PTR-ToF-MS gekoppeld aan een geautomatiseerd bemonsteringssysteem en aangepaste data-analyse voor voedingsstudies: Bioproces Monitoring, Screening en Neusruimte Analyse

Summary

Proton Transfer Reactie Time of Flight Mass Spectrometrie maakt hoge gevoeligheid, snelle en niet-invasieve analyse van vluchtige organische verbindingen mogelijk. Om het potentieel te demonstreren, geven we drie voorbeelden: melkzuurfermentatie van yoghurt (online bioprocesbewaking), verschillende appelgenotypen (grootschalige screening) en retronasale ruimte na het drinken van koffie (nosespace-analyse).

Abstract

Proton Transfer Reaction (PTR), gecombineerd met een Time-of-Flight (ToF) Mass Spectrometer (MS) is een analytische aanpak gebaseerd op chemische ionisatie die behoort tot de Direct-Injection Mass Spectrometric (DIMS) technologieën. Deze technieken laten de snelle bepaling van vluchtige organische verbindingen (VOC's) toe, waardoor hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid worden gewaarborgd. In het algemeen vereist PTR-MS geen monsterbereiding of steekproefvernietiging, waardoor realtime en niet-invasieve analyse van monsters mogelijk is. PTR-MS worden uitgebuit op vele gebieden, van milieu- en atmosferische chemie naar de medische en biologische wetenschappen. Meer recent ontwikkelden we een methodologie op basis van koppeling PTR-ToF-MS met een geautomatiseerde sampler en op maat gemaakte data analyse tools, om de mate van automatisering te verhogen en derhalve het potentieel van de techniek te vergroten. Deze aanpak liet ons toezicht op bioprocessen ( bijv. Enzymatische oxidatie, alcoholische fermentatie), om grote steekproefsetjes te screenen (Bijv. Verschillende herkomst, gehele germoplasma's) en analyseren verschillende experimentele modi ( bijv. Verschillende concentraties van een bepaald ingrediënt, verschillende intensiteiten van een specifieke technologische parameter) in termen van VOC-inhoud. Hierbij rapporteren we de experimentele protocollen die verschillende mogelijke toepassingen van onze methodologie illustreren: de detectie van VOC's die worden vrijgelaten tijdens de melkzuurfermentatie van yoghurt (on-line bioprocesmonitoring), de monitoring van VOC's die verband houden met verschillende appelcultivars (grootschalige screening) , En de in vivo studie van retronasale VOC release tijdens koffie drinken (nosespace analyse).

Introduction

Direct-Injection Mass Spectrometric (DIMS) technologieën vormen een klasse van analytische instrumentale benaderingen die aanzienlijke massa- en tijdresolutie bieden met hoge gevoeligheid en robuustheid, waardoor de snelle detectie en kwantificering van vluchtige organische verbindingen (VOC's) ^{1 mogelijk zijn} . Deze instrumentale benaderingen omvatten onder andere MS-e-noses, atmosferische-druk chemische ionisatie massaspectrometrie (APCI-MS), proton-transfer-reactie massaspectrometrie (PTR-MS) en geselekteerde Ion-Flow-Tube Massaspectrometrie ( SIFT-MS) ¹ . De voordelen en nadelen van elke aanpak zijn afhankelijk van: het soort monsterinjectie, de bron en de controle van precursor ionen, de controle van het ionisatieproces en de massaanalysator ^{1 , 2} .

