Methodenartikel

LC-MS analyse van menselijke bloedplaatjes als een platform voor het bestuderen van mitochondriaal Metabolisme

DOI:

10.3791/53941

⸱

4 april 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Cancer Pharmacology, University of Pennsylvania, 2Center for Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania, 3Penn SRP and Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 4Division of Traumatology, Department of Surgery, Critical Care and Acute Care Surgery, University of Pennsylvania, 5A.J. Drexel Autism Institute, Drexel University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier laten we geïsoleerde humane bloedplaatjes kan worden gebruikt als een toegankelijke ex vivo model metabole aanpassingen studeren in reactie op de remmer complex I rotenon. Deze benadering maakt gebruik van isotopische tracering en relatieve kwantificatie door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie en kan worden toegepast op een verscheidenheid van studieopzetten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verstoring van het mitochondriale metabolisme heeft hernieuwde belangstelling gekregen als een oorzakelijke rol in een reeks ziekten. Het onderzoeken van veranderingen in metabole routes vereist een model waarin externe factoren goed kunnen worden gecontroleerd, waardoor reproduceerbare en zinvolle resultaten mogelijk zijn. Veel studies gebruiken getransformeerde cellulaire modellen voor deze doeleinden; echter, metabole herprogrammering die optreedt in veel kankercellijnen kan verwarrende variabelen introduceren. Om deze reden zijn primaire cellen wenselijk, hoewel het verkrijgen van voldoende biomassa voor metabole studies een uitdaging kan zijn. Hier laten we zien dat menselijke bloedplaatjes kunnen worden gebruikt als een platform om metabole studies uit te voeren in combinatie met vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie analyse. Deze aanpak is geschikt voor relatieve kwantificering en isotopenlabeling om de activiteit van specifieke metabole routes te onderzoeken. Beschikbaarheid van bloedplaatjes van individuele donoren of van bloedbanken maakt dit modelsysteem toepasbaar voor klinische studies en haalbaar om op te schalen. Hier gebruiken we geïsoleerde bloedplaatjes om eerder geïdentificeerde compenserende metabole verschuivingen te bevestigen als reactie op de complex I-remmer rotenon. Meer specifiek, een afname van glycolyse gaat gepaard met een toename van vetzuuroxidatie om acetyl-CoA-niveaus te handhaven. Onze resultaten laten zien dat bloedplaatjes kunnen worden gebruikt als een gemakkelijk toegankelijk en medisch relevant model om de effecten van xenobiotica op cellulair metabolisme te onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Disfunctionele mitochondriaal metabolisme is betrokken bij een groot aantal ziekten, waaronder neurodegeneratie, kanker en cardiovasculaire aandoeningen 30. Als zodanig is grote inspanning geplaatst op het karakteriseren van metabolische defecten die bijdragen aan pathogenese. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) wordt beschouwd als de gouden standaard voor de kwantificatie van analyten uit complexe biologische matrices en wordt vaak gebruikt voor metabolismeonderzoek 8. Echter, zoals vaak het geval is bij biomedische studies, bereiken een toegankelijke en goed gedefinieerde model voor menselijke ziekten tegen een uitdaging.

Veel studies in dienst getransformeerd cellulaire modellen voor het sonderen van de impact van xenobiotica of genetische afwijkingen op de celstofwisseling 7,9. De metabole herprogrammering die optreedt in kankercellen kan introduceren storende factoren 21 en zijn dus niet ideaal. Deze problemen kunnen worden circumvented met primaire cel modellen, hoewel het verkrijgen van voldoende biomassa voor metabole analyses kan een uitdaging zijn. Bovendien is de impact van grote hoeveelheden antibiotica gebruikt in de cultuur zijn gemarkeerd als potentieel verstorende mitochondriale studies 16.

