De bouw van het Cell gebaseerde neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) voor optische detectie van neurotransmitters In Vivo

Samenvatting

We presenteren een protocol om op cellen gebaseerde neurotransmitter fluorescerende engineered reporters (CNiFERs) te creëren voor de optische detectie van volumetrische neurotransmitter release.

Samenvatting

Celgebaseerde neurotransmitter fluorescente reporters gemanipuleerd (CNiFERs) een nieuw instrument voor neurologen optisch detecteren van de afgifte van neurotransmitters in de hersenen in vivo. Een specifieke CNiFER werd uit een humane embryonale niercellijn die stabiel tot expressie brengt een specifieke G-eiwit gekoppelde receptor, die paren _{Gq / 11} G-eiwitten, en een op FRET gebaseerde Ca2 ⁺ -detector, TN-XXL. Activering van de receptor leidt tot een verhoging van het FRET signaal. CNiFERs hebben nM gevoeligheid en een temporele respons seconden omdat CNiFER kloon maakt gebruik van de natuurlijke receptor voor een bepaalde neurotransmitter, bijvoorbeeld D2R voor dopamine. CNiFERs worden direct geïmplanteerd in de hersenen, waardoor zij neurotransmitter afgifte zin met een ruimtelijke resolutie van minder dan honderd micrometer, waardoor ze ideaal volume transmissie in vivo meten. CNiFERs kan ook worden gebruikt om andere middelen te onderzoeken op mogelijke kruisreactiviteit in vivo. We hebben onlangs breidde de familie van CNiFERs om GPCR's omvatten die koppelen aan G _{i / o} G-eiwitten. CNiFERs zijn beschikbaar voor het detecteren van acetylcholine (ACh), dopamine (DA) en norepinefrine (NE). Aangezien elke GPCR kan worden gebruikt om een ​​nieuwe maken CNiFER en dat er ongeveer 800 GPCRs in het menselijk genoom beschrijven we hier de algemene procedure voor het ontwerpen, realiseren en testen elk type CNiFER.

Inleiding

Om volledig te begrijpen hoe neuronen communiceren in de hersenen, is het noodzakelijk om een werkwijze voor de afgifte van neurotransmitters in vivo te meten. Er zijn verschillende gevestigde technieken voor het meten neurotransmitters in vivo. Een algemeen gebruikte techniek is microdialyse, waarin een canule in de hersenen is geplaatst en een kleine hoeveelheid cerebrospinale vloeistof wordt verzameld en geanalyseerd met behulp van hoge-prestatie vloeistofchromatografie en elektrochemische detectie ^1. Microdialyse een ruimtelijke resolutie in de orde van enkele diameter van de sonde, bijvoorbeeld ~ 0,5 mm voor een 200 urn diameter microprobe. De tijdsresolutie van deze techniek is echter traag vanwege sampling intervallen die duren meestal ~ 5 min of meer ^1. Bovendien zijn analyses niet in real-time. Een andere techniek is snel scannen cyclische voltammetrie (FSCV), die een koolstofvezel sonde die in de hersenen wordt ingevoegd gebruikt. FSCV heeft uitstekende temporale resolutie (subsecond), hoge gevoeligheid (nanomolair), en ruimtelijke resolutie met een diameter van de sonde van 5 tot 30 pm. Echter, FSCV beperkt tot zenders die een karakteristiek oxidatie en reductie profiel met spanning te produceren op een koolstofatoom potentiometrische probe ^2.

Een derde techniek om neurotransmitters te meten is rechtstreeks via genetisch-gecodeerde neurotransmitter (NT) biosensoren ^3. Bij deze methode wordt een fusie-eiwit gevormd dat een ligand bindend domein een zender gekoppeld met een fluorescentie-energieoverdracht (FRET) gebaseerde paar fluoroforen ⁴ of ⁵ gepermuteerde GFP bevat. In tegenstelling tot de vorige twee werkwijzen worden deze biosensoren genetisch gecodeerde en tot expressie gebracht op het oppervlak van een gastheercel, zoals een neuron, door de productie van transgene dieren of acuut bij gebruik van virale middelen om cellen te infecteren. Tot op heden zijn genetisch gecodeerd biosensoren is alleen ontwikkeld voor detecting glutamaat en GABA ^3-5. Beperkingen met deze technieken de lage gevoeligheid, in het nM bereik, en het onvermogen om de detectie uit te breiden naar het grote aantal zenders, bijvoorbeeld klassieke neurotransmitters, neuropeptiden en neuromodulators, welk signaal door middel van G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn. In feite, zijn er bijna 800 GPCRs in het menselijk genoom.

Om deze tekortkomingen aan te pakken, hebben we een innovatief hulpmiddel om optisch maatregel vrijkomen van neurotransmitter die door middel van een GPCR signaleert ontwikkeld. CNiFERs (cell-based neurotransmitter fluorescente reporters gemanipuleerde) zijn klonale HEK293 cellen ontworpen om een specifieke GPCR dat, wanneer gestimuleerd, veroorzaakt een toename van intracellulaire [Ca2 ^+] die wordt gedetecteerd door een genetisch gecodeerde FRET gebaseerde Ca2 ⁺ sensor drukken, TN-XXL. Aldus CNiFERs transformeren neurotransmitter receptor binding in een verandering in fluorescentie, een directe en real-time optische read-out van de lokale neurotransmitter activiteit. Door gebruikmaking van de natuurlijke receptor voor een bepaalde neurotransmitter, CNiFERs behouden chemische specificiteit, affiniteit en temporele dynamiek van het endogeen tot expressie receptoren. Tot op heden zijn er drie soorten CNiFERs, één voor het detecteren van acetylcholine met de M1 receptor, één voor het detecteren van dopamine aangemaakt met de D2-receptor en één voor het detecteren van norepinefrine met de receptor α1a ^6,7. De CNiFER technologie is gemakkelijk uitbreidbaar is, waardoor het vatbaar voor elk type GPCR. In dit artikel Jupiter beschrijven we en illustreren de werkwijze voor het ontwerpen, realiseren en testen in vivo CNiFERs voor elke toepassing.

