weefselregeneratie te laten plaatsvinden, voorzichtig afschrapen de agarose rond de distale staartvin met een bedekte microloader pipettip of een insect pin. Probeer niet om de vin herhaaldelijk (Figuur 3C) verwonden.
  4. Schenk de tricaïne oplossing met agarose het verwijderd en vul de kamer ring met verse tricaïne oplossing.
  5. Toepassing siliconenvet aan de bovenkant van de kamer ring uit en plaats een 75 mm x 25 mm glasplaatje. Probeer om luchtzakken te voorkomen dat in de kamer, want zij zullen interfereren met helderveld imaging en uitdrogen van de larve in de tijd.
  6. Bij gebruik van een petrischaal alseen imaging kamer, gelden siliconenvet aan de bovenrand van de onderste kamer en vul de onderste kamer met tricaïne oplossing. Decanteren voorzichtig de tricaïne oplossing in het deksel en draai de deksel op de larve dompelen in de tricaïne oplossing van de onderste kamer onder een kleine hoek met luchtzakken te voorkomen. De kamer wordt verzegeld door het siliconenvet.

6. Time-lapse Imaging

  1. Monteer een verwarmde incubatiekamer zoals beschreven in 23,24 (figuur 4) .Plaats de incubatiekamer rond de microscoop en zet het vuur. Breng de temperatuur op 28 ° C gedurende 10-20 minuten of totdat de temperatuur gestabiliseerd.
  2. Open de voorkant van de verhitte incubatiekamer en plaats de beeldvorming kamer op de microscoop stand met het dekglaasje naar boven naar het doel.
  3. Plaats de larvale vin op een manier die 2/3 van het gezichtsveld blijft onbezet. Dit zorgt voor de vangst van degroei en regeneratie van de vin in de loop van de beeldvormende procedure zonder de larve verplaatsen.
    1. Pas de gemonteerde larve tot 28 ° C ~ 30 minuten voor aanvang van de time-lapse-opname op veranderingen in helderveld intensiteit of mogelijke verschuivingen van de agar te voorkomen. Als alternatief gebruik maken voorverwarmde buffer om beeldvorming start na kortere aanpassingstijd.
  4. Voor het instellen van de time-lapse-opname, open de 6D Multidimensional Acquisition raam in de AxioVision software en selecteer de optie z-stack en time-lapse.
  5. Optioneel) In het tabblad z-stack en Slice-modus, selecteert u de slice dikte en vervolgens selecteert u de Start / Stop-modus.
  6. Definieer de bovenste en onderste positie van de stapel.
  7. In het tabblad time-lapse, selecteert u het interval en de duur van de film en start de film door het indrukken van de startknop. We vonden dat 30 min intervallen zijn voldoende en dit interval niet overmatig gegevens te produceren; echter ShorteR intervallen worden gebruikt.
  8. Controleer de positie en z-stack afmetingen tijdens het eerste uur als de larve niet vooraf ingesteld. Indien nodig, de positie van de larve weer na een dag, als de larve kan zijn verschoven.
  9. Sla het bestand op het einde van de time-lapse-opname en verder te gaan met de post-processing en kwantificering met behulp van beschikbare software voor beeldanalyse, zoals Imaris 25 of de open source softwarepakketten Image J 26 en Fiji 27.

