Met behulp van micro-computertomografie voor de evaluatie van de ontwikkeling van tumoren en follow-up van de respons op de behandeling in een muismodel van longkanker

Summary

We beschrijven een methode voor de detectie van tumorknobbelontwikkeling in de longen van een adenocarcinoom muismodel met behulp van micro-computertomografie en het gebruik ervan voor het monitoren van veranderingen in knobbelgrootte over tijd en als reactie op behandeling. De nauwkeurigheid van de beoordeling werd bevestigd met histologische kwantificering aan het eindpunt.

Abstract

Longkanker is de meest dodelijke vorm van kanker ter wereld. Over de hele wereld wordt intensief onderzoek gedaan om nieuwe therapieën voor longkanker te identificeren. Verschillende muismodellen van longkanker worden gebruikt om het mechanisme van kankerontwikkeling te bestuderen en om te experimenteren met verschillende therapeutische strategieën. Echter, de afwezigheid van een real-time techniek om de ontwikkeling van tumorknooppunten in de longen van muizen te identificeren en de veranderingen in hun grootte te monitoren in reactie op verschillende experimentele en therapeutische interventies, belemmert het vermogen om een nauwkeurige beschrijving van het verloop van de ziekte en de tijdige reactie op behandelingen te verkrijgen. In deze studie wordt een methode beschreven die gebruik maakt van een micro-computertomografie (CT) scanner voor de detectie van de ontwikkeling van longtumoren in een muismodel van longadenocarcinoom. Vervolgens laten we zien dat maandelijks opvolgen met micro-CT dynamische veranderingen in de longtumor kan identificeren, zoals het verschijnen van extra knooppunten, toename van de grootte van eerder gedetecteerde knooppunten, en afname van de grootte of volledige resolutie van knooppunten in reactie op behandeling. Ten slotte werd de nauwkeurigheid van deze real-time beoordelingsmethode bevestigd met eindpunthistologische kwantificering. Deze techniek baant de weg voor het plannen en uitvoeren van complexere experimenten op diermodellen van longkanker, en stelt ons in staat om de mechanismen van carcinogenese en de effecten van verschillende behandelingsmodaliteiten beter te begrijpen terwijl tijd en middelen worden bespaard.

Introduction

Longkanker is de belangrijkste oorzaak van kankersterfte wereldwijd ^1. Onderzoek naar de preventie, vroegtijdige opsporing en behandeling van longkanker is aan de gang in vele onderzoekscentra over de hele wereld ^2,3. Verschillende diermodellen voor longkanker zijn ontwikkeld en zij bruikbaar zijn bij het ​​bestuderen van de mechanismen van longcarcinomen en cel van oorsprong, het bepalen van de aanwezigheid van kanker stamcellen bewezen, en voor het onderzoek verschillende nieuwe therapeutische strategieën ^4. Eerdere modellen vertrouwden op carcinogeen-geïnduceerde tumor initiatie in gevoelige stammen van muizen ^5. De ontwikkeling van knockout en transgene muismodellen waarin longkanker ontstaat als gevolg van specifiek gemanipuleerde genetische lesies aanzienlijk verbeterd ons vermogen om tumorinductie en diverse aspecten nabootsen van humane longkanker ⁴ regelen. Echter een grote uitdaging in het gebruik van longkanker diermodellen is het ontbreken van een real-time methodenauwkeurig identificeren en controleren het ontstaan ​​en de ontwikkeling van tumoren in de muis longen en latere veranderingen in hun grootte, documenteren zoals hun verdere groei of vermindering van respons op behandeling. Dit heeft gedwongen onderzoekers hun toevlucht nemen tot een aantal tijd, moeite en hulpbronnen verbruiken technieken om de tumoren te identificeren en hun experimentele resultaten te evalueren. De aanwezigheid van inherente variatie tussen muis als reactie op tumorinductie vereist het gebruik van grote aantallen dieren in elke experimentele groep data variabiliteit te verminderen. Het onvermogen om de tumorgroei of de respons op de behandeling in real time bepalen dwong onderzoekers blind inslapen muizen op verschillende tijdstippen in langdurige testprotocollen te garanderen dat de juiste gegevens verzamelt, waardoor de verspilling van de monsters verzameld op tijdstippen die ofwel te vroeg of te laat zijn.