Protocol

Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie zijn in overeenstemming met Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen, en zijn door de IACUCs aan de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï en de University of California, San Diego goedgekeurd.

1. Genereren GPCR tot expressie Lentivirus te transformeren HEK293 cellen

1. Verkrijgen het cDNA voor een specifieke GPCR uit een commerciële bron, bijvoorbeeld cdna.org. Alternatief versterken het GPCR-gen uit een cDNA bibliotheek met behulp van PCR. Het verkrijgen van een lentivirus tot expressie vector, zoals pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro (pCDH). Met deze vector het DNA verspreiden en aan lentivirus genereren.
2. Kloon de GPCR cDNA in de lentivirus expressie vector door PCR. Zie Lorenz ^8, voor meer informatie over PCR subklonering.
3. Uit te breiden en te zuiveren van de GPCR-pCDH DNA met behulp van een endotoxine-vrij 'maxi' prep kit volgens de instructies van de fabrikant. Bevestigen dat de GPCR cDNA gesubkloneerd in pCDH is mutatie-vrij door DNA sequentiebepaling.
   Opmerking: Alvorens zijn DNA voor virusproductie verteren een monster met geschikte restrictie-enzym op maat van insert en zuiverheid van DNA te bevestigen.
4. Genereer lentivirus met behulp van een virus kernfaciliteit, zoals een op het Salk Institute, Universiteit van Penn., Of de Universiteit van North Carolina, enz., Of het genereren van in-house ^9. Met ongeveer 25 ug (> 1 ug / ul) endotoxine-vrij DNA voor transfectie van HEK cellen in een T75 fles. Waarborgen dat het DNA van hoge zuiverheid, met een absorptie verhouding _(A260 / _A280) van ~ 1,8.
   Noot: De titers van virus ~ 10 ¹¹ -10 ¹² GC / ml zijn optimaal voor transductie van HEK293 cellen.

2. Het kiezen van HEK293 / TN-XXL Backbone Cell Type voor het kweken van In Vitro

Opmerking: Bepaal de G-eiwit koppelen specificiteit, bijvoorbeeld _{Gi / o, Gq / 11} of G _s G proteïnen van de GPCR, omdat dit dictates of een chimeer G-eiwit is nodig voor de CNiFER. Voor G _q -gekoppelde receptoren, bijvoorbeeld M1 muscarinische receptor, kiest HEK293 / TN-XXL (# 3G8) als de ruggengraat HEK293 celtype. Voor _{Gi / o} -gekoppelde receptoren, wordt het chimere G-eiwit G _qi5 ¹⁰ nodig. Voor G _s -gekoppelde receptor, is de G _qs5 hersenschim nodig ^10. In dit protocol wordt de bouw van een D2R CNiFER als voorbeeld gebruikt. D2R signalen via G _{i / o} G-eiwitten en vereist HEK293 cellen die stabiel het chimere G-eiwit, G _qi5, bijvoorbeeld HEK293 / TN-XXL / G _qi5 _ # qi5.6 uiten.

1. Het verkrijgen van de HEK293 / TN-XXL / G _qi5 _ # qi5.6 klonale cellen uit een onderzoekslaboratorium. Opmerking: De volgende klonale cellen, HEK293 / TN-XXL (# 3G8) voor G _q -gekoppelde receptoren, HEK293 / TN-XXL / G _qi5 (# qi5.6) voor G _{i / o} -gekoppelde receptoren en HEK293 / TN -XXL / G _qs5 (# qs5.47) voor G _s -gekoppelde rereceptoren, zijn op aanvraag ^6,7 vrij beschikbaar.
2. Groeien en uitbreiden HEK293 / TN-XXL / G _qi5 _ # qi5.6 tot ~ 90% confluentie in een T25 kolf met 5 ml HEK293 groeimedia (tabel 1). Groeien de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% (v / v) CO _2.
   Let op: Alle werkzaamheden met het kweken van HEK293 cellen dient te worden uitgevoerd met behulp van standaard steriele weefselkweek technieken.
3. Oogst de HEK293 cellen door eerst opzuigen media uit T25 fles. Was de cellen voorzichtig door toevoeging van 5 ml PBS en schommelen kolf.
4. Verwijder de PBS en voeg 1 ml van 0,05% (w / v) trypsine / EDTA (tabel 2). Incubeer gedurende 1 tot 2 min bij 37 ° C met 5% (v / v) CO _2.
5. Verzamel cellen en overbrengen naar 15 ml conische buis steriel. Centrifugeer 5 min bij 1000 xg in een celkweek centrifuge. Zuig het supernatant.
6. Resuspendeer de celpellet in 5 ml HEK293 groeimedia. Tel de cellen in een hemocytometer gebruikttrypan blauw. Bereken de cel dichtheid en ga verder met stap 3.