Menselijke bloedplaatjes in de gelegenheid om een primaire cel model met voldoende mitochondriale inhoud voor metabole studies 5,22,27,32 benutten. Ten eerste kan bloedplaatjes gemakkelijk worden verkregen door bloedafnames van individuele donoren, of in grote hoeveelheden uit bloedbanken en daarom een ​​model waarin externe factoren gemakkelijk kan worden gecontroleerd. Ten tweede, als gevolg van hun geringe omvang, bloedplaatjes kan eenvoudig worden geïsoleerd van andere bloedcomponenten met minimale voorbereidende werkzaamheden in zelfs minimaal uitgeruste laboratoria 5. We merken hebben bloedplaatjes niet kernen bevatten en kunnen daarom worden gebruikt om veranderingen onafhankelijk van transcriptionele regulatie te bestuderen metabolisme. Hier laten we zien datnaast relatieve kwantificatie van acyl-coenzym A (CoA) thioesters, kan het geïsoleerde bloedplaatjes systeem worden gebruikt om koolstofmetabolisme onderzoeken. Specifiek melden wij het ​​gebruik van metabolisch labelen met stabiele isotopen (niet-radioactief) gemerkte [13 C 6] glucose en [13 C 16] -palmitate incorporatie van [13 C] -label sonde in de belangrijkste metaboliet acetyl- CoA via glycolyse of vetzuuroxidatie. Dit zorgt voor een krachtige, generaliseerbare en veelzijdig platform vanwege de grote betrokkenheid van acyl-CoA soorten biochemische pathways 13,24 en de traceerbaarheid van dit systeem onderzoeken van andere variabelen, zoals de remming van complex I met rotenon 3,33. In aanvulling op de informatie in de onderstaande protocol, kan een uitgebreide beschrijving van de gebruikte isotoop etikettering en voor de LC-MS-gebaseerde analyses methoden te vinden in Basu en Blair 4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethiek Verklaring: Alle protocollen met betrekking tot de behandeling van menselijke monsters volgen de richtlijnen van de Universiteit van Pennsylvania menselijk onderzoek ethische commissie.

1. Bereiding van buffers en 100x Voorraadoplossingen

  1. Bereid 1 liter bufferbasis Tyrode. Combineer 8,123 g NaCl, 1,428 g NaHCO3, 0,466 g CaCl2 ∙ 2 H 2 O, 0,224 g KCI en 0,095 g MgCl 2. Pas de totale volume op 1 L met DDH 2 O. Filter steriliseren basis Tyrode buffer.
  2. Bereid 100x voorraad oplossingen van glucose en palmitinezuur. Voor 100x glucose voorraad oplossingen, los 100 mg glucose of [13 C 6] glucose in 1 ml van DDH 2 O. Voor 100x palmitaat oplossingen, lossen 2,56 mg palmitinezuur of 2,72 mg [13 C 16] -palmitic zuur in 1 ml ethanol. Filter steriliseren 100x voorraad oplossingen.
  3. Bereid Geschikte verrijkte Tyrode Buffers
    1. Voor niet-labeling studies, voeg 1 ml van 100x glucose voorraad-oplossing en 1 ml 100x palmitinezuur stockoplossing aan 98 ml buffer basis Tyrode.
    2. Voor glucose labeling studies, voeg 1 ml 100x [13 C 6] glucose voorraad-oplossing en 1 ml 100x palmitinezuur stockoplossing aan 98 ml buffer basis Tyrode.
    3. Voor palmitinezuur labeling studies, voeg 1 ml van 100x glucose voorraad-oplossing en 1 ml van [13 C 16] -palmitic zuur stockoplossing aan 98 ml buffer basis Tyrode.
  4. Bereid Oplossingen voor Rotenon Treatment
    1. Bereid een 10 mM voorraadoplossing van rotenon in dimethylsulfoxide (DMSO).
    2. Voor niet-labeling dosis-respons studies, ga dan naar 1.4.3. Voor de etikettering studies in een eenmalige dosis, ga dan naar 1.4.5.
    3. Voer een seriële verdunning van de 10 mM voorraad in DMSO rotenon oplossingen met rotenon concentraties variërend van 1 nM tot 100 urn. Dit zijn 100x voorraads.
    4. Voeg 50 ul van elk bestand tot 5 ml base Tyrode buffer + glucose + palmitinezuur 1.3.1 van oplossingen met rotenon concentraties van 10 pM tot 1 uM bereiden. Alternatief, voeg 50 ul DMSO om te dienen als controle voertuig. Ga verder met 2.1.
    5. Verdun de 10 mM voorraadoplossing 1000-voudig in DMSO tot een 10 uM werkende oplossing.
    6. Voeg 50 ul van deze voorraad aan elk van de basis Tyrode buffer + 5 ml [13 C 6] glucose + palmitinezuur van 1.3.2 en de basis Tyrode buffer + glucose + [13 C 16] -palmitic zuur uit 1.3.3. De uiteindelijke concentratie 100 nM rotenon. Alternatief, voeg 50 pl DMSO iedere buffer te dienen als controles voertuig.