Proton-overdracht-reactie massaspectrometrie (PTR-MS) is meer dan twintig jaar geleden ontwikkeld om in real-time en wiDe lage detectiegrenzen (meestal een paar ppbv, deel per miljard in volume) de meeste vluchtige organische verbindingen (VOC's) in lucht ^{3 , 4} . Huidig ​​gebruik van PTR-MS varieert van medische toepassingen, naar voedselcontrole, naar milieuonderzoek ^{5 , 6} . De belangrijkste kenmerken van deze techniek zijn: de mogelijkheid van snelle en continue meting, de intense en zuivere bron van precursor ionen, en de mogelijkheid om ioniseringsomstandigheden (druk, temperatuur en drijfspanning) te beheersen. Deze functies maken het mogelijk veelvoudige toepassingen te combineren met een hoge mate van standaardisatie ^{1 , 4} . In feite is de methode gebaseerd op reacties van hydroniumionen (H3O ⁺ ), die niet-dissociatieve protonoverdracht in de meeste vluchtige verbindingen veroorzaken (in het bijzonder bij die die worden gekenmerkt door een protonaffiniteit hoger dan water), protonerende neutrale verbindingen(M) volgens de reactie: H3O ⁺ + M → H20 + MH ⁺ . In tegenstelling tot andere technieken, bijvoorbeeld APCI-MS, precursor iongeneratie en monster ionisatie zijn verdeeld in twee verschillende instrumentale compartimenten (een schematische weergave van het PTR-MS instrument is gegeven in Figuur 1 ). Een elektrische ontlading door waterdamp in de holle kathode ionbron genereert een bundel hydroniumionen. Na deze fase overschrijden ionen de drijfbuis, waar de ionisatie van VOC's plaatsvindt ⁷ . Ionen dan een puls extractie sectie en worden versneld in de TOF sectie. Via vluchttijden is het mogelijk om de massa-op-ladingverhoudingen van de ionen ^{8 te bepalen} . Elke extractiepuls leidt tot een compleet massaspectrum ⁸ van het geselecteerde m / z bereik. Ion-spectra worden opgenomen door een snel data-acquisitie systeem ⁷ . Een volledig spectrum is typischVerworven in een seconde, alhoewel hogere tijdresolutie kan worden bereikt volgens het signaal naar het geluidsniveau en een kwantitatieve schatting van de VOC-hoofdruimteconcentratie kan zelfs zonder kalibratie ^{9 , 10} worden verschaft.

Figuur 1: Schematische illustratie van een PTR-MS. Schematische weergave van het PTR-MS instrument. HC: externe ionbron met holle kathode; SD: source drift; VI, venturi-type inlaat; EM, elektronenvermenigvuldiger; FC1-2, flow controllers. Reprinted met toestemming van Boschetti et al. ⁷ . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

In het algemeen verzekert de PTR-techniek snelle analysetijd, hoge detectiegevoeligheid en een relatief compacte instrumentafmeting, hoeft u geen monstervoorbereiding of steekproefvernietiging te verlenen en hiermee real-time onderzoeken mogelijk te maken ¹¹ . PTR is van groot belang in de milieu-, atmosferische, voedsel-, technologische, medische en biologische wetenschappen ¹² .

VOC's die verband houden met voedingsmatrices hebben een uitstekende interesse in voedselwetenschappen en technologie vanwege hun belangrijke rol in de moleculaire basis van biologische fenomenen die verband houden met geur- en smaakperspectie en dus bij voedselacceptatie. Vandaar dat onze interesse in real-time en niet-invasieve detectie van VOC's vooral betrekking heeft op sensorische kwaliteiten van voedsel. Bovendien, als we de mogelijkheid beschouwen om spoilage en pathogene micro-organismen te detecteren door middel van vrijgegeven VOC's ¹³ en / of om vluchtige organische verbindingen te monitoren als markers folloVleugel technologische processen ( bijv. Maillard bijproducten tijdens thermische behandelingen) ¹⁴ , wordt duidelijk hoe VOC identificatie en kwantificering belanghebbende gebieden zijn in voedselkwaliteit management ⁶ . Verscheidene recente toepassingen van PTR-MS-technologieën voor het snel monitoren en kwantificeren van VOC's in voedingsmatrices getuigen van het brede toepassingsgebied van deze analytische benaderingen ( tabel 1 ).

