Methodenartikel

Een ELISA Based Binding en concurrentie methode om snel bepalen Ligand-receptor interacties

DOI:

10.3791/53575

⸱

14 maart 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Applied Microbiology Research, Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, and Swiss Institute of Bioinformatics, 3Swiss Institute of Bioinformatics, 4Li Ka Shing Institute for Virology, University of Alberta, 5Regional Infectious Diseases Unit, University of Edinburgh, 6Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Alberta, 7Infection Biology, Department of Biomedicine, University of Basel, 8Clinical Microbiology, University Hospital Basel

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gepresenteerde protocollen beschrijven twee op enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) gebaseerde technieken voor de snelle onderzoeking van ligand-receptor interacties: De eerste test stelt de bepaling van constante disassociatie tussen ligand en receptor mogelijk. De tweede test maakt een snelle screening van blokkerende peptiden voor ligand-receptor interacties mogelijk.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een uitgebreid begrip van signaaltransductieroutes vereist gedetailleerde kennis over ligand-receptor interactie. Dit artikel beschrijft twee snelle en betrouwbare, punt voor punt, protocollen van enzymgekoppelde immunosorbeertesten (ELISA's) voor de onderzoek naar ligand-receptor interacties: de directe ligand-receptor interactie test (LRA) en de competitieve LRA. Als case study wordt de ELISA-gebaseerde analyse van de interactie tussen verschillende lambda interferonen (IFNLs) en de alfa-subeenheid van hun receptor (IL28RA) gepresenteerd: de directe LRA wordt gebruikt voor de bepaling van dissociatieconstanten (KD-waarden) tussen receptor en IFN-liganden, en de competitieve LRA voor de bepaling van het remmende vermogen van een oligopeptide, dat ontworpen is om te concurreren met de IFNLs op hun receptorbindingsplaats. Analytische stappen om KD en half maximale remmende concentratie (IC50) waarden te schatten worden beschreven. Ten slotte benadrukt de discussie de voor- en nadelen van de gepresenteerde methode en hoe de resultaten een beter moleculair begrip van ligand-receptor interacties mogelijk maken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een beter begrip van signaalwegen vereist gedetailleerde kennis over de ligand-receptor interactie. De meeste werkwijzen voor het beoordelen van de interactie van een bepaalde ligand met zijn specifiek receptor zijn duur, tijdrovend, arbeidsintensief en vereist speciale uitrusting en deskundigheid 1.

In dit artikel worden twee snelle en betrouwbare punt-punt protocollen bij de ligand-receptor interactie op basis van een enzym onderzoeken linked immunosorbent assay (ELISA): de directe ligand-receptor interactie assay (LRA) en de concurrentie LRA. ELISA is een zeer gevoelig, specifiek en gemakkelijk beschikbare techniek routinematig gebruikt in bijna elk laboratorium. ELISA kan worden uitgevoerd en aangepast in verschillende modes. De gepresenteerde protocollen zijn geoptimaliseerd voor het onderzoek naar de interactie tussen verschillende lambda interferonen (INFLs) en hun receptor.

De directe LRA zorgt voor een quantificatieen van ligand-receptor binding ten opzichte van ligand concentratie en derhalve een bindende curve oplevert. Gebruikmaking van een geschikt model voor de ligand-receptor interactie, kunnen de gegevens verder worden geanalyseerd om de dissociatieconstante (KD) te schatten.

In de gepresenteerde protocol, wordt de gebruikte Hill-vergelijking toegepast op de ligand-receptor binding te modelleren. Hoewel andere methoden zoals de oppervlakte plasmon resonantie technologie 2,3 maken de bepaling van bindingsaffiniteiten tussen twee eiwitten, deze technologie is vaak arbeidsintensief, duur, en vereist speciale laboratoriumapparatuur.