2. Bloedplaatjes Isolation

Opmerking: Deze methode is vatbaar voor bloedplaatjes afgeleid van ofwel volledig bloed of bloedplaatjes zakken. Het voorbeeld gegevens hierin opgenomen werd voorbereidgebruik bloedplaatjes afgeleid van bloedplaatjes zakken. Zie Basu et al. 5 voor meer informatie met betrekking tot het gebruik van bloedplaatjes geïsoleerd uit volbloed.

  1. Bloedplaatjes Isolatie van volbloed
    LET OP: Als het isoleren van bloedplaatjes uit een zak met bloedplaatjes, ga dan naar 2.2.1.
    1. Centrifuge volbloed bij 175 x g gedurende 15 min zonder remmen.
    2. Breng 1 ml van de bovenste bloedplaatjes-rijk plasma (PRP) laag naar een 1,5 ml microcentrifugebuis.
    3. Centrifugeer de PRP bij 400 x g gedurende 5 min.
    4. Zuig supernatant en ga verder met stap 3.1 of 3.2.
  2. Bloedplaatjes Isolatie van een bloedplaatjes Bag
    1. Breng 1 ml van de bloedplaatjessuspensie een 1,5 ml microcentrifugebuis.
    2. Centrifugeer de suspensie bij 400 xg gedurende 5 minuten.
    3. Zuig supernatant en ga verder met stap 3.1. of 3.2.

3. Het uitvoeren van een experiment

  1. Om het effect van xenobiotische bepalenbehandeling (bijvoorbeeld, rotenone) op de niveaus van een metaboliet van belang (bijvoorbeeld, acetyl-CoA), ga dan naar 3.1.1. Om het effect van xenobiotische (bijv., Rotenone) op de opname van een metabolische precursor aanwezig is in een stroomafwaarts metaboliet van belang, overgaan tot 3.2.1.
    1. Met behulp van niet minder dan drie biologische herhalingen voor elke conditie, resuspendeer bloedplaatjes pellet uit stap 2.1.4 of 2.2.3 in 1 ml van elke oplossing van stap 1.4.4.
    2. Incubeer geresuspendeerde bloedplaatjes in een watermantel CO 2 incubator ingesteld op 95% vochtigheid, 5% CO2 en 37 ° C gedurende 1 uur. Ga verder met stap 4.1
      Opmerking: Hier beschrijven we een dosis-respons-experiment. Als alternatief zou een tijdsverloop experiment uitgevoerd waarbij de dosering is vastgesteld en de lengte van de incubatie werd in plaats daarvan gevarieerd.
  2. Om het effect van xenobiotische behandeling bij de oprichting van een metabolische precursor aanwezig is in een stroomafwaarts metaboliet plaats.
    1. Uzingen niet minder dan drie biologische herhalingen voor elke conditie, resuspendeer bloedplaatjes pellet uit stap 2.1.4 of 2.2.3 in 1 ml van elke formulering van gemerkt Tyrode buffer uit stap 1.4.6.
    2. Incubeer geresuspendeerde bloedplaatjes in een watermantel CO 2 incubator ingesteld op 95% vochtigheid, 5% CO2 en 37 ° C gedurende 1 uur. Ga verder met stap 4.1.