3. Lentivirale transductie van HEK293 / TN-XXL / Gqi5 Cells

1. Seed een T25 fles met 0,7 x 10 ⁶ HEK293 / TN-XXL / G _qi5 cellen. Groeien de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% (v / v) CO ₂ tot ~ 50% confluent na ongeveer 1 dag. Freeze overgebleven cellen (stappen 8,2-8,3). Deze cellen zullen dienen als CNiFER control, dwz een CNiFER dat de GPCR mist.
2. Op de dag van de infectie, verdunnen de GPCR tot expressie lentivirus (stap 1,4) tot een uiteindelijke concentratie van 10 ~ ⁹ GC / ml in een totaal volume van 2 ml HEK293 groeimedia (tabel 1). Bijvoorbeeld, voeg 20 gl 10 ¹¹ GC / ml virus 2 ml medium in een T25 fles.
   Opmerking: Het virus titer informatie moet worden verstrekt door het virus kernfaciliteit. Combineer lentivirus en media in een centrifugebuis en vermaal voorzichtig. Hoge titers van lentivirus zijn bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2).
3. Zuig het materiaal uit de T25 fles. Voeg de 2 ml van het virus / media mengsel van stap 3.2. Incubeer de T25 kolf O / N bij 37 ° C met 5% (v / v) CO _2.
4. Na een dag van infectie zuig het virus / Media mengsel en vervangen HEK293 groeimedia bevattende puromycine (2 pg / ml; Tabel 1). Puromycine selecteert op de getransduceerde cellen. Incubeer de kolf bij 37 ° C met 5% (v / v) CO ₂ tot ongeveer 90% confluent na ~ 1-2 dagen.
5. Bereid een 96-putjesplaat (zwart met heldere bodem) bekleed met fibronectine, voor het opwekken van een 10-punts agonist / activatie kromme in stap 4,1. In een steriele kap, voeg 50 ul fibronectine (5 ug / ml) per putje in rijen A en B van de 96-well plaat. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Spoel tweemaal gedurende 5 minuten per spoelen met PBS. Voeg 50 ul van HEK293 groeimedia en geïncubeerd O / N bij 37 ° C met 5% (v / v) CO _2.
   Opmerking: Fibron-Ectin behandelde platen zijn in de handel verkrijgbaar.
6. Oogst de cellen in de T25 kolf zoals beschreven in stappen 2.3-2.6 (tabel 2).
7. Resuspendeer de celpellet in 5 ml HEK293 groeimedia. Seed een T25 fles met 1,5 ml van cellen voor FACS analyse. Ook zaad een T75 fles met 1 ml van de cellen voor het invriezen en opslag (zie stap 8,2-8,3)
8. Voor de 10-punts curve agonist, zaad de eerste twee rijen (A en B) van een met fibronectine gecoate 96-well plaat (uit stap 3.5) met 100 ul van de celsuspensie per putje.
9. Incubeer HEK293 cellen groeien in een T25 fles, een T75 kolf en een 96-well plaat tot ongeveer ~ 90% confluent bij 37 ° C met 5% (v / v) CO ₂ na ~ 1-2 dagen.

4. FACS en isolatie van Single CNiFER Clones

1. Gebruik de 96-well plaat voor het opwekken van een 10-punts curve agonist activering.
   Opmerking: Voordat fluorescentie geactiveerde celsortering analyse (FACS), is het belangrijk om het bevestigenexpressie van de GPCR door het testen getransduceerde cellen voor een agonist respons (10-punts curve agonist). Deze test wordt uitgevoerd met een fluorometrische plaat reader.
   1. Bereid een medicijn plaat voor de 10-punts agonist activering curve. Kies 10 verschillende concentraties agonist beugel de voorspelde EG _50, die kan worden bepaald uit de literatuur.
      Opmerking: De drug plaat bevat 3-voudige van elke concentratie (in tweevoud) aan te passen voor de 1: 3 verdunning in de CNiFER plaat. Bijvoorbeeld, het geneesmiddel dienblad testen van een D2 CNiFER bevat 10 verschillende concentraties van dopamine bij 3-voudige concentraties; 0,2, 0,5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50 en 1000 nM. In de CNiFER plaat derhalve de eindconcentraties van dopamine zijn 0,067, 0,167, 0,333, 1,00, 1,67, 3,33, 6,67, 10,0, 16,7 en 333 nM.
   2. Bereid de agonist oplossingen met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) (Tabel 1). Gebruik twee putjes "ACSF", bijvoorbeeld, A1 en A2,en twee putjes "geen cellen, bijvoorbeeld, B1 en B2.
      Opmerking: Bereid verschillende concentraties van geneesmiddelen een seriële verdunningsmethode. Een sjabloon volgen CNiFER klonen en geneesmiddelconcentraties (figuur 3) te houden.
   3. Gebruik de software om de 96-well fluorometrische plaatlezer voor het meten van FRET en het uitvoeren van transfers oplossing te programmeren.
      1. Stel de plaatlezer temperatuur tot 37 ° C.
      2. Voor het meten van FRET met TN-XXL, stelt de excitatie golflengte 436 ± 4,5 nm (midden ± HWHM). Stel de emissie filters om 485 ± 7,5 nm voor eCFP en 527 ± 7,5 nm voor Citrine. Stel de cutoff filter tot 475 en 515 nm voor eCFP en Citrine, respectievelijk.
      3. Programmeer de plaat lezer om emissie te meten bij 485 nm en 527 nm om de 4 seconden voor een totaal van 180 sec. Kies de optie om 50 ul bevrijden van de 3-voudige drug plaat om de 100 ul in de CNiFER plaat, na het verzamelen van 30 secbasislijn fluorescentie.
   4. Zuig het medium van rijen A en B en voeg 100 ul van ACSF de 96-well plaat met CNiFER ~ 90% confluent (stap 3,9).
   5. Laad de 96-well CNiFER bord en de '3-voudige' drug plaat in de plaat lezer. Sta ~ 30 min aan de platen equilibreren bij 37 ° C. Vervolgens start het programma.
   6. Om plaatlezer gegevens te analyseren, de uitvoer van de fluorescentie waarden naar een spreadsheet. Maak een formule om de achtergrond metingen (genomen voor elk signaal uit putten zonder cellen) uit putten met CNiFERs aftrekken. Normaliseren fluorescentie-intensiteiten voor een pre-stimulus basislijnen, F _Citrine (t) / F _Citrine (baseline), en bereken de FRET-ratio (AR / R;. Vergelijking 1) met de piek reacties bij 527 nm en 485 nm emissies (zie stap 11 ).
      Opmerking: Als er een significante verandering van AR / R met de agonist, dan geeft dit blijk van de GPCR en men kan overgaan tot de FACS analyse (stap 4,2). Als there is geen FRET respons met agonist, oplossen door gebruik te maken van een Ca ²⁺ ionofoor, bijvoorbeeld, A21387, de Ca ²⁺ respons te testen en te bevestigen dat FRET-gebaseerde sensor werkt. Als de ionofoor werkt, dan is de receptor niet tot expressie waarschijnlijk.
2. Op de dag voor FACS bereiden vier 96-putjesplaten bekleed met fibronectine (zie stap 3,5) voor het verzamelen van de cellen gesorteerd. Voeg 50 ul van HEK293 groeimedia en geïncubeerd O / N bij 37 ° C met 5% (v / v) CO _2.
3. Bereid 5% (w / v) BSA in PBS (5 g / 100 ml) en filter (0,2 pm) in een steriele fles.
4. Oogst de cellen gekweekt in T25 kolf (zie stap 2,3-2,5, Tabel 2). Resuspendeer de celpellet in 4 ml 5% (w / v) BSA in PBS. Centrifugeer de cellen bij 1000 g gedurende 5 min.
5. Zuig het medium en resuspendeer de celpellet in ~ 5 ml van 5% (w / v) BSA in PBS tot een eindconcentratie van 5 x 10 ~ ⁶ cellen / ml.
   Opmerking: Informeer bij de FACS kernfaciliteit voor specifieke eisen aan celdichtheid en sorteren omstandigheden.
6. Filter de geresuspendeerde cellen met een 40 micrometer cel zeef om de klonten te verwijderen. Overdracht van de cellen aan een 5 ml polypropyleen ronde bodem buis. Plaats de buis op ijs voor transport naar de FACS faciliteit.
7. Sorteren getransduceerde HEK293 cellen bij een FACS faciliteit. Programmeer de parameters op een FACS flowcytometer als volgt: set 4 ° C gedurende de monsterhouder, 100 urn voor het mondstuk en 20 psi. Op basis van de pre-sort analyse, selecteert u de cellen, dat wil zeggen, kies dan een 'gate', dat een groot eCFP fluorescentie (eCFP excitatie, eCFP emissie) en grote FRET (eCFP excitatie, Citrien emissie) fluorescentie (zie resultaten hieronder, Figuur 2 ).
8. Storting individu gesorteerd cellen in een 96-well plaat bereid in stap 4,2, met één kloon per putje 50 pl HEK293 groeimedia met puromycine. Voeg 50 ul van HEK293 groeimedia met puromycine (Table 1) voor een totaal van 100 gl per putje. Handhaaf cellen O / N bij 37 ° C met 5% (v / v) CO _2.
   Opmerking: HEK293 groeimedia bevat puromycine voor de selectie van getransduceerde cellen.