De competitie LRA maakt de screening van remmende peptiden: de ligand-receptor binding wordt gekwantificeerd ten opzichte peptideconcentratie. Dit levert een dosis-response curve beschrijft het remmende effect van het peptide. De gegevens kunnen verder worden geanalyseerd om de halve maximale remmende concentratie te schatten (IC 50 ) van de blokkerende peptide.

Beide ELISA-protocollen zijn gemakkelijk te gebruiken en kan worden aangepast aan een breed scala van onderzoek vragen. Recombinante eiwitten van elke soort kan worden gebruikt om snel en betrouwbaar bepalen van de interactie delen. Bovendien kan de concurrentie LRA worden gebruikt om kritische interactieplaatsen van liganden en receptoren bepalen via blokkerende peptiden, die zijn ontworpen om ofwel het ligand of de receptor nabootsen. Wanneer de blokkerende peptide toont efficiënte en specifieke remming, het peptide heeft een kritische interactieplaats van de ligand (indien het peptide bootst de receptor) of de ligand (indien het peptide bootst de ligand).

Het eerste protocol beschrijft de K-D-waarde bepalen van verschillende INFLs en de alfa-subunit van hun receptor, dat wil zeggen, de interleukine-28 receptor (IL28RA) met behulp van de directe LRA. Vervolgens wordt het tweede protocol laat zien hoe het vermogen van een 20 aminozuren lang peptide te bepalenremmen de INFL-IL28RA interacties. Het peptide is ontworpen om te concurreren met IFNLs hun receptorbindingsplaats en maakt daarmee een moleculair begrip van de interactie. Verder kan dit peptide worden gebruikt om IL28RA in vitro experimenten blokkeren de effecten op downstream signaaleffecten 4 bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. reagens Voorbereiding

  1. Om carbonaatcoatingbuffer buffer voor te bereiden, te ontbinden 0,36 g Na 2 CO 3 en 0,84 g NaHCO3 in 100 ml gedestilleerd water; steriele filter de buffer met behulp van een vacuüm gedreven 0,22 pm polyethersulfon (PES) membraan filter en bewaar bij kamertemperatuur tot gebruik.
  2. Bereid wasoplossing door toevoeging van 0,05% v / v Tween 20 in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  3. Bereid een 5% runderserumalbumine (BSA) (blokkeeroplossing) in PBS-oplossing door het oplossen van 5 g BSA (≥98%) in 100 ml PBS en bewaar bij 4 ° C.
  4. Recombinante receptor, liganden en blokkeren Peptiden
    1. Reconstitutethe recombinant humaan interleukine-alfa-subeenheid (IL28RA) en recombinant aangemaakt liganden van humane IFN (IFNL1-3) volgens de instructies van de fabrikant en bewaar bij -80 ° C. Synthetiseren blokkerende peptiden en gebruikt zoals hiervoor beschreven 4. Met PBS verschillende concentraties ligand bereidens en peptiden voor gebruik in de testen.
  5. Aan het primaire antilichaam te bereiden, verdun 6x His muis monoklonaal antilichaam in PBS met 0,1% BSA in 1: 1000 verdunning. Om het tweede antilichaam te bereiden, verdunde mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd geit anti-muis IgG (H + L) in PBS met 0,1% BSA in 1: 10.000 verdunning.
  6. Bereid TMB oplossing door het mengen van reagentia A en B volgens de instructies van de fabrikant.
  7. Bereid stoppen door toevoeging van 5 N zwavelzuur (H 2 SO 4) in gedestilleerd water en bewaar bij kamertemperatuur.

2. Enzym-gekoppelde immunosorbent assays (ELISA's)

OPMERKING: De directe ligand-receptor interactie ELISA (directe LRA figuur 1) kan worden gebruikt om de receptor-ligand dissociatieconstante (KD) te meten, als een maat voor de receptor ligand bindingsaffiniteit. De competitie ligand-receptor interactie ELISA (concurrentie LRA, figuur 2) Alleows screening van peptiden (en andere verbindingen te blokkeren), die werken om de interactie tussen ligand en receptor. Het basisprotocol dat eerder werd gepubliceerd 5 werd verder geoptimaliseerd.
Opmerking: in beide ELISA- methoden multichannel pipet voor het toevoegen van oplossingen aan de putjes van 96-putjes plaat bij elke stap. In oplossing decant of wasstappen, gooien de oplossingen direct in de gootsteen.