4. Afschrikken en CoA Extraction

  1. Bloedplaatjes pellet door centrifugeren bij 3000 g gedurende 3 minuten.
  2. Zuig supernatant.
  3. Resuspendeer bloedplaatjes in 750 ul ijskoude 10% trichloorazijnzuur (w / v).
  4. Voeg het juiste stabiele isotoop gemerkte interne standaard. Bijvoorbeeld, als het doel is om de niveaus van CoA soorten vergelijken uit verschillende monsters, gebruik 100 ui van een mengsel van stabiele isotoop gemerkte CoA thioesters verkregen uit gist zoals eerder beschreven (SILEC techniek) 29.
  5. Pulse-ultrasone trillingen elk monster 30 keer met 0,5 sec pulsen.
  6. Centrifugeer monsters bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  7. Bevestig C18 vaste fase extractie (SPE) kolommen vacuüm spruitstuk.
  8. De kolommen geconditioneerd met 1 ml methanol.
  9. Evenwicht de kolommen met 1 ml DDH 2 O.
  10. Run-monster verkregen supernatant (ongeveer 850 ul in dit geval) door de kolommen.
  11. Was de kolommen met 1 ml water.
  12. Load 10 ml glazen centrifugebuizen in het vacuüm spruitstuk te verzamelen elutie fractie.
  13. Elueer de kolom met 1 ml 25 mM ammoniumacetaat in methanol.
  14. Droog eluaat onder stikstofgas.
  15. Resuspendeer gedroogde residuen in 50 ul 5% (w / v) 5-sulfosalicylzuur en overbrengen naar HPLC-flesjes.

5. HPLC Setup

  1. Met de besturingssoftware voor het HPLC-systeem, maakt een methode met HPLC-omstandigheden geoptimaliseerd voor de doelanalyten en gebruikt kolom, zoals vermeld in tabel 1.
    Opmerking: De kolom temperature gebruikt voor het genereren van deze gegevens was 25 ° C maar de specifieke parameters zullen variëren volgens instrument en ten aanzien van de van belang zijnde verbindingen. Voor acyl-CoA kwantificatie zijn meerdere methoden van LC-MS analyse gerapporteerd en gevalideerd voor verschillende analyten in verschillende LC condities 14,19,20.
  2. Laat de HPLC adequaat Evenwicht.
    Opmerking: Dit dient priming van oplosmiddelen omvatten voor het bevestigen van een kolom en equilibratie van de kolom begint oplosmiddel voorwaarden voor de werkwijze. De verevening volume moeten aanwijzingen van de fabrikant te volgen, en de daaruit voortvloeiende effluent moeten worden doorgeschakeld naar afval.
    Opmerking: Raadpleeg Basu en Blair 5 voor meer details over de HPLC-instellingen.

6. Massa Spectrometer Setup

  1. Met de besturingssoftware van de massaspectrometer, maakt een gerichte detectiemethode voor geïoniseerde vormen van de verbindingen plaats. Parameters wordenin Tabel 2.
    Opmerking: Stabiele isotopen van deze verbindingen worden gebruikt om te bepalen of een positieve of negatieve modus biedt superieure gevoeligheid en de bron en optica staat voor de signalering optimaliseren. De totale detectietijd van de massaspectrometer methode moet bij het tijdstip van het bijbehorende HPLC-methode.
    Opmerking: Zoals eerder vermeld, zijn meerdere methoden van acyl-CoA analyse gerapporteerd, waaronder positieve 14 en negatieve ionisatie 15 wijzen en het gebruik van een hoge resolutie massaspectrometer 17 in plaats van een triple quadrupole instrument 28.
  2. Schoon en kalibreren van het instrument, een stabiel verstuiving in de spectrometer en voldoende tijd voor de ijkoplossing voldoende afvoeren van de bron en optica volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Stel een sequentie voor alle monsters met de massaspectrometer besturingssoftware. incluDe naam of numerieke identificatiemiddelen en geven de juiste injectievolume en instrument methode. Voer een blanco voordat het eerste monster, en lopen andere blanks en wast tussen de monsters die nodig zijn om overdracht of matrix gevolgen te verzachten.
    Opmerking: Een methode voor de piek integratie van geselecteerde analyten 'vloeistof chromatogrammen verwerking kan vaak worden ingesteld binnen deze sequentie of later toegepast in de gegevensverwerking.
  4. Begin de volgorde en het toezicht op de massaspectrometer en HPLC-systeem regelmatig voor problemen, waaronder drukschommelingen of systeemstoringen en het verlies van intensiteit van het signaal tijdens de run.
    Opmerking: Ernstige problemen of aanhoudende run mislukkingen kunnen eisen het stoppen van de run en de zuivering en het opnieuw in evenwicht brengen van het HPLC-systeem, alsmede het schoonmaken en het kalibreren van de massaspectrometer. Raadpleeg Basu en Blair 5 voor meer informatie over de instellingen en de verwerking van gegevens MS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om het nut van deze methode hebben we de generaliseerbaarheid van de eerder beschreven compenserende metabolische aanpassing als gevolg van blootstelling aan rotenon gereproduceerd demonstreren. Deze bevinding werd eerder geïdentificeerd in celcultuur modellen en dit onderzoek was erop gericht om te testen of deze metabole verschuiving komt ook voor in bloedplaatjes, die kernloze en niet gevoelig voor dezelfde experimentele artefacten als celcultuur zijn. Dit werk werd uitgevoerd met 6 d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier hebben we het nut van geïsoleerde bloedplaatjes weergegeven als een platform voor het bestuderen verstoord mitochondriale metabolisme. Wij hebben in het metabolische aanpassing kenmerk reactie op complex I remming door rotenon.

