De bouw van het Cell gebaseerde neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) voor optische detectie van neurotransmitters In Vivo

Emre Lacin; Arnaud Muller; Marian Fernando; David Kleinfeld; Paul A. Slesinger

doi:10.3791/53290

Methodenartikel

De bouw van het Cell gebaseerde neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) voor optische detectie van neurotransmitters In Vivo

DOI:

10.3791/53290

⸱

12 mei 2016

Emre Lacin¹ , Arnaud Muller² , Marian Fernando¹ , David Kleinfeld²^,³ , Paul A. Slesinger¹

¹Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ²Department of Physics, University of California, San Diego, ³Section of Neurobiology, University of California, San Diego

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol om op cellen gebaseerde neurotransmitter fluorescerende engineered reporters (CNiFERs) te creëren voor de optische detectie van volumetrische neurotransmitter release.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celgebaseerde neurotransmitter fluorescente reporters gemanipuleerd (CNiFERs) een nieuw instrument voor neurologen optisch detecteren van de afgifte van neurotransmitters in de hersenen in vivo. Een specifieke CNiFER werd uit een humane embryonale niercellijn die stabiel tot expressie brengt een specifieke G-eiwit gekoppelde receptor, die paren _{Gq / 11} G-eiwitten, en een op FRET gebaseerde Ca2 ⁺ -detector, TN-XXL. Activering van de receptor leidt tot een verhoging van het FRET signaal. CNiFERs hebben nM gevoeligheid en een temporele respons seconden omdat CNiFER kloon maakt gebruik van de natuurlijke receptor voor een bepaalde neurotransmitter, bijvoorbeeld D2R voor dopamine. CNiFERs worden direct geïmplanteerd in de hersenen, waardoor zij neurotransmitter afgifte zin met een ruimtelijke resolutie van minder dan honderd micrometer, waardoor ze ideaal volume transmissie in vivo meten. CNiFERs kan ook worden gebruikt om andere middelen te onderzoeken op mogelijke kruisreactiviteit in vivo. We hebben onlangs breidde de familie van CNiFERs om GPCR's omvatten die koppelen aan G _{i / o} G-eiwitten. CNiFERs zijn beschikbaar voor het detecteren van acetylcholine (ACh), dopamine (DA) en norepinefrine (NE). Aangezien elke GPCR kan worden gebruikt om een nieuwe maken CNiFER en dat er ongeveer 800 GPCRs in het menselijk genoom beschrijven we hier de algemene procedure voor het ontwerpen, realiseren en testen elk type CNiFER.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om volledig te begrijpen hoe neuronen communiceren in de hersenen, is het noodzakelijk om een werkwijze voor de afgifte van neurotransmitters in vivo te meten. Er zijn verschillende gevestigde technieken voor het meten neurotransmitters in vivo. Een algemeen gebruikte techniek is microdialyse, waarin een canule in de hersenen is geplaatst en een kleine hoeveelheid cerebrospinale vloeistof wordt verzameld en geanalyseerd met behulp van hoge-prestatie vloeistofchromatografie en elektrochemische detectie ^1. Microdialyse een ruimtelijke resolutie in de orde van enkele diameter van de sonde, bijvoorbeeld ~ 0,5 mm voor een 200 urn diam....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie zijn in overeenstemming met Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen, en zijn door de IACUCs aan de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï en de University of California, San Diego goedgekeurd.