In deze studie, een methode om een ​​dierenverblijf micro-c benuttenomputed tomografie (micro-CT) scanner detecteren en follow-up longtumoren in levende muizen ingebracht. We gebruikten de recent beschreven Sftpc-rtTA en Tre-Fgf9-IRES-EGFP dubbel-transgene (DT) muizen die snel long adenocarcinoom na inductie met doxycycline ^6,7 ontwikkelen. Het gebruik van micro-CT kunnen wij (oa) sluit muizen met afwijkende longafwijkingen vóór inleiding, bevestigen ontwikkeling van tumoren in de long na inductie en veranderingen in tumoren nemen in reactie op experimentele behandelingen. Eindpunt euthanasie muizen en histologische evaluatie bevestigde de juistheid van de onmiddellijke evaluatie uitgevoerd met micro-CT. Wij zijn van mening dat deze techniek de weg zal vrijmaken voor het uitvoeren van een betere geplande experimenten met longkanker diermodellen tijdens het opslaan van waardevolle hulpbronnen, het verkorten van observatie tijd en het verhogen van de nauwkeurigheid en het inzicht in de resultaten.

Protocol

Dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van Keio University.

Let op: In deze studie gebruikten we de Sftpc-rtTA en Tre-Fgf9-IRES-EGFP DT muizen waarbij long adenocarcinoom ontwikkelt zich snel na inductie door het voeren van chow met doxycycline ^6,7. Echter, het diagnostisch procedures worden toegepast op andere longkanker muismodellen.

1. Experiment Outline:

1. Identificeer de status van de longen bij de basislijn:
   1. Voordat tumor inductie, wanneer de DT muizen zijn 8 - 12 weken oud, het uitvoeren van de eerste micro-CT-scan (zie rubrieken 2 en 3 hieronder). Dit vormt de long basislijn scan, bevestigen dat er spontaan ontwikkeld knobbeltjes veroorzaakt door een lekkende transgen en documenteren gebrek aan bestaande longpathologie voor tumorinductie.
2. Initiëren tumor inductie:
   1. Zet de DT muizen uit reguliere chow doxycycline chow voor fibroblast groeifactor (FGF) 9 expressie induceren in de alveolaire cellen en tumorontwikkeling te initiëren. Geef doxycycline chow (200 ppm) ad libitum.
3. Bevestig de ontwikkeling van tumoren in de muis longen:
   1. Voer een micro-CT scan van de ontwikkeling van tumoren in vergelijking met de pre-inductie scan identificeren.
4. Evalueren respons op de behandeling:
   1. Om het vermogen van het micro-CT veranderingen in tumoren in respons op behandeling detecteren, dienen de FGF receptor (FGFR) remmer AZD4547 testen, voer extra micro-CT scans na 5 en 10 weken.
5. Eindpunt evaluatie:
   1. Euthanaseren alle behandeling en controle muizen en proces weefsels voor histologisch onderzoek (zie hoofdstuk 6 hieronder).