Deze studie werd eerder gemeld bevindingen uitgebreid over de rol van complex I remming door rotenon in cellijnen van menselijke bloedplaatjes. Belangrijk is dat deze is gebleken dat rotenon geremd bloedplaatjes succinyl-CoA vorming stimuleerde een toename van bl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen de steun van NIH subsidies P30ES013508 en T32ES019851.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens
Natriumchloride (NaCl)Sigma-Aldrich746398
Natriumbicarbonaat (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
Calciumchloride dihydraat (CaCl2 * H2O)Sigma-Aldrich223506
Kaliumchloride (KCl)Sigma-AldrichP9541
Magnesiumchloride (MgCl2)Sigma-Aldrich208337
GlucoseSigma-AldrichG8270
13C6-GlucoseSigma-Aldrich389374
PalmitinezuurCayman10006627
13C16-PalmitinezuurSigma-Aldrich605573
RotenonSigma-AldrichR8875
TrichloroazijnzuurSigma-AldrichT6399
5-SulfosalicylzuurSigma-Aldrich390275
AcetonitrilFischer ScientificA996-4(optima)
Water (H2O)Fischer ScientificW7-4(optima)
MierenzuurFischer Scientific85171(optima)
DimethylsulfoxideSigma-Aldrich472301
EthanolFischer Scientific04-355-222
MethanolFischer ScientificA454-4(optima)
AmmoniumacetaatFischer ScientificA639-500
2 ml EppendorfbuisjesBioExpressC-3229-1
LC-vial (kunststof)Waters186002640
10 ml glazen centrifugeerbuisjesKimble Chase73785-10
Oasis solid phase extraxtion (SPE) kolommenWatersWAT094225
PasteurpipettenFischer Scientific13-678-200
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur
CO2 WatermantelincubatorNuaireAutoFlow NU-8500
Triple Quadropole Mass SpectrometerThermo ScientificFinnigan TSQ Quantum
HPLCThermo ScientificDionex Ultimate 3000
BronThermo ScientificHESI II
HPLC-kolomPhenomenexLuna C183 μm deeltjesgrootte, 200 mm x 2 mm

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
  2. Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
  3. Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
  4. Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
  5. Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
  6. Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
  7. Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
  8. Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
  9. Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
  10. Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
  11. Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
  12. Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61(2012).
  13. Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
  14. Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
  15. Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
  16. Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85(2013).
  17. Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
  18. Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
  19. Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
  20. Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
  21. Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
  22. Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
  23. Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
  24. Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
  25. Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
  26. Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
  27. Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
  28. Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
  29. Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
  30. Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
  31. Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
  32. Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
  33. Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
  34. Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Behandeling met rotenonisolatie van bloedplaatjesstabiele isotopenmarkeringacetyl CoA thioestersvetzuuroxidatieinhibitie van glycolysecomplex I remmer

Gerelateerde artikelen