5. Het kweken en uitbreiding van gesorteerde, klonen CNiFERs

1. Handhaaf de CNiFERs in de 96-well platen door het verwijderen van 50 pl oude media uit elk putje en vervangen door 50 pi vers HEK293 groeimedia bevattende puromycine (tabel 1). Herhaal dit elke 5-7 dagen tot ~ 90% confluent na 2-3 weken.
2. Harvest CNiFER cellen door voorzichtig opzuigen van de media en spoelen eenmaal voorzichtig met PBS. Verwijder de PBS en voeg 20 ul van 0,05% (w / v) trypsine / EDTA. Incubeer gedurende 1 tot 2 min bij 37 ° C met 5% (v / v) CO _2.
3. Voeg 100 ul van HEK293 groeimedia naar trypsine behandelde cellen en resuspendeer de cellen. Transfer inhoud van een 24-well plaat met 400 ul vers HEK293 groeimedia with puromycine. In de 24-well plaat, behouden cellen door het vervangen 250 pl HEK293 groeimedia elke 5-7 dagen tot putten ~ 90% confluent.

6. Identificeer kandidaat CNiFERs Op basis van FRET Response gebruik van Fluorometric Plate Reader

Opmerking: Met vier 96-well platen na FACS, er moet> 100 testbare klonen die overleven en breiden de 24-well plaat fase, omdat veel van de oorspronkelijke klonen onvoldoende groeien. Om potentiële kandidaat CNiFERs identificeren, gebruik maken van een 3-punts-analyse voor de FRET respons met verwante agonist, bijvoorbeeld dopamine voor D2R.