7. Data Analyse

  1. Het bepalen van de vin lengte.
    1. Open de time-lapse film in de imaging-software en de bestanden opslaan in het eigen bestandsformaat om software te verbeteren.
    2. Selecteer de orthogonale oog op individuele secties als geprojecteerd stapels weer te geven. Voor drift correctie, selecteert Plugins, dan Registratie, en 'Correct 3D drift' onder de Fiji-menu. Dit zal een Fiji-venster openen en de drift correcties. Juistrotatie-drift in de Imaris Spots functie. Als alternatief, installeer de StackReg en TurboReg plugins in Afbeelding J en importeren naar Fiji. Kies de gewenste transformatie algoritme in de StackReg plugin.
    3. Om afstanden (bv wond diameter of vin lengte) te meten, selecteer de optie 'Add New Meetpunten' in de linker werkbalk.
      1. Onder 'lijst configureren van zichtbare Statistieken Waarden' in de linker menu de statistieken waarden moeten worden weergegeven.
      2. In de 'Lijn Mode' onder het tabblad instellingen selecteren 'Pairs (AB, CD, ...)'.
      3. In 'Labels Eigenschappen' select 'Naam' en 'Afstand', om de afstand tussen de punten A en B naast de meting lijn weer te geven.
      4. Schakelen naar de modus 'Edit' en houd de shift-toets om het eerste punt aan het einde van de notochord selecteren. Maak dan gebruik van dezelfde configuratie om het tweede punt aan het distale fin marge te selecteren.
      5. Selecteer op het tabblad 'Statistieken' de schijf knop (Alles exporteren) in de rechter benedenhoek te geven en te exporteren de afstand in het beeld.
      6. Herhaal de metingen op geselecteerde tijdstippen door de schuifregelaar onder de afbeelding aan de rechterkant. In plaats van het creëren van nieuwe Meetpunten, kan de vorige verplaatst worden door eerst het punt te selecteren met de linker muisknop, dan gelijktijdig indrukken van de shift en de linker muisknop op de nieuwe positie.
    4. Als alternatief voor de optie Meetpunten, gebruik maken van de slice kijker om afstanden te meten. In de slice uitzicht modus, ga naar een gewenste positie en klik op de eerste en tweede positie met de linker muisknop. De afstand wordt weergegeven. Deze optie is echter niet mogelijk voor data-export.
  2. Het bepalen van fin lengte en omgeving in ImageJ.
    1. Open de time-lapse film in ImageJ met behulp van een plugin die het .zvi bestandsformaat herkent. Als alternatief, laden in een QuickTime bestand of tiff volgorde.
      Opmerking: Als u een niet-gecomprimeerde TIFF-bestandsformaat, weet de afmetingen van het beeld niet te worden opgegeven.
    2. Als het openen van een ander bestandsformaat, zonder het bestand informatie, selecteer 'Set Scale' onder het menu 'Analyseren' om eerst de afbeelding afstand en eenheid te definiëren. In de 'Set Schaal menu', typt u het 'Afstand in pixels', hieronder het type in de 'bekende afstand' voor de pixel waarde (dit kan worden verkregen door het meten van het aantal pixels op een schaal bar die werd toegevoegd aan het beeld Klik vervolgens op Meet om het resultaat te verkrijgen), en de 'Eenheid van lengte' (typisch 'um'). Klik vervolgens op OK.
    3. Voor fin gebied metingen selecteer de 'Selectie uit vrije hand' gereedschap in de werkbalk en een overzicht van de vin gebied door de linkermuisknop ingedrukt te houden tijdens het tekenen langs de omtrek van de vin. Voor vin lengte metingen, selecteer de 'Straight' line tool en trek een lijn tussen de gewenste punten te zijngemeten.
    4. Klik op de 'Measure' optie onder 'Analyseren' naar het gebied en de lengte van de vin weer te geven. Herhaal deze stap zo vaak als nodig is voor verschillende tijdstippen van de film.
  3. Met behulp van statistische software kunnen de gegevens grafisch worden weergegeven.

Resultaten

De gepresenteerde techniek is geschikt voor weefselherstel dynamiek ontrafelen in reactie op amputatie. De film blijkt dat amputatie van de vin initieel veroorzaakt een portemonnee-string effect, gekenmerkt door samentrekkingen via actine-myosine kabels die aanwezig zijn in het fin-voudig 28 (figuur 5 A, B). Gelijktijdig worden cellen geëxtrudeerd uit de wond (zie filmpje). De contractie kan dus een middel om cellen die waarschijnlijk bestemd om celdood te verdrijven. Onze resultaten tonen verder dat de ontwikkelingsgroei van de larve gebeurt onafhankelijk van regeneratie (film), terwijl fin regeneratie niet leiden tot ongeveer 14 uur na amputatie zoals gemeten door fin lengte ruimte boven het tijdsverloop van 36 uur na amputatie (Figuur 5C , D). De totale regeneratieve fin groei na 1,5 dagen was ongeveer 60% van de oorspronkelijke lengte vin (figuur 5E). Samengenomen tonen deze resultaten aan dat amputatie tr Iggers fin contractie, extrusie van cellen van de wond, en een tijdelijk vertraagde regeneratieve respons. Terwijl geëxtrudeerde cellen waarschijnlijk zijn voorbestemd om celdood te ondergaan, de aard van deze cellen moet verder worden verduidelijkt.