2. Voorbereiden muizen voor Micro-CT Image Acquisition:

1. Schakel de micro-CT scanner en computer.
2. click van de software met de naam "R_m CT2", klik dan op "warm up".
3. Verwijder het monster bed waarop de muis van de micro-CT kamer wordt geplaatst. Wikkel het bed met plastic wrap.
4. Stel de anesthesie-inductie doos door het toevoegen van isofluraan aan de anesthesie verdamper tot aan de gemarkeerde niveau. Stel de isofluraan debiet 3 l / min.
5. Open de zuurstoftank de zuurstofstroom in de inductie box starten en het debiet van 1 l / min.
6. Plaats de muis in de inductie van anesthesie en bevestig dat het diep verdoofd door de afwezigheid van spontane beweging en in reactie op een huid pinch (een zachte snufje een kleine huidplooi die weefselschade of skin break niet veroorzaakt).
7. Breng een oculair smeermiddel om het hoornvlies uitdroging tijdens de anesthesie te voorkomen.
8. Open de micro-CT kamer en plaats de muis met de dorsale zijde naar boven op het monster bed. Houd het hoofd van de muis en trek het lichaam naar beneden van de onderste ledematen in order te rekken en strekken van het lichaam symmetrisch.
9. Schakel de narcose stroom naar de inductie doos en zet hem aan in de richting van de buis die aansluit op de micro-CT kamer.
10. Plaats de verdoving buis in de neus van de muis om continu verdoving toe te dienen.
11. Om de muis te fixeren; wikkel de muis en het monster bed met plasticfolie.
    Opmerking: Het is van cruciaal belang voor de muis onder diepe narcose en gewikkeld om het monster te bed, want elke geringe beweging of draai van zijn lichaam tijdens de scan zal resulteren in wazige beelden en moeilijkheden bij de interpretatie te houden.
12. Sluit de micro-CT kamer.
13. Stel de micro-CT-systeem tot 90 kV en 160 uA en de scantijd tot 4,5 min. Stel het beeld bereik tot 24 × 19 mm en de voxel grootte van 50 × 50 × 50 micrometer. Gebruik de synchrone modus voor hartslagen.
14. Maak een nieuwe map in de "Database" om nieuwe afbeeldingen in die map op te slaan.
15. Start de scan.
16. Na afloop van de scan, beweeg de muis in een lege kooi en observeren tot hij bijkomt. Zet het niet met andere muizen totdat deze volledig is hersteld van de gevolgen van de narcose.

3. Pre-inductie Micro-CT Image visualisatie en analyse:

1. Om de micro-CT-beelden te visualiseren, download de gratis ImageJ software van de volgende website: http://imagej.nih.gov/ij/ . Let op: Elke micro-CT data bestand is een stapel van ongeveer 500 TIF-bestanden (.tif). Andere beeldweergave software kan ook worden gebruikt.
2. Open de seriële micro-CT-beelden bestanden en blader door alle beelden van elke muis van de nek tot de buik of vice versa.
3. Gebruik scans naïeve wildtype muizen, bepalen de dichtheid van verschillende gebieden en normale anatomische structuren in de borst gebaseerd op kennis van muis anatomie (zie figuur 1A).
   1. Houd de cursor met decomputermuis en blader omhoog, vanaf de witachtige buik ingewanden en het middenrif, door de borst en tot aan de nek.
   2. Identificeer de benige oriëntatiepunten thorax (borstbeen vooraan, wervels in de rug en ribben aan de zijkant).
   3. Identificeer het hart aan de voorkant van de borst en de grote bloedvaten in het hart en in het mediastinum.
   4. Neem de trachea lumen (als kleine donkere cirkel ter hoogte van de nek, schouders en borst), die splitst in de rechter en linker hoofdbronchiën dan verder vertakken in steeds kleinere bronchiën. Merk op dat elke bronchus nauw verbonden met twee of drie bloedvaten (Figuur 1A).
4. Start onderzoek naar de scans van de VN-geïnduceerde DT muizen en identificeren van de aanwezigheid van eventuele afwijkingen.
   1. Uitsluiten muizen met abnormale pre-inductie long shadows (bijv knobbeltjes, emfysemateuze bullae, etc.) van verdere experimenten. (Figuur 1C-E, G, H ).

4. Tumor Inductie:

1. Om de ontwikkeling van tumoren in experimentele muizen die normale long-scans bleek te induceren, schakelen hun voedsel van de reguliere chow to-doxycycline bevatten chow (200 ppm).