  1. Direct Ligand-receptor-interactie Assay (direct LRA)
    OPMERKING: Voor een illustratie van de werkstroom (zie figuur 1).
    1. Coating Plaat met recombinante receptor
      1. Verdun de recombinante receptor in carbonaatbuffer bij een eindconcentratie van 100 ng / ul. Coat putjes van 96-well microtiterplaat met vaste receptor concentratie (100 ng / ul) pipetteren 100 pi aan elk putje met een multichannel pipet. Uitsluiten buitenwanden van de plaat goed edge artefact te vermijden. Bedek de plaat met een deksel en incubeer deplaat bij 4 ° CO / N.
    2. Blokkering en toevoeging van liganden
      1. De volgende dag, verwijder de bekledingsoplossing door het kantelen van de plaat tegen de gootsteen en was de plaat 3 maal met wasoplossing (PBS + 0,05% v / v Tween 20).
      2. Blokkeert de vrije receptor bindingsplaatsen in de beklede plaat met behulp van 200 ui 5% BSA oplossing in elk putje met een multichannel pipet en incubeer de plaat gedurende 2 uur bij KT.
      3. Gooi de blokkerende oplossing (zie stap 2.1.2.1.) En was de plaat 3 maal met wasoplossing.
      4. Bereid de recombinant-His gemerkte liganden in verschillende concentraties (bijvoorbeeld 8 ug / ml, 4 ug / ml, 2 ug / ml, 1 ug / ml, 0,5 ug / ml, 0,25 ug / ml, 0,125 pg / ml, 0,063 pg / ml, 0,031 pg / ml, 0,0 ug / ml) in PBS. Voeg alleen PBS in het lege putten.
      5. Voeg 100 ul van elk ligand concentratie aan de putjes in duplo en incubeer de plaat gedurende 2 uur bij KT zodat receptor-ligandinteractie.
    3. Incubatie met Antilichamen
      1. Na incubatie met de liganden, was de plaat 3 maal met wasoplossing.
      2. Pipetteer 100 ul van primair anti-His monoklonaal antilichaam (1: 1000) aan elk putje.
      3. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 2 uur; na incubatie, gooi het antilichaam-oplossing (zie stap 2.1.2.1.) en was de plaat 3 maal met wasoplossing.
      4. Voeg 100 gl HRP gekoppelde geit anti-muis IgG secundair antilichaam (1: 10.000) aan elk putje. Incubeer de plaat gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
      5. Gooi het antilichaam-oplossing (zie stap 2.1.2.1.) En was de plaat 3 maal met wasoplossing.
    4. Toevoeging van de ondergrond en Ontwikkeling
      1. Breng de TMB substraat oplossing tot KT en bereid TMB substraatoplossing A en B in 1: 1 verhouding. Voeg 100 ul vers bereide substraat aan elk putje en houdt de plaat bij kamertemperatuur gedurende 15-30 min. Na voldoende col of de ontwikkeling voeg 50 ul stop oplossing.
    5. Het lezen van de plaat en Data-analyse
      Opmerking: De beschreven protocol is gebaseerd op de veronderstelling dat het gemeten signaal stijgt van specifieke binding. Het kan nodig om de bijdrage van niet-specifieke binding aan de signaalschatting maar dit is buiten het bereik van dit protocol.
      1. Lees de absorptie (optische dichtheid, OD) direct bij 450 nm.
      2. Trek het achtergrondsignaal van de gemeten OD-waarden en normaliseren hen. Transformatie waarden van de ligand concentratie logaritmische schaal (grondtal 10, log 10).
      3. Plot de genormaliseerde en achtergrond gecorrigeerde OD-waarden (y-as overeenkomt met de fractie van bezette receptorbindingsplaatsen) tegen de logaritme van de concentratie ligand (X-as, log 10 schaal).
      4. Om de K D-waarde te schatten, past de gegevens naar de volgende vorm van de Hill vergelijking:
        tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg "/>
        LET OP: Hier geeft Y de fractie van bezette receptor binding sites en Y max de maximale binding; [L] duidt de concentratie van vrije ligand en de Hill-coëfficiënt. Als er slechts één bindingsplaats voor het ligand, de Hill coëfficiënt n = 1. Voor systemen met meer dan één ligand bindingsplaats, de binding vertoont positieve coöperativiteit als n> 1, negatieve coöperatief als n <1 en als n geen coöperativiteit = 1. de microscopische dissociatieconstante wordt genoemd en komt overeen met de helft van de maximale effectieve concentratie 50 EC 6. De schijnbare dissociatieconstante is Kd = (KD) n. In het eenvoudigste geval waarin n = 1, de dissociatieconstante overeen met de ligand concentratie waarbij de helft van de receptor bindingsplaatsen bezet en Kd = KD. Dit model gaat uit van massa-actie bindend onder evenwicht omstandigheden, evenals dat slechts een klein deel van dehet toegevoegde ligand is gebonden aan de receptor, dat wil zeggen, [L] >> [RL].