figure-results-1
Figuur 1. beeldvorming kamer ringkombinatie

(A) Getoond wordt een kunststof ring die een dekglaasje met siliconenvet is bevestigd. Het kunststof is aan de binnenzijde van de kamer met vier kleine puntjes siliconenvet gehecht. (B) De kamer met de gemonteerde larve is gevuld met tricaïne oplossing en een glasplaatje wordt aan de bovenkant bevestigd. (C) een gemonteerde 2 dagen oude larven (pijl) wordt weergegeven bij een grotere vergroting de grootte tonen in verhouding tot het gaas."_blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. beeldvorming kamer montage gemaakt van petrischaaltjes. (A) Afgebeeld is een commerciële glazen blad met glazen bodem petrischaaltje met een plastic gaas bevestigd aan de glazen dekglaasje. (B) Afgebeeld is een zelf geconstrueerde petrischaal kamer met een gat in het deksel en een dekglaasje bevestigd vanaf de buitenkant met siliconen vet. De mesh en larven worden in de kamer met tricaïne oplossing gemonteerd. Om de kamer af te dichten, wordt siliconenvet toegepast op de bovenste, buitenste rand van de onderste kamer en de top deksel bevestigd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Schema van amputatie en montage van een larve voor de beeldvorming. (A) voor amputatie, het plaatsen van een verdoofd larve op een agarose gecoate petrischaal en amputeren de staartvin met een injectienaald. (B) Voor montage, breng het larve met een transfer pipet in een 1,5 ml buis gevuld met 42 ° C vloeibaar agarose en pipetteer een druppel met de larve in de beeldvorming kamer, oriënteren de vis en dek de gestolde agarose met embryo medium. (C) Schraap de agarose uit de staartvin met een bedekte microloader pipettip of iets dergelijks en vervang embryo medium met vers medium. (D) Afbeelding de staartvin onder een stereomicroscoop. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Zelf gebouwd verwarmd incubatiekamer. (AC) Afgebeeld is een verwarmd incubatiekamer gemaakt van karton, noppenfolie en klittenband. Een bedrade dome heater (oorspronkelijk ontworpen voor kippenei incubatie) wordt aan de kamer met behulp van aluminium tape bevestigd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Fin regeneratie dynamiek. (A) Regeling van de gebruikte staartvin amputatie assay en kwantificering methode om de vin lengte (rode pijl) en het gebied (rode contouren van het fin) te bepalen. (B) staartvin amputatie aanvankelijk triggers samentrekking van de vin, gevolgd door regenerative weefsel uitgroei. De fin ondergaat ook ontwikkelingsstoornissen groei, zoals blijkt uit de laterale grootte verhoging. (C) Getoond wordt de vin lengte als functie van de tijd, waaruit een lineaire regeneratieve groei vanaf ~ 14 hpa. (D) Kwantificering van de vin gebied toont een aanvankelijk kleiner wordt, dat kan worden toegeschreven aan de inkrimping van de vin. Na ~ 14 uur, de vin wordt groter met een lineaire snelheid. (E) Vergelijking van de vin lengte voor amputatie en na 36 uur toont ~ 60% hergroei. Schaal bar: 100 micrometer Afkortingen: pre-amp, pre-amputatie; uur na de amputatie, hpa; Regen, regeneratie; amp, amputatie Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Movie . Fin regeneratie over het tijdsverloop van 36hr. Getoond wordt een staartvin van een 2,5 dagen oude larven tijdens regeneratie. Vanaf 30 min na de amputatie regeneratieve groei wordt afgebeeld in 30 min intervallen op een stereomicroscoop met een 3,5x objectief.