1. Genereren GPCR tot expressie Lentivirus te transformeren HEK293 cellen

Verkrijgen het cDNA voor een specifieke GPCR uit een commerciële bron, bijvoorbeeld cdna.org. Alternatief versterken het GPCR-gen uit een cDNA bibliotheek met behulp van PCR. Het verkrijgen van een lentivirus tot expressie vector, zoals pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro (pCDH). Met deze vector het DNA verspreide....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een CNiFER is afgeleid van een humane embryonale niercellen (HEK293) cellen die is ontworpen om ten minste twee eiwitten stabiel tot expressie: een specifieke G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) en een genetisch gecodeerd [Ca2 ^+] opnemer, TN-XXL. TN-XXL ondergaat fluorescentie-energieoverdracht (FRET) tussen cyaan en geel fluorescerende eiwitten, eCFP en citroengeel, respectievelijk, in reactie op Ca2 ⁺ -ionen ^6,15. Activering van GPCR's die endogeen <.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De oprichting van CNiFERs een innovatieve en unieke strategie voor het optisch meten van afgifte van neurotransmitters in de hersenen in vivo. CNiFERs zijn ideaal voor het meten extrasynaptic afgifte, dat wil zeggen, volume geleiding voor neurotransmitters. Moet voor elk CNiFER bezit de eigenschappen van de natieve GPCR, die een fysiologische optisch meten van de veranderingen in niveaus van neurotransmitters in de hersenen. Tot op heden zijn CNiFERs gemaakt voor het detecteren van acetylcholine (M1-CN.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken B. Conklin (University of California, San Francisco) voor het verstrekken van de G _qi5 en G _qs5 cDNAs, A. Schweitzer voor hulp bij de elektronica, N. Taylor voor hulp bij het screenen van klonen, Ian Glaaser en Robert Rifkin voor proeflezen en Olivier Griesbeck voor TN-XXL. Dit werk werd ondersteund door subsidies voor onderzoek door het Amerikaanse National Institute on Drug Abuse (NIDA) (DA029706; DA037170), het Nationaal Instituut voor Biomedische beeldvorming en Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) en de "Neuroscience gerelateerd aan drugs "training subsidie door middel van NIDA (DA007315).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro	System Biosciences	CD510B-1	Cloning: voor het genereren van lentivirus
12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube	BD Biosciences	352063	FACS
BD 40 um Falcon cell strainers	BD Biosciences	352340	FACS
0.05% Trypsin EDTA	Invitrogen	25200056	FACS
96 Well Plate, flat bottom, clear	Corning	3596	FACS
96 well cell culture plates	Corning	CLS3997	Flexstation
Optilux black clear bottom	Corning	3603	Flexstation
Flexstation pipet tips	Molecular Devices	9000-0911	Flexstation
Acetylcholine Chloride	Sigma-Aldrich	A2661	Flexstation
Norepinephrine	Sigma-Aldrich	A7256	Flexstation
Dopamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	PHR1090	Flexstation
GABA	Sigma-Aldrich	A2129	Flexstation
Histamine	Sigma-Aldrich	H7125	Flexstation
Glutamate	Sigma-Aldrich	49621	Flexstation
Epinephrine	Sigma-Aldrich	E4642	Flexstation
Somatostatin	Sigma-Aldrich	S1763	Flexstation
5HT	Sigma-Aldrich	H9523	Flexstation
VIP	Alpha Diagnostics Inc.	SP-69627	Flexstation
Orexin A	Alpha Diagnostics Inc.	12-p-01	Flexstation
Substance P	Sigma-Aldrich	S6883	Flexstation
Adenosine	Sigma-Aldrich	A4036	Flexstation
Melatonin	Sigma-Aldrich	M5250C	Flexstation
Fluorescence Plate Reader & software	Molecular Devices	Flexstation 3	Flexstation
DMEM (high glucose) with Glutamax	Life Technologies	10569-010	Weefselkweek
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082-139	Weefselkweek
Pen/Strep antibiotics	Life Technologies	15140-122	Weefselkweek
Puromycin	InvivoGen	ant-pr-1	Weefselkweek
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	Weefselkweek
CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box	Bioexpress	D-3508)	Weefselkweek
cyanoacrylate glue	Loctite	Loctite no. 495	chirurgie en stereotactische injectie
plastic paraffin film	VWR	Parafilm®	chirurgie en stereotactische injectie
Nanoinjector	Drummond	3-000-204	chirurgie en stereotactische injectie
Glass electrodes	Drummond	3-000-203G	chirurgie en stereotactische injectie
hand held drill	OSADA	Exl-M40	chirurgie en stereotactische injectie
Burrs for drill	Fine Scientific	19007-05; 19007-07)	chirurgie en stereotactische injectie
Sterilizing bath	FST	18000-45, Hot Bead Sterilizer	chirurgie en stereotactische injectie
isoflurane chamber/mask	Highland Medical Equipment	564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm	chirurgie en stereotactische injectie
3D scope with arm	Zeiss		chirurgie en stereotactische injectie
fiber optic light			chirurgie en stereotactische injectie
Betadine			chirurgie en stereotactische injectie
70 % (v/v) isopropyl alcohol			chirurgie en stereotactische injectie
Povidone-Iodine Prep Pads	dynarex	1108	chirurgie en stereotactische injectie
NaCl 0.9% (injectie, USP, 918610)			chirurgie en stereotactische injectie
CYCLOSPORINE (INJECTIE, USP)			chirurgie en stereotactische injectie
Buprenex (injectie) buprenorphine (0,03 μg per g knaagdier)	Sigma-Aldrich		chirurgie en stereotactische injectie
Ophthalmic ointment	Akorn	NDC 17478-235-35	chirurgie en stereotactische injectie
Surgifoam	Ethicon		chirurgie en stereotactische injectie
Grip dental cement	Dentsply	#675571, 675572	chirurgie en stereotactische injectie
Instant SuperGlue	NDindustries		chirurgie en stereotactische injectie
LOCTITE 4041			chirurgie en stereotactische injectie
METABOND	C&B		chirurgie en stereotactische injectie
no. 0 cover glass	Fisher		chirurgie en stereotactische injectie
stereotaxic frame	Kopf		chirurgie en stereotactische injectie
Rectal probe and heating pad	FHC	40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe	chirurgie en stereotactische injectie
optical breadboard for imaging	Thorlabs		chirurgie en stereotactische injectie
Mineral oil	Fisher	S55667	chirurgie en stereotactische injectie
Kwik-Cast (Silicone elastomer)	World Precision Instruments		chirurgie en stereotactische injectie
Suture	Ethicon	18’’, 1667, 4-0	chirurgie en stereotactische injectie
Scissors	Fine Scientific Tools	91500-09, 15018-10	chirurgie en stereotactische injectie
Forcepts	Fine Scientific Tools	11252-30;

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems. Methods. 23, 21-39 (2001).
Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammet....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CNiFERs Neurotransmitter Detection GPCR Receptors FRET Calcium Sensor HEK293 Cells Lentivirus Infection FACS Analysis Dose Response Curve In Vivo Injection Two Photon Imaging

De bouw van het Cell gebaseerde neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) voor optische detectie van neurotransmitters In Vivo

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Inleiding

Protocol

Resultaten

Discussie

Openbaarmakingen

Dankbetuigingen

Materialen

Referenties

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gerelateerde artikelen