figure-protocol-1
Figuur 1. Direct ligand-receptor-interactie assay (direct LRA). Stap-voor-stap protocol voor directe LRA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Concurrentie Ligand-receptor-interactie Assay (concurrentie LRA)
    LET OP:. Voor een afbeelding van de workflow zie figuur 2 De wedstrijd LRA procedure volgt dezelfde stappen als de directe LRA (het bekleden van de plaat, antilichaam incubatie plaat ontwikkeling), behalve voor belangrijke veranderingen in het ligand en peptiden aanvulling stap. Juiste negatieve controles zijn essentieel voor deze test. In een eerdere screening 4, de gecodeerde blokkerende peptide niet antagonistische effecten laten zien.
    1. Het blokkeren - Toevoeging van liganden en het blokkeren van Peptiden
      1. De volgende dag, verwijder de coating-oplossing en was de plaat (zie 2.1.2.1).
      2. Blokkeer de beklede plaat door toevoeging van 200 ui 5% BSA-oplossing aan elk putje en incubeer de plaat gedurende 2 uur bij KT.
      3. Bereid de recombinant His gemerkte liganden (IFNL1-3) met een vaste concentratie (2x-20 ng / ml) in PBS.
      4. Bereid de blokkerende peptide (zie Tabel 3) met verschillende concentraties variërend van 10 nM tot 100 uM in PBS om een dosis-responscurve te garanderen.
        LET OP: Dit maakt de daaropvolgende bepaling van de IC 50 waarde voor de blokkering peptide. In controleputjes, voeg concentratie alleen vaste ligand zonder peptide aan het maximum (100%) binding leiden. In de lege alleen PBS toevoegen zonder ligand of peptide.
      5. Voeg 50 ul van de liganden (IFNL1-3) en 50 pi van elke peptide concentratie aan de putjes in duplo.
      6. Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij KT.
    2. Het lezen van de plaat en data-analyse
      Opmerking: De beschreven protocol is gebaseerd op de veronderstelling dat het gemeten signaal stijgt van specifieke binding. Het kan nodig om de bijdrage van niet-specifieke binding aan de signaalschatting maar dit is buiten het bereik van dit protocol.
      1. Lees de absorptie (optische dichtheid, OD) direct bij 450 nm.
      2. Trek het achtergrondsignaal van de gemeten OD-waarden en normaliseren hen. Transformatie waarden van de peptide concentratie logaritmische schaal (grondtal 10, log 10).
      3. Plot de genormaliseerde en achtergrond gecorrigeerde OD-waarden (y-as overeenkomt met de fractie van bezette receptorbindingsplaatsen) tegen de logaritme van de concentratie ligand (X-as, log 10 schaal).
      4. Om de IC50 waarde te schatten, past de gegevens aan de volgende vergelijking:
        figure-protocol-2
        LET OP: Hier [P] is de peptide concentratie en de Hill helling. De helling wordt de steilheid van de dosis-responscurve. De IC 50 komt overeen met de inhibitor concentratie waarbij 50% remming van binding tussen ligand en receptor waargenomen.