1. Wanneer de cellen ~ 90% confluent in 24-well plaat, Zuig voorzichtig de media. Voeg ~ 100 ul van 0,05% (w / v) trypsine / EDTA en incubeer gedurende 1-2 minuten bij 37 ° C met 5% (v / v) CO _2. Voeg 400 ul van HEK293 groeimedia naar trypsine behandelde cellen en meng de cellen door voorzichtig trituratie.
2. Het opzetten van de 3-punts-agonist curve voor de eerste screening van de clones. Voor elke CNiFER kloon, dat wil zeggen, één van de putjes van de 24-well plaat, monster 100 pl van de celsuspensie (~ 4 x 10 ³ cellen / putje) in elk van drie putjes, bijvoorbeeld A1, A2, A3, van een met fibronectine gecoate 96-well plaat (zwart met heldere bodem) (zie stap 3,5).
3. Draagt ​​de resterende ~ 200 ul van de celsuspensie aan een 12-well plaat met 1000 pi HEK293 groeimedia (1,2 ml eindvolume). Incubeer beide platen bij 37 ° C met 5% (v / v) CO _2, tot ~ 90% confluent. De 96-well plaat is voor de fluorometrische assay en de 12-well plaat is voor het kweken en uitbreiden van de klonen.
4. Voor de 3-point analyse, bepalen drie verschillende concentraties van agonist die 0,1-, 1,0- en 10-maal de _EC50 voor de specifieke GPCR. Bereid agonist concentraties in een drug plaat zoals beschreven in de stappen 4.1.1-4.1.2. Voer een fluorometrische plaat reader test zoals beschreven in de stappen 4.1.3-4.1.5.
5. Bereken de FRET-verhouding (AR / R) zoals beschreven in stap 4.1.6. Kies CNiFERs passende gevoeligheid en grootste FRET respons voor expansie, bevriezen terug en uitgebreidere analyse (stap 7).
6. Voor de klonen die werden geselecteerd in stap 6,5 en groeien in de 12-well plaat, verwijderen en vervangen 600 ul van de HEK293 groeimedia elke 5 tot 7 dagen, tot ~ 90% confluent.
7. Geleidelijk de klonen uit een 12-wells plaat uitbreiden tot een 6-well plaat, en dan naar een T25 kolf (stappen 2,3-2,6 en tabel 2). Wanneer de T25 kolf ~ 90% confluent, oogst cellen zoals beschreven (stappen 2.3-2.5). Resuspendeer de celpellet in 5 ml HEK293 groeimedia.
8. Voeg 1 ml celsuspensie met een T75 kolf met 9 ml HEK293 groeimedia. Met de resterende 4 ml van de celsuspensie voor cryobescherming en opslag in vloeibare _N2 (stappen 8,2-8,3). Bereid acht 1,5 ml cryotubes en plaats op ijs.
9. In de T75 kolf te handhaven cellen door vervanging van de media wet verse HEK293 groeimedia, bv 10 ml elke 3-5 dagen tot 70-80% samenvloeiing na ~ 1-2 weken.

7. definitieve selectie van CNiFER Clones behulp Fluorometric Plate Reader

1. Op de dag voor de plaat lezer test:
   1. Oogst cellen van een ~ 90% confluent T75 kolf (zie stap 2,3-2,6, tabel 2). Zaad een 96 putjes met fibronectine gecoate plaat (zwart met heldere bodem) en 5 x 10 ⁴ / putje met ~ 100 pi celsuspensie. Opmerking: Eén kloon wordt verdeeld in een 96-well plaat.
2. Bereid een medicijn plaat voor de uitgebreide screening van CNiFER klonen, waarbij onderscheid wordt specifieke agonist reacties van niet-specifieke CNiFER reacties.
   1. Een volledige dosis-respons curve te genereren, selectie van 10 agonist concentraties rond de verwachte ₅₀ EC. Gebruik twee putten voor 'geen cellen' en twee putten voor 'ACSF'.
   2. Voor het bepalen van de niet-specifieke antwoorden, kiezen three concentraties van 12 verschillende neurotransmitters of modulatoren (72 putjes) (figuur 3). Net als de agonist, het medicijn plaat bevat 3-voudige concentraties in tweevoud. Bijvoorbeeld 100 gl drie verschillende concentraties van acetylcholine, glutamaat, orexin, VIP, adenosine, serotonine, noradrenaline, GABA, Substantie P, melatonine, somatostatine en histamine, telkens in een 3-voudige concentratie van 50, 1000, en 3000 nM wordt geladen in de 96-well plaat drug.
3. Stel de parameters op de fluorometrische plaat lezer voor het meten van FRET en het uitvoeren van transfers oplossing zoals beschreven in de stappen 4.1.3-4.1.5.
4. Voor het analyseren van de volledige dosis responscurve Bereken de piek FRET verhouding (AR / R) (stap 4.1.6), plot als functie van log agonist concentratie en passen bij de Hill-vergelijking (stap 11.4). Bepaal de EC _50, Hill-coëfficiënt, en maximale FRET-ratio. Voor de 12 andere neurotransmitters / modulators, plot piek AR / R als functie of drug concentratie.
5. Kies ~ 10 CNiFER klonen die een groot FRET verhouding, een geschikte EC ₅₀ voor de verwante agonist, en weinig of geen achtergrond reacties op andere neurotransmitter agonisten (niet-specifieke reactie) hebben.

8. Freeze-back Geselecteerde CNiFER Clones

1. Gebruik een ~ 90% confluent T75 kolf van een individuele CNiFER kloon. Oogst cellen zoals beschreven (stap 2,3-2,5, Tabel 2). Voor het invriezen cellen resuspendeer de celpellet in 5 ml HEK293 groeimedia. Label tien 1,5 ml cryotubes en zet op ijs.
2. Voor cryoprotection Meng cellen 1: 1 met 20% (v / v) DMSO in HEK293 groeimedia, bijvoorbeeld 5 ml van de 20% (v / v) DMSO / media mengsel wordt voorzichtig gemengd met 5 ml celsuspensie (final concentratie van DMSO is 10%).
3. Aliquot 1 ml in elk van de cryobuizen. Freeze buizen met cellen in een -80 ° C vriezer O / N, in een schuim-geïsoleerde box (zie materialen). Transfer cryotubes naar Liquid stikstof voor langdurige opslag.

