Hier laten we geïsoleerde humane bloedplaatjes kan worden gebruikt als een toegankelijke ex vivo model metabole aanpassingen studeren in reactie op de remmer complex I rotenon. Deze benadering maakt gebruik van isotopische tracering en relatieve kwantificatie door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie en kan worden toegepast op een verscheidenheid van studieopzetten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
LC-MS analyse van menselijke bloedplaatjes als een platform voor het bestuderen van mitochondriaal Metabolisme
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Verstoring van het mitochondriale metabolisme heeft hernieuwde belangstelling gekregen als een oorzakelijke rol in een reeks ziekten. Het onderzoeken van veranderingen in metabole routes vereist een model waarin externe factoren goed kunnen worden gecontroleerd, waardoor reproduceerbare en zinvolle resultaten mogelijk zijn. Veel studies gebruiken getransformeerde cellulaire modellen voor deze doeleinden; echter, metabole herprogrammering die optreedt in veel kankercellijnen kan verwarrende variabelen introduceren. Om deze reden zijn primaire cellen wenselijk, hoewel het verkrijgen van voldoende biomassa voor metabole studies een uitdaging kan zijn. Hier laten we zien dat menselijke bloedplaatjes kunnen worden gebruikt als een platform om metabole studies uit te voeren in combinatie met vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie analyse. Deze aanpak is geschikt voor relatieve kwantificering en isotopenlabeling om de activiteit van specifieke metabole routes te onderzoeken. Beschikbaarheid van bloedplaatjes van individuele donoren of van bloedbanken maakt dit modelsysteem toepasbaar voor klinische studies en haalbaar om op te schalen. Hier gebruiken we geïsoleerde bloedplaatjes om eerder geïdentificeerde compenserende metabole verschuivingen te bevestigen als reactie op de complex I-remmer rotenon. Meer specifiek, een afname van glycolyse gaat gepaard met een toename van vetzuuroxidatie om acetyl-CoA-niveaus te handhaven. Onze resultaten laten zien dat bloedplaatjes kunnen worden gebruikt als een gemakkelijk toegankelijk en medisch relevant model om de effecten van xenobiotica op cellulair metabolisme te onderzoeken.
Inleiding
Disfunctionele mitochondriaal metabolisme is betrokken bij een groot aantal ziekten, waaronder neurodegeneratie, kanker en cardiovasculaire aandoeningen 30. Als zodanig is grote inspanning geplaatst op het karakteriseren van metabolische defecten die bijdragen aan pathogenese. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) wordt beschouwd als de gouden standaard voor de kwantificatie van analyten uit complexe biologische matrices en wordt vaak gebruikt voor metabolismeonderzoek 8. Echter, zoals vaak het geval is bij biomedische studies, bereiken een toegankelijke en goed gedefinieerde model voor menselijke ziekten tegen een uitda....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethiek Verklaring: Alle protocollen met betrekking tot de behandeling van menselijke monsters volgen de richtlijnen van de Universiteit van Pennsylvania menselijk onderzoek ethische commissie.
1. Bereiding van buffers en 100x Voorraadoplossingen
- Bereid 1 liter bufferbasis Tyrode. Combineer 8,123 g NaCl, 1,428 g NaHCO3, 0,466 g CaCl2 ∙ 2 H 2 O, 0,224 g KCI en 0,095 g MgCl 2. Pas de totale volume op 1 L met DDH 2 O. Filter steriliseren basis Tyrode buffer.
- Bereid 100x voorraad oplossingen van glucose en palmitinezuur. Voor 100x glucose voorraad oplossingen, los 100 ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om het nut van deze methode hebben we de generaliseerbaarheid van de eerder beschreven compenserende metabolische aanpassing als gevolg van blootstelling aan rotenon gereproduceerd demonstreren. Deze bevinding werd eerder geïdentificeerd in celcultuur modellen en dit onderzoek was erop gericht om te testen of deze metabole verschuiving komt ook voor in bloedplaatjes, die kernloze en niet gevoelig voor dezelfde experimentele artefacten als celcultuur zijn. Dit werk werd uitgevoerd met 6 d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier hebben we het nut van geïsoleerde bloedplaatjes weergegeven als een platform voor het bestuderen verstoord mitochondriale metabolisme. Wij hebben in het metabolische aanpassing kenmerk reactie op complex I remming door rotenon.
Deze studie werd eerder gemeld bevindingen uitgebreid over de rol van complex I remming door rotenon in cellijnen van menselijke bloedplaatjes. Belangrijk is dat deze is gebleken dat rotenon geremd bloedplaatjes succinyl-CoA vorming stimuleerde een toename van bl.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij erkennen de steun van NIH subsidies P30ES013508 en T32ES019851.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagens | |||
| Natriumchloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Natriumbicarbonaat (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calciumchloride dihydraat (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Kaliumchloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesiumchloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitinezuur | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitinezuur | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenon | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloroazijnzuur | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylzuur | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitril | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Mierenzuur | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammoniumacetaat | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorfbuisjes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC-vial (kunststof) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml glazen centrifugeerbuisjes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis solid phase extraxtion (SPE) kolommen | Waters | WAT094225 | |
| Pasteurpipetten | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Apparatuur | |||
| CO2 Watermantelincubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Bron | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC-kolom | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm deeltjesgrootte, 200 mm x 2 mm |
Referenties
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evide....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