figure-protocol-3
Figuur 2. Competition ligand-receptor-interactie assay (concurrentie LRA). Stap-voor-stap protocol voor de concurrentie LRA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De dissociatieconstanten tussen INFL1-3 en hun receptor alpha subunit IL28RA werden bepaald met behulp van de directe LRA. De resultaten worden getoond in Figuur 3: De fractie bezette bindingsplaatsen uitgezet tegen de logaritme van de respectievelijke IFN concentratie. De Scatchard plot van de gegevens wordt weergegeven in de rechter benedenhoek. De resultaten illustreren dat de directe LRA levert een binding curve, die verder kan worden geanalyseerd om de KD...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ELISA is een standaard en gevestigde methode voor vele laboratoria. We hebben verder gemodificeerd en verbeterd eerder gepubliceerde werkwijze 5,7. De aangetoonde stap-voor-stap protocol duidelijk dat het kan worden gebruikt op een eenvoudige manier de KD-waarden van ligand-receptor-interacties te bepalen. Bovendien kan de IC50 van een blokkerend peptide dat interfereert met de ligand-receptor interactie te bepalen.

Belangrijke voordelen zijn de snelle installatie, eenv...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.E. werd ondersteund door onderzoekssubsidies van het programma "SNSF Ambizione Score" (PZ00P3_154709), "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" Universiteit van Basel, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel en Bangeter Rhyner Stiftung. J.L. erkent de steun van een iPhD-beurs van de SystemsX.ch-initiatief in het programma systeembiologie (9de oproep).

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Prof. J. Stelling (Afdeling Biosystemenwetenschap en Techniek, ETH Zürich en Zwitsers Instituut voor Bioinformatica, Bazel, Zwitserland) voor zijn kritische beoordeling van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)Thermo Scientific442404ELISA plate
Sodium carbonate (Na2CO3)Merck497-19-8Voor ELISA plate coating buffer
Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3)Merck144-55-8Voor ELISA plate coating buffer
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA7030-100G5% BSA in PBS voor Blocking
rhIL-28Rα/IFNλR1R&D systems5260-MRRecombinant human interlukin-28 Receptor alpha
rhIL-29/IFNλ1R&D systems1598-IL/CFRecombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag
rhIL-28A/IFNλ2R&D systems1587-IL/CFRecombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag
rhIL-28B/IFNλ3R&D systems5259-IL/CFRecombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag
6x His Monoclonal antibody (Mouse)Clontech631212Primaire antilichaam om His getagged Liganden te vangen
Goat anti-Mouse igG (H+L)Jackson Immuno Research115-035-166Horseradish Peroxidase geconjugeerde secundaire antilichaam
BDoptEIA TMB reagent setBD Biosciences555214ELISA - TMB substraatoplossing
Sulfuric acid (H2SO4)Fulka847205 N H2SO4 (Enzymreactie stop oplossing)
Synergy/H1 - Microplate readerBioTeKELISA plate reader

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
  2. Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
  3. van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
  4. Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556(2014).
  5. Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
  6. Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
  7. Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155(2009).
  8. Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51(2014).
  9. Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
  10. Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
  11. Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
  12. Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ligand receptorinteractieBindingsaffiniteitCompetitieve assayCytokinereceptorDissociatieconstanteIC50 waardeInterferon lambdaReceptor alfa subunitBlockerend peptide

Gerelateerde artikelen