Discussie

De gepresenteerde methode maakt het mogelijk voor het observeren van wondheling en weefselregeneratie in levende zebravis larven met in vivo time-lapse imaging op een helderveld stereomicroscoop, met behulp van een relatief eenvoudige set-up. Deze procedure vereist een aantal belangrijke aspecten die we hebben getest, waarvan de uitkomst zal optimaliseren: 1) Lage agarose concentraties (~ 0,5%) zal de groei belemmeringen van de voortdurend groeiende larvale zebravis minimaliseren, 2) Het verwijderen van de agarose rond de vin is belangrijk om niet het genezingsproces verduisteren, 3) het vangen van de agarose in een plastic gaas behoudt de agarose en dier in een stabiele positie tijdens de procedure, en 4) een juiste temperatuur gecontroleerde omgeving, die essentieel is voor larvale levensvatbaarheid. We hebben een verwarmd incubatiekamer 23,24, wat noppenfolie dat wordt geplakt op karton gebruikt, en een bedrade dome verwarming om de temperatuur en een goede luchtcirculatie met minimale fluctuaties tijdens het besturen aangepastbeeldvorming procedure. Deze eenvoudige en kostenefficiënte kamer kan worden bereid om elke microscoop passen. Een soortgelijke verwarmd incubatiekamer werd ook gebruikt voor de beeldvorming muizen en chick ontwikkeling 24,29.

Wij stellen voor dat pre-geamputeerd larven voor het een pre-amputatie zijn gemonteerd, gedemonteerd voor amputatie, en opnieuw gemonteerd voor time-lapse imaging. Hoewel het mogelijk om deze stappen in één enkele stap in de uiteindelijke beeldvorming kamer, in onze ervaring we vonden dat amputatie de staartvin op een glazen dekglaasje is niet optimaal, aangezien scheurt het weefsel en niet leidt tot een zuivere snede. De-agarose gebaseerd amputatie methode met behulp van een injectienaald werd oorspronkelijk beschreven door Kawakami en collega's (2004) 16 en is ook, in onze ervaring, ideaal om de amputaties te voeren. Zo is de vrij ingewikkelde reeks stappen die we gepresenteerd is goed gemotiveerd en zorgt voor een optimale regeneratie uitkomst.

We toonden aan dat larval zebravis op 2 dpf kan worden afgebeeld tot 1,5 dagen in agarose en tricaïne oplossing. We gebruikten pH geoptimaliseerde tricaïne (pH7) oplossing bereid met Instant Ocean zout, die niet interfereert met de gezondheid van het model voor de gepresenteerde beeldvormende periode. We hebben eerder echter ook aangetoond dat het gebruik van tricaïne in Danieau medium maakt time-lapse beeldvorming van 2,5 dpf larvale zebravis op een confocale microscoop voor minstens 2 dagen 30. Aldus kan optimale bufferomstandigheden larvale gezondheid en de lengte van beeldvorming verlengen. Alternatief kan tricaïne lagere concentraties worden gebruikt voor anesthesie, of 2-fenoxyethanol, die we vonden goed verdragen tijdens de larvale en volwassen stadia bij 28 ° C gedurende ten minste 60 uur.

Defecten in fin regeneratie te voorkomen, hebben we verwijderd van de agarose uit de staartvin voorafgaand aan de beeldvorming. Onze gegevens tonen aan dat binnen 1,5 dagen vin heeft geregenereerd tot ongeveer 60%. Deze regeneratie tarief komt overeen met een eerdere studie definiëren van 3 dagen pers een gemiddelde tijd voor staartvin regeneratie in de zebravis larven tot 6 dpf 16. Alternatieve methoden voor agarose kunnen echter worden gebruikt om de vis houder voor beeldvorming. Bijvoorbeeld, dunne plasmastolsels 31 of gefluoreerde ethyleenpropyleen (FEP) buizen bekleed met methylcellulose en gevuld met zeer lage concentraties agarose (0,1%) heeft geadviseerd lichtwaaier microscopie 32 en kan geschikt zijn voor onze gepresenteerde methode. Echter niet aangeraden methylcellulose en 0,1% agarose, omdat hiervoor dat het monster worden aangebracht op de bodem van de kamer door het ontbreken van stolling van deze media. Zeer hoge concentraties van methylcellulose zal bovendien genereren luchtzakken gebaseerd op onze ervaring, en deze kunnen interfereren met de beeldvorming procedure. Als deze media de voorkeur met behulp van de onderste kamer, is het belangrijk dat een geschikte werkafstand tussen de objectieflens en het monster aanwezig is. Opgemerkt moet worden dat methylcellulose als fixeermiddel wordt alleen aanbevolen gedurende 1 dag, omdat het kan interfereren met larvale gezondheid 32.