5. Follow-up scans:

1. Na 10 weken, uitvoeren van een tweede micro-CT scan van alle muizen voor de ontwikkeling van tumoren in de longen (zie figuur 2) bevestigd.
2. Gesplitst in twee groepen muizen. Dien de FGFR blocker AZD4547 (125 ug / kg / dag via een maagsonde gedurende 6 dagen / week gedurende 10 weken) van één groep en een placebo op de andere controlegroep gedurende 10 weken.
3. Opvolgen van de veranderingen in de nodulaire schaduw door het uitvoeren van een derde scan 4-5 weken later.
4. Eind 10 weken behandeling uitvoeren vierde scan.
5. Euthanaseren alle muizen met CO ₂ inhalatie of intraperitoneale injectie van 0,1 mg / 200 pl pentobarbital.
6. naaridentificeren van de dynamische veranderingen in de tumoren na inductie en in reactie op de behandeling, vergelijkbare posities in de seriële scan beelden van dezelfde muis identificeren twee of meer verschillende tijdstippen vervolgens controleren het verschijnen / verdwijnen van abnormale schaduwen (Figuur 3 ).
7. Om de identificatie van hetzelfde vlak in dezelfde muis op verschillende tijdstippen te faciliteren, probeer dan op het vlak van belang associëren met anatomische mijlpaal structuren binnen de muis borst.
   1. Gebruik oriëntatiepunten zoals de trachea, de splitsing, de rechter en linker hoofdbronchiën, aorta, middenrif en grote bloedvaten.
      Opmerking: Borst botten, zoals de thoracale wervels, ribben en borstbeen minder bruikbaar positionering oriëntatiepunten vanwege gemeenschappelijke geringe hellingen in muizenmodellen lichaamshouding op het monster bed, die de mogelijkheid van verkeerde interpretatie van de scan functie vergroten. Ook het imago serienummer binnen het scan-bestand is onbetrouwbaar voor identifying dezelfde positie in de tijd wegens de verandering in muizen lichaamslengte van de ene tijd naar de andere. Het niet of onnauwkeurigheid bij het identificeren van hetzelfde vlak op verschillende tijdstippen kan leiden tot vals positieve / negatieve interpretatie van de resultaten.

6. Mouse Euthanasie en Lung Collection:

1. Euthanaseren muizen met CO ₂ inhalatie of intraperitoneale injectie van 0,1 mg / 200 pl pentobarbital.
2. Maak de ingewanden door longitudinaal doorsnijden van de buikwand. Ontlucht de muis om het volume van bloed in de longen te verminderen door het ontleden van de abdominale aorta.
3. Spleet het membraan met fijne schaar; Dit zal resulteren in verlies van de negatieve druk van de borstholte, waardoor de longen inklappen. Maak de longen en het hart door het snijden en verwijderen van delen van de ribben van de voorste borstwand. Reinig het voorste gedeelte van de nek door het snijden van de huid en zachte weefsels naar de tranche blooteen.
4. Knip het hart en de thymus. Plaats pincet achter de luchtpijp te scheiden van de slokdarm.
5. Canule de luchtpijp met een G24 canule dan vast op zijn plaats vast door een draad rond de ingevoegde deel.
6. Blaas en bevestig de longen met behulp van ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) door de tracheacanule met behulp van een kolom van 25 cm. Maak de canule en draai de draad naar PFA lekkage te voorkomen knip dan de bovenste luchtpijp af zijn gehechtheid aan het strottenhoofd.
7. Trek de luchtpijp van de hechtdraad en ontleden het van zijn gehechtheid, en verder naar beneden om het te verwijderen met de longen en -blok. Plaats deze in een 15 ml buis met 5 ml van 4% PFA. Laat de longen in PFA O / N om volledige penetratie en fixatie te garanderen, dan is het verwerken van het weefsel in een standaard paraffine blok ^8.
8. Snijd paraffineblokken in 6 um-dikke plakken op een microtoom en vlek met hematoxyline en eosine met behulp van standaard technieken.