9. CNiFER implantatie in Mouse Cortex

1. Steriliseren alle chirurgische instrumenten in een autoclaaf voor de operatie. Bereid een semi-steriele veld voor de operatie door bestrijken met 70% ethanol en tot vaststelling van een schone lab luier.
2. Bereid de CNiFER injectie pipet door het trekken van een glazen capillaire (id van 0,53 mm) op een verticale elektrode puller. Gebruik een paar niet. 5 fijne punt tang om de punt van de elektrode te breken tot een diameter van ~ 40 urn.
   Opmerking: Dit wordt het beste bereikt in het kader van een stereo-zoom microscoop met een raster.
3. Verdoven volwassen (postnatale dag 60-90) C57BL / 6 muis met isofluraan: 4% (v / v) (v / v) voor inductie en 1,5 tot 2,0% voor onderhoud. Gebruik staart of teen knijpen om ervoor te zorgen dat de muis is volledig verdoofd.
   Let op: Re-pinch periodiek beoordelen snorhaar spiertrekkingen hele operatie om de diepte van de anesthesie opnieuw te beoordelen.
4. Bedek de ogen met oogzalf pRevent drogen. Monteer de muis in een stereotaxische frame met oor bars. Handhaaf de muis lichaamstemperatuur bij 37 ° C onder toepassing van een warmte pad geregeld door een rectale sonde.
5. Scheren een oppervlakte van ongeveer 5 mm bij 12 mm met een dier elektrisch scheerapparaat. Toepassen Betadine gevolgd door 70% (v / v) isopropanol. Gebruik een scalpel te snijden en de huid te verwijderen over de schedel oppervlak. Gebruik een scalpel het periosteum van het oppervlak van de schedel verwijderd. Expose en reinig het oppervlak van de schedel, zoals beschreven voor stereotaxische chirurgie ^11.
6. Verlaag een leeg glas pipet tot bregma en noteer de antero-posterior (A / P) en medio-laterale (M / L) coördineert. Verwijzend naar de muizenhersenen atlas, berekent de positie van de injectieplaats. Verschuiving van de pipet op de beoogde plaats en markeer de schedel voor volgende venster vorming. Zie Cetin et al. Voor meer informatie over stereotaxische injecties met knaagdieren ^11.
   Opmerking: De injectieplaats en raam afhankelijk Region te bestuderen en de verdeling van neurotransmitter of peptide los uitsteeksels in de cortex. Bijvoorbeeld, in een recente publicatie ^7, de stereotaxische coördinaten 1,0-2,0 mm A / P en 1,0-2,0 mm M / L werden gebruikt om cellen te injecteren in CNiFER frontale cortex voor in vivo beeldvorming van dopamine afgifte in klassieke conditionering .
7. Vorm een 2 mm x 3 mm verdund-schedel venster zoals eerder beschreven ^12,13.
   Opmerking: Het bot in het venster moet 15-20 urn dik. De kleine witte vlekken in het bot niet zichtbaar wanneer de schedel oppervlak wordt bevochtigd, wanneer het bot voldoende verdund ^12,13.
8. Plaats een ACSF doordrenkte spons op het venster om het vochtig te houden tijdens het bereiden van cellen te injecteren.
9. Oogst de CNiFER kloon die werd gekweekt in een T75 kolf ~ 80% confluentie. Zuig het medium en was de cellen met steriel PBS.
   Opmerking: trypsine is weggelaten voor deze stappen.
10. Verwijder PBS en gebruik 10 ml of ACSF om cellen los van de bodem van de kolf. Fijnstampen cellen naar cel klonten distantiëren. Centrifugeer en resuspendeer de pellet in 100 pl ACSF. Centrifugeer gedurende 30 seconden bij 1400 x g en de bovenstaande vloeistof, waardoor een pellet bedekt met ACSF. Deze stap laat een klompje cellen in suspensie.
11. Backfill de injectie pipet bereid in stap 9.2 met minerale olie, laadt u het pipet op een nanoinjector, en vooraf de zuiger om een ​​kleine kraal van de olie uit te werpen. Zet 5 ui CNiFER celsuspensie op een strook van plastic paraffine film in de buurt van de muis voorbereiding. Opstellen ofwel de CNiFERs of de controle CNiFER cellen in de getrokken pipet.
12. Beweeg de pipet naar het doel X- en Y-coördinaten, dat wil zeggen, A / P en M / L uit stap 9.5. Laat de pipet, het doorprikken van de verdunde schedel, en blijven ~ 200-400 micrometer onder de schedel oppervlak, om CNiFER cellen in lagen 2/3 van de cortex te deponeren.
13. Injecteren ~ 4.6 nl van CNiFER cellen op het diepste site met de nanoinjector, nota beweging in de olie-en mobiele interface en dan wachten op 5 min voor de cellen af ​​te zien. Trek de pipet ~ 100 micrometer en injecteer een ander ~ 4.6 nl van CNiFER cellen, wacht 5 min. Daarna trekken de pipet langzaam en voorzichtig om terugstromen van de CNiFERs voorkomen. Herhaal injectie op één of meer aansluitende gebieden.
14. Herhaal de injectie stappen 9,8-9,12 met controle HEK293 cellen (dat wil zeggen, HEK293 / TN-XXL / G _qi5 kloon ontbreekt GPCR). Scheid de CNiFER en de controle cel injectieplaatsen door ~ 200 urn.
15. Na het voltooien van cel implantaties, spoel de verdunde-schedel venster met ACSF en wacht tot de schedel te drogen. Breng een druppel cyanoacrylaat lijm (zie Materialen) over het venster wordt snel een voorgesneden steriele dekglas bovenop de lijm. Duw de dekking van glas tegen de schedel voor een paar seconden. Laat de lijm drogen voor 2 min ^12,13.
16. Dicht de randen van het dekglas met tandheelkundige cement en vorm awell rond het venster om water te houden voor de dompelen doelstelling.
17. Voor het immobiliseren van het hoofd van de muis tijdens de beeldvorming, bevestig een custom-built head-bar met een kleine druppel cyanoacrylaatlijm achter het venster (zie ¹⁴ voor meer informatie over afmetingen en materialen). Laat de lijm goed drogen en voeg vervolgens aanvullende tandheelkundige cement om de custom-built head-bar verder te versterken.
18. Bedek de rest van de schedel oppervlak, met uitzondering van het venster, met een laag tandheelkundig cement. Zorg ervoor dat de randen van de huid onder cement en laten drogen 20 min.
19. Na de operatie, stoppen met isofluraan administratie en laat de muis op een verwarmingselement in een kooi totdat deze volledig herstelt van anesthesie. Injecteer 5% (w / v) glucose in zoutoplossing (sc) voor rehydratatie en 0,05-0,1 mg / kg buprenorfine (ip, onmiddellijke afgifte) voor post-operatieve analgesie.
    Opmerking: Om potentiële immunologische reactie op het menselijk CNiFERs minimaliseren, injecteer de muis per dag met 20 pl / 100 g cyclosporine (ip) starten de dag voor de injectie van CNiFERs.
20. Zet de muis aan zijn kooi voor voedsel en water.