Food matrix	Soort aanvraag	Korte beschrijving	Referentie
Boter	Screening / karakterisatie	Geografische oorsprong van Europese boters	15
Yoghurt	Bioproces monitoring	Evolutie tijdens melkzuurlegging	16
Graanrepen	In vivo meting	Nosespace tijdens consumptie van graangewassen met wisselende suiker samenstelling	17
Vloeibare modelsystemen	Gesimuleerde mondelinge aandoeningen	Evaluatie van de tongdruk en de mondelinge condities in een modelmond	18
appel	In vivo meting	Nosespace tijdens consumptie appel met verschillende genetische, texturale en fysicochemische parameters	19
Koffie	Screening / karakterisatie	Differentiatie van speciale koffies	20
Druivenmost	Screening / karakterisatie	Effect van het koken proces	21
Gegeurde snoepjes	In vivo meting	Bepaling op panelisten die anders gebruikenDirecte massaspectrometrische methoden	22
Ham	Screening / karakterisatie	Effect van het varkensopvangsysteem	23
Brood	Gesimuleerde mondelinge aandoeningen	Simuleren van broodaroma tijdens masticatie	24
Melk	Screening / karakterisatie	Monitoring van fotooxidatie-geïnduceerde dynamische veranderingen in melk	25
Koffie	Screening / karakterisatie	Diversiteit in geroosterde koffie uit verschillende geografische afkomst	26
Brood	Bioproces monitoring	Effect van verschillende gistbeginners tijdens alcoholische fermentatie	27
Koffie	In vivo meting	Nosespace tijdens het verbruik van verschillende geroosterde koffiebereidingen	28
Tomaten	Screening / karakterisatie	Impact van productieplaats, productiesysteem en verscheidenheid	29
Brood	Bioproces monitoring	Effect van bloem, gist en hun interactie tijdens alcoholische fermentatie	30
champignons	Screening / karakterisatie	Houdbaarheid van gedroogde porcini paddestoelen	31
Yoghurt	Bioproces monitoring	Effect van verschillende starterculturen tijdens lactische fermentatie	32
appel	Screening / karakterisatie	Diversiteit in een appel germplasm collectie	33
Koffie	Screening / karakterisatie	Opsporen van koffie oorsprong	34
Koffie	In vivo meting	Combinatie van eenDynamische sensorische methode en in-vivo nosespace analyse om de perceptie van koffie te begrijpen	35

Tabel 1: Lijst van wetenschappelijke studies met behulp van PTR-ToF-MS in de voedingssector. Niet-exhaustieve lijst van wetenschappelijke studies met behulp van PTR-gebaseerde benaderingen om VOC-inhoud in voedselgerelateerde experimenten te controleren.

In recente studies hebben we gerapporteerd over de toepassing van PTR-ToF-MS in combinatie met een geautomatiseerd bemonsteringssysteem en aangepaste data analyse tools om de bemonstering automatisering en betrouwbaarheid te vergroten en derhalve het potentieel van deze techniek ^{7 , 10 , 13 te} verbeteren. Hierdoor kunnen we, in termen van VOC-inhoud, grote monsters ( bijv. Voedsel van verschillende oorsprong met veel replicaten, hele germoplasma's) screenen om de invloed van diverse experimentele modi op VOC-vrijlating te analyseren ( bijv. Verschillende concentratiesVan een bepaald ingrediënt, verschillende intensiteiten van een specifieke technologische parameter), en om VOC's te controleren die geassocieerd zijn met een bepaalde bioproces ( bijv. Enzymatische oxidatie, alcoholische fermentatie). Om het potentieel van PTR-ToF-MS in de agro-voedingssector te illustreren, presenteren we hier drie paradigmatische toepassingen: de detectie van VOC's die worden vrijgelaten tijdens de melkzuurgisting van yoghurt geïnduceerd door verschillende microbiële startculturen (online bioprocesmonitoring ), De monitoring van VOC's in verband met verschillende appelcultivars (grootschalige screening) en de in vivo studie van retronasale VOC-vrijlating tijdens het drinken van koffie (nosespace-analyse).

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen van ons institutioneel comité voor de menselijke onderzoeksetiek.

1. Voorbeeld Voorbereiding en Autosampler Voorwaarden

1. On-line bioproces monitoring: het detecteren van VOC's die vrijkomen tijdens de fermentatie van yoghurt in melkzuur
   OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol is een onderdeel van de procedure die door Benozzi et al is gemeld . ³²
   1. Voeg 5 ml gepasteuriseerde melk toe aan elke injectieflacon (20 ml glazen flesjes voorzien van PTFE / silicone septa). Let op het type melk dat gebruikt wordt en snel de monsters verhogen tot 45 ° C. Breng ze over naar een multifunctionele GC autosampler die uitgerust is met een temperatuurregelaar (45 ° C).
   2. Gebruik de robotarm van de autosampler om de injectieflacons met de microbiële startculturen in te voeren (volgens de specificaties van de fabrikant van de startercultuur). Stel de incubatietijd in volgens de typologie van de gewenste yoghurt en op de specificatieS gerapporteerd door starterkwekerij fabrikant. Stel de autosampler in om een ​​monster na de andere handig te analyseren, waarbij een online VOC-monitoring van melkzuurfermentatie wordt verkregen tijdens yoghurtbereiding.
2. Grootschalige screening: monitoring van VOC's geassocieerd met verschillende appelgenotypen
   OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol is een deel van de procedure die door Farneti et al is gemeld . ^{33 , 36}
   1. Sample appels in de gewenste fase van rijping / behoud ( bijv. Bij de commerciële oogst). Selecteer ten minste vijf homogene vruchten zonder zichtbare schade voor elke kloon. Bewaar de appels voor de gewenste periode bij kamertemperatuur (25 ° C) of koel (4 ° C).
   2. Verzamel vijf cilindrische schijven (1,7 cm diameter en 1 cm dikte) van elke appel met een vleesmesmonster. Neem een ​​deel van het cortexweefsel in, en vermijd het kerndeel met zaden.Homogeniseer de monsters onmiddellijk en vries in vloeibare stikstof. Bewaar bij -80 ° C tot analyse.
   3. Vóór analyses plaats drie replicaten van het 2,5 g appelmonster van elk biologisch replicaat in de flesjes (20 ml glazen flesjes uitgerust met PTFE / silicone septa). Meng het monster met 2,5 ml gedeïoniseerd water, 1 g natriumchloride, 12,5 mg ascorbinezuur en 12,5 mg citroenzuur, en houd de monsters bij 4 ° C tot analyse (maximaal 3 dagen).
   4. Incubeer de monsters bij 40 ° C en stel vervolgens de autosampler in om de VOC's automatisch te analyseren.
3. Nosespace analyse: het bestuderen van retronasale afgifte van VOC's tijdens koffie drinken
   OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol is een deel van de procedure die door Romano et al is gemeld . ²⁸
   1. Bereid gebrouwen koffie uit gemalen koffiemonsters.
      1. Gebruik een koffiemachine: meld de water / poeder ratio, het gebruikte type mineraalwater,Het type koffiezetapparaat, en de procedure die is aangenomen om de koffiedrank te verkrijgen (hoeveelheden zijn een functie van de afmeting van de koffiezetapparaat).
      2. Gebruik een koffiezetapparaat met zes kopjes, in Italië bekend als een "moka", met 450 ml water en 30 g koffiepoeder. Zet de gebrouwde koffie in een vat en verplaats het in een thermostatisch waterbad (60 ° C).
   2. Voor elke koffiebrouwen overdragen 7,5 ml aliquots naar een polystyreenbeker (40 ml) met een plastic kap. Laat elke panellid de drank volgens het protocol proeven: i) 30 s vrije ademhaling, ii) een enkele sip koffie, gevolgd door een snelle slik, en iii) 3 minuten ademhaling in een ergonomische glazen nosepiece