7. histologisch onderzoek:

Noot: Hoewel het gebruik van een "slide scanner" digitale histologische evaluatie hier wordt beschreven, het gebruik van reguliere microscopen en visuele histologisch onderzoek ter beoordeling is ook mogelijk.

1. Zet op de dia scanner instrument en computer.
2. Klik op de "NDP scan" software.
3. Selecteer de scan mode "Batch van dia's 'en' Semi-automatische modus" voor het scannen van een reeks dia's.
   Opmerking: De robotarm die pikt de objectglaasjes gedurende sequentiële scan is zeer gevoelig voor onregelmatigheden aan de randen van de glasplaatjes.
4. Palpeer de randen van alle glazen dia's voordat u ze in de machine. Als er een uitstulping van de dekking van glas of gedroogde montage medium, maak het schoon met een mes of een scalpel.
5. Plaats de dia's in een dia cassette. Open het specimen luik en schuif de cassette in positie "één";. Doe de deur dicht.
6. Op de computer software, geef korte beschrijvende namen op alle dia's in hun overeenkomstige positie in de cassette en klik op de knop "OK".
7. Selecteer het profiel mode: "Helderveld".
8. Klik op "Start Batch" om de voorlopige scannen te starten.
   Let op: Als de machine klaar is met het scannen van alle dia's, zal de software automatisch te detecteren gebieden met tissues op alle dia's en stellen het als een regio van belang.
9. Indien nodig, herdefiniëren het gebied van belang door de linkermuisknop ingedrukt te houden en het trekken van de regio grens.
   Opmerking: Het definiëren overmatig grote delen van de glijbanen als de regio's van belang resulteert in een veel langere scantijd.
10. Eenmaal tevreden met de regio's van de rente op alle dia's, klik op "Scan" om te beginnen met het scannen van alle dia's.
    Opmerking: De gescande bestanden kunnen digitaal worden waargenomen in lage en hoge resolutie, en beelden kunnen worden geëxporteerd als JPEGbestanden.

Results

Identificatie van muizen met long afwijkingen werd uitgevoerd bij baseline. Voordat tumorinductie, wanneer de DT muizen waren 8-12 weken oud, werden de longen van muizen gescand met micro-CT. Verrassend, ongeveer 50% van de muizen afwijkingen die gedwongen ons ze ongeschikt voor opneming in de volgende studie achten. Deze afwijkingen waren knobbeltje-als schaduwen, grote enkele of meerdere kleine emfysemateuze bullae en / of lobar atelectase (figuur 1 A, C, DE, GH). Verv...

Discussion

De micro-CT-gebaseerde werkwijze beschreven voor het real-time identificatie van long afwijkingen en toezicht op de ontwikkeling van tumoren en de respons op de behandeling bij longkanker proefdiermodellen wetenschappers die voert longkanker gerelateerde experimenten meer plannen inschakelen nauwkeurig en efficiënt experimenten tijdens het opslaan van tijd en middelen. We hebben voorheen MRI voor hetzelfde doel ^6. De helderheid van de scan en de drempel voor de detectie van longknobbeltjes MRI waren inferieur...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
micro-X-ray–computed tomography	Rigaku	R_mCT2
NanoZoomer RS Digital Pathology System	Hamamatsu	RS C10730
NDP.view2 Viewing software	Hamamatsu	U12388-01	http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html
Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill	VETEQUIP	911103
Induction chamber, 2 L  W9.5 × D23 × H9.5	VETEQUIP	941444
Isoflurane	Mylan	ES2303-01
AZD 4547	LC Labratories	A-1088
Pentobarbital	Kyoritsu	SOM02-YA1312
G24 cannula	Terumo	SP-FS2419
Paraformaldehyde	Wako	163-20145
Microtome	Leica	RM2265
Doxycycline	SLC Japan/PMI Nutrition International	5TP7
ImageJ software	National Institute of health		http://imagej.nih.gov/ij/
Puralube vet ointment (Occular lubricant)	Dechra	NDC 17033-211-38