10. In vivo beeldvorming van CNiFER Clones

NB: Live beeldvorming wordt uitgevoerd met muizen met een twee-foton microscoop en een hoofd-vaste inrichting. Geen verdoving nodig is tijdens de beeldvorming sessies. Wanneer beeldvorming dieren in de wakkere staat, te beperken hoofdsteun tot slechts een paar uur per keer om stress te verminderen. Breng het dier naar huis kooi tussen de beeldvorming sessies voor voedsel en water. Potentiële belasting wordt geminimaliseerd door verduisteren verlichting in de kamer en de omliggende deel van de muis in een behuizing.

1. Op de dag na de operatie, zet de muis op een imaging platform door vastschroeven van de metalen kop-bar geïmplanteerd op de schedel aan het hoofd-fixatie frame.
   Opmerking: Wanneer de beeldvorming wakker muizen, moet de opnamesessie niet meer dan een paar uur te wijten aan de mogelijke stress veroorzaakt door de hoofdsteun apparaat.
2. Plaats de imaging platform met de kop tegengehouden muis in een twee-foton imaging microscoop uitgerust met een 10X (0,30 NA) en 40X (0,80 NA) water immersie doelstellingen.
3. Filterdrager cube FRET beeldvorming (eCFP en Citrien) een dichroïsche spiegel 505 nm en banddoorlaatfilters die zich uitstrekken 460 nm tot 500 nm voor het meten eCFP en 520 nm tot 560 nm voor het meten Citrine heeft.
4. ACSF toe te voegen aan het putje met verdund-schedel raam en laat de doelstelling water onderdompeling in de ACSF. Gebruik het oculair in combinatie met kwiklamp en GFP filter kubus het oppervlak van de cortex en vaatstelsel onder het venster te lokaliseren.
   Opmerking: Het patroon van de bloedvaten helpt lokaliseren en beeld dezelfde regio meer dan herhaald dagen van beeldvorming. Schakel over naar de 40X water immersie objectief om CNiFERs vinden handmatig scherpstellen op het oppervlak van de cortex over de cellen met behulp van de GFP filter kubus en een kwiklamp.
5. Opgezet voor twee-foton imaging. Selecteer de appropriate lichtpad voor twee-foton imaging. Voor een typische commercieel systeem, de software gebruiken om naar twee-foton imaging mode en buigen licht naar de fotovermenigvuldiger buizen (PMT's) in de niet-descanned detectoren. Schakel het nabije infrarood femtoseconde gepulste laser, selecteer een golflengte van 820 nm en een energie-instelling van 5-15%. Let op: 5% vermogen levert typisch ~ 25 mW bij het monster.
6. Stel de PMT1 & PMT2 spanning dichtbij de maximale waarde, typisch 700-1.000 V, afhankelijk van de PMT. Stel de winst voor 1 voor elk kanaal en nul de z-positie voor het doel.
7. Verlaag de doelstelling ~ 100 tot 200 urn van de corticale oppervlak en start de xy scan. Stel het laservermogen, te verwerven, en PMT spanning van elk kanaal, dat wil zeggen, eCFP en citroengeel, de signaal-ruisverhouding van de CNiFER fluorescentie optimaliseren.
8. Gebruik de zoomfunctie in de software om de afbeelding te beperken tot een regio die de CNiFER cellen bevat, evenals een background regio. Gebruik een scansnelheid niet trager dan één frame per 2 sec (0,5 Hz) bij 4 microseconde per pixel. Pas de lijn van gemiddeld naar geschikte signaal-ruisverhouding, bv, Kalman 2 lijn middeling.
9. Teken een regio-of-interest (ROI) rond CNiFER cellen, rond ongeveer 3 tot 4 cellen per vliegtuig. Opzetten van real-time analyse van ROI gemiddelde intensiteiten. Start overname CNiFER fluorescentie monitoren in de tijd.
10. Verzamel fluorescentie van CNiFERs voor en tijdens experimentele manipulaties, bijvoorbeeld, elektrische stimulatie, ChR2 stimulatie, gedrag, zoals bepaald door de gebruiker.
11. Wanneer de beeldvorming experiment is voltooid, de terugkeer van de muis naar zijn kooi. Herhaal de beeldvorming in dagen, zoals gewenst. Als re-beeldvorming van de cellen verwijzen de eerder verworven laag-vergroting vaatstelsel om terug te oriënteren op hetzelfde beeldveld (stap 10.4).
    Opmerking: Geïmplanteerde CNiFERs kunnen worden afgebeeld gedurende ten minste 7 dagen.

11. Data Analysis

1. Open imaging bestand en selecteer ROI voor CNiFERs en een ROI voor de achtergrond. Selecteer 'series analysis' voor beide kanalen van elk ROI. Export gemiddelde fluorescentie-intensiteit voor elk ROI als een door tabs gescheiden bestand.
2. Gebruik een wiskundige software (zie Materials) programma om fluorescentie waarden te analyseren. Low-pass filter (0,3 Hz) elk signaal en vervolgens aftrekken van de achtergrond fluorescentie in elk ROI van eCFP en Citrien fluorescentie-intensiteiten.
3. Bereken gemiddelde fluorescentie voor baseline en berekenen verhoudingen zoals beschreven in Vergelijking 1 het FRET verhouding AR (t) / R te meten.
4. Om de gevoeligheid van CNiFERs bepalen plot de FRET verhouding als functie van log agonist concentratie. Aansluiten bij de Hill vergelijking om de EC ₅₀ en Hill-coëfficiënt (n) te bepalen, met behulp van wetenschappelijke statistische software en de Hill Equation (Vergelijking 2).