Montage van het monster in de deksel kan een langzame zwaartekracht neerwaarts drift. Het wordt daarom aanbevolen om de afbeelding meerdere secties op elk tijdstip, die ofwel kunnen worden geprojecteerd in een enkel vlak of alleen afbeeldingen die in het brandvlak kan voor de montage van de uiteindelijke film worden geëxtraheerd. Beeldvorming van het monster op de onderste kamer kan een alternatieve methode om mogelijke neerwaartse drift te voorkomen. Plasma stolsels kan nuttig drift te voorkomen, aangezien het plasma zal vasthouden aan de buitenste omhullende laag (EVL, periderm) 31 en derhalve kan het monster stabiliseren. Dit moet echter worden getest, en hoe lang larvale zebravis in plasma klonters kan worden gehandhaafd zonder te interfereren met larven gezondheid of fin regeneratie.

De film werd geassembleerd met gebruikmaking afzonderlijke secties (26 um)van een opgenomen z-stack die de volledige dikte van de vin (-10 pm) en die in de beeldvormingsprocedure verwerkt potentiële z-drift van de vin bedekt. Om 3-D gegevens bewaren, is het ook mogelijk om z-stacks in afzonderlijke beelden projecteren. Dit kan leiden in wazigheid van de afbeelding, kan helderveld deconvolutie gewenst. Software, zoals Deconvolutie of AutoQUANT X3 kan worden gebruikt voor dit doel. Alternatief kan wiskundige algoritmen (in Tadrous 33 beschreven) worden toegepast voor het verkrijgen van een point-spread functie van hoge signaal-ruisverhouding (SNR). Het verkrijgen van een hoge SNR is een van de belangrijkste hindernissen in helderveld deconvolutie. Hoewel deze methode vereist een hoog contrast en dun monsterdikte, zou het passend zijn voor de beeldvorming van de staartvin te wijten zijn aan zijn gereduceerde breedte.

Een duidelijk voordeel van het gepresenteerde beeldvormende methode is dat het snel aanpasbaar aan een stereomicroscoop uitgerust met een CCD-camera eend time-lapse-software en biedt een low-cost alternatief voor duurdere confocale beeldvormende systemen. Hoewel deze methode geen fluorescentie voor mobiele detectie gebruik kan worden verlengd voor dergelijke toepassingen door gebruik van een geautomatiseerd rolluiksturing en post-imaging deconvolutie software 34. Dit zou kunnen gebruikers aantekenen wondherstel en herstelprocessen met enkele cel of subcellulaire resolutie over langere perioden.

De optische helderheid en het gemak waarmee de embryonale en larvale zebravis kan worden behandeld, en het aanpassingsvermogen van deze methode om elke stereomicroscoop maakt het geschikt voor het aanleren van basisvaardigheden vertebratenbiologie in een klaslokaal. Deze methode kan studenten een beter begrip van de fundamentele biologische processen die ten grondslag liggen weefselherstel en regeneratie. Andere biologische processen die zijn gevangen met een soortgelijke methode zebravis embryonale ontwikkeling 23,34 en cardialefunctie (niet gepubliceerd). Deze werkwijze biedt de mogelijkheid toezicht wondherstel en regeneratie larven die genetisch en farmacologisch gemanipuleerd.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken de MDI Biological Laboratory dierenkernservicefaciliteit voor het onderhoud van zebravissen. Onderzoek dat in deze publicatie is gerapporteerd, werd ondersteund door Institutional Development Awards (IDeA) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder subsidienummers P20GM104318 (voor COBRE) en P20GM103423 (INBRE) en het Department of Defense – USAMRAA (W81XWH-BAA-1)-subsidie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents
Bullseye AgaroseMidSciBE-GCA500
Low-melt agaroseFisher BioReagentsBP1360-100
1-phenyl-2-thioureaAlfa AesarL06690
Instant Ocean Aquarium SaltDierenwinkel
Methyleenblauw (0,1% oplossing)SigmaM9140
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat)Sigma-AldrichE10505
2-FenoxyetanolSigma-Aldrich77699
Petrischaal 35 x 15 mmBD Falcon351008
Petrischaal 60 x 15 mmBD Falcon351007
Petrischaal 100 x 25 mmBD Falcon351013
5,75 inch borosilicaat glazen pipetsFisher
35 mm glazen schaal met glazen bodem (Glas: 0,085-0,115mm)MatTek CorporationD35-20-0-TOP
Superfrost/Plus microscoopglaasjesFisherbrand12-550-15
Glazen dekglasjesElectron Microscopy Services72191-75
Glazen dekglasjesWarner InstrumentsCS-18R15
Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal - 48"Home Depot
Hoge vacuumplooiDow Corning
Microloader pipetten tips 20 µlEppendorf930001007
Fijne schaar - Sterk gebogenFine Science Tools14037-10
3 ml Luer-Lok™ wegwerpspuitBD309657
60 ml Luer-Lok™ wegwerpspuitBD309653
23 G spuitnaaldenBD305145
Dumont #5 PincetFine Science Tools11295-00
Equipment
LabDoctor Mini Dry BathMidSci
Discovery.V12 compound microscoopZeiss
Plan Apo S 3.5X objectiefZeiss
AxioCam MRmZeiss
Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011)Zeiss

Referenties

  1. San Miguel-Ruiz, J. E., García-Arrarás, J. E. Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumber Holothuria glaberrima. BMC Dev Biol. 7, 115(2007).
  2. Poss, K. D., Keating, M. T., Nechiporuk, A. Tales of regeneration in zebrafish. Dev Dyn. 226, 202-210 (2003).
  3. Akimenko, M. A., Marí-Beffa, M., Becerra, J., Old Géraudie, J. Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration. Dev Dyn. 226, 190-201 (2003).
  4. Slack, J. M. Regeneration research today. Dev Dyn. 226, 162-166 (2003).
  5. Seifert, A. W., et al. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561-565 (2012).
  6. Goss, R. J., Grimes, L. N. Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes. J Morphol. 146, 533-542 (1975).
  7. Williams-Boyce, P. K., Daniel, J. C. Comparison of ear tissue regeneration in mammals. J Anat. 149, 55-63 (1986).
  8. Allan, C. H., et al. Tissue response and Msx1 expression after human fetal digit tip amputation in vitro. Wound Repair Regen. 14, 398-404 (2006).
  9. Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
  10. Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Dev Biol. 315, 125-135 (2008).
  11. Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Res C Embryo Today. 84, 265-280 (2008).
  12. Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
  13. Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M. Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish. Development. 121, 347-357 (1995).
  14. Reginelli, A. D., Wang, Y. Q., Sassoon, D., Muneoka, K. Digit tip regeneration correlates with regions of Msx1 (Hox 7) expression in fetal and newborn mice. Development. 121, 1065-1076 (1995).
  15. Brien, G. S., et al. Coordinate development of skin cells and cutaneous sensory axons in zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 520, 816-831 (2012).
  16. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev Dyn. 231, 693-699 (2004).
  17. Yoshinari, N., Ishida, T., Kudo, A., Kawakami, A. Gene expression and functional analysis of zebrafish larval fin fold regeneration. Dev Biol. 325, 71-81 (2009).
  18. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, Univ of Oregon Press. Eugene. (2000).
  19. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, part A. Preface. Methods Cell Biol. 100 (13), (2010).
  20. Dahm, N. -V. a Zebrafish: A Practical Approach, Issue 975. , reprint, Oxford University Press. 303(2002).
  21. The Zebrafish: 2nd Edition Genetics, Genomics and Informatics. Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. , 2nd, (2005).
  22. Concha, M. L., Adams, R. J. Oriented cell divisions and cellular morphogenesis in the zebrafish gastrula and neurula: a time-lapse analysis. Development. 125, 983-994 (1998).
  23. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. CSH Protoc. 2007, (2007).
  24. Kulesa, P. M., Kasemeier-Kulesa, J. C. Construction of a Heated Incubation Chamber around a Microscope Stage for Time-Lapse Imaging. CSH Protoc. 2007, (2007).
  25. Bitplane. Imaris V 6.1.0 Reference Manual. , (2008).
  26. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. , Biophotonics International. 36-42 (2004).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  28. Mateus, R., et al. In vivo cell and tissue dynamics underlying zebrafish fin fold regeneration. PLoS One. 7, e51766(2012).
  29. Jones, E. A., et al. et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
  30. Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., Köster, R. W. Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons. PLoS Biol. 7, e1000240(2009).
  31. Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).
  32. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
  33. Tadrous, P. J. A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution. J Microsc. 237, 192-199 (2010).
  34. Distel, M., Babaryka, A., Köster, R. W. Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy. Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Regeneratie van de staartvintime lapse imagingwondgenezingamputatie van de vinbeeldanalysestereomicroscopielarvale ontwikkeling
Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.