Resultaten

Een CNiFER is afgeleid van een humane embryonale niercellen (HEK293) cellen die is ontworpen om ten minste twee eiwitten stabiel tot expressie: een specifieke G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) en een genetisch gecodeerd [Ca2 ^+] opnemer, TN-XXL. TN-XXL ondergaat fluorescentie-energieoverdracht (FRET) tussen cyaan en geel fluorescerende eiwitten, eCFP en citroengeel, respectievelijk, in reactie op Ca2 ⁺ -ionen ^6,15. Activering van GPCR's die endogeen <...

Discussie

De oprichting van CNiFERs een innovatieve en unieke strategie voor het optisch meten van afgifte van neurotransmitters in de hersenen in vivo. CNiFERs zijn ideaal voor het meten extrasynaptic afgifte, dat wil zeggen, volume geleiding voor neurotransmitters. Moet voor elk CNiFER bezit de eigenschappen van de natieve GPCR, die een fysiologische optisch meten van de veranderingen in niveaus van neurotransmitters in de hersenen. Tot op heden zijn CNiFERs gemaakt voor het detecteren van acetylcholine (M1-CN...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro	System Biosciences	CD510B-1	Cloning: voor het genereren van lentivirus
12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube	BD Biosciences	352063	FACS
BD 40 um Falcon cell strainers	BD Biosciences	352340	FACS
0.05% Trypsin EDTA	Invitrogen	25200056	FACS
96 Well Plate, flat bottom, clear	Corning	3596	FACS
96 well cell culture plates	Corning	CLS3997	Flexstation
Optilux black clear bottom	Corning	3603	Flexstation
Flexstation pipet tips	Molecular Devices	9000-0911	Flexstation
Acetylcholine Chloride	Sigma-Aldrich	A2661	Flexstation
Norepinephrine	Sigma-Aldrich	A7256	Flexstation
Dopamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	PHR1090	Flexstation
GABA	Sigma-Aldrich	A2129	Flexstation
Histamine	Sigma-Aldrich	H7125	Flexstation
Glutamate	Sigma-Aldrich	49621	Flexstation
Epinephrine	Sigma-Aldrich	E4642	Flexstation
Somatostatin	Sigma-Aldrich	S1763	Flexstation
5HT	Sigma-Aldrich	H9523	Flexstation
VIP	Alpha Diagnostics Inc.	SP-69627	Flexstation
Orexin A	Alpha Diagnostics Inc.	12-p-01	Flexstation
Substance P	Sigma-Aldrich	S6883	Flexstation
Adenosine	Sigma-Aldrich	A4036	Flexstation
Melatonin	Sigma-Aldrich	M5250C	Flexstation
Fluorescence Plate Reader & software	Molecular Devices	Flexstation 3	Flexstation
DMEM (high glucose) with Glutamax	Life Technologies	10569-010	Weefselkweek
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082-139	Weefselkweek
Pen/Strep  antibiotics	Life Technologies	15140-122	Weefselkweek
Puromycin	InvivoGen	ant-pr-1	Weefselkweek
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	Weefselkweek
CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box	Bioexpress	D-3508)	Weefselkweek
cyanoacrylate glue	Loctite	Loctite no. 495	chirurgie en stereotactische injectie
plastic paraffin film	VWR	Parafilm®	chirurgie en stereotactische injectie
Nanoinjector	Drummond	3-000-204	chirurgie en stereotactische injectie
Glass electrodes	Drummond	3-000-203G	chirurgie en stereotactische injectie
hand held drill	OSADA	Exl-M40	chirurgie en stereotactische injectie
Burrs for drill	Fine Scientific	19007-05; 19007-07)	chirurgie en stereotactische injectie
Sterilizing bath	FST	18000-45, Hot Bead Sterilizer	chirurgie en stereotactische injectie
isoflurane chamber/mask	Highland Medical Equipment	564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm	chirurgie en stereotactische injectie
3D scope with arm	Zeiss		chirurgie en stereotactische injectie
fiber optic light			chirurgie en stereotactische injectie
Betadine			chirurgie en stereotactische injectie
70 % (v/v) isopropyl alcohol			chirurgie en stereotactische injectie
Povidone-Iodine Prep Pads	dynarex	1108	chirurgie en stereotactische injectie
NaCl 0.9% (injectie, USP, 918610)			chirurgie en stereotactische injectie
CYCLOSPORINE (INJECTIE, USP)			chirurgie en stereotactische injectie
Buprenex (injectie) buprenorphine (0,03 μg per g knaagdier)	Sigma-Aldrich		chirurgie en stereotactische injectie
Ophthalmic ointment	Akorn	NDC 17478-235-35	chirurgie en stereotactische injectie
Surgifoam	Ethicon		chirurgie en stereotactische injectie
Grip dental cement	Dentsply	#675571, 675572	chirurgie en stereotactische injectie
Instant SuperGlue	NDindustries		chirurgie en stereotactische injectie
LOCTITE 4041			chirurgie en stereotactische injectie
METABOND	C&B		chirurgie en stereotactische injectie
no. 0 cover glass	Fisher		chirurgie en stereotactische injectie
stereotaxic frame	Kopf		chirurgie en stereotactische injectie
Rectal probe and heating pad	FHC	40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe	chirurgie en stereotactische injectie
optical breadboard for imaging	Thorlabs		chirurgie en stereotactische injectie
Mineral oil	Fisher	S55667	chirurgie en stereotactische injectie
Kwik-Cast (Silicone elastomer)	World Precision Instruments		chirurgie en stereotactische injectie
Suture	Ethicon	18’’, 1667, 4-0	chirurgie en stereotactische injectie
Scissors	Fine Scientific Tools	91500-09, 15018-10	chirurgie en stereotactische injectie
Forcepts	Fine Scientific Tools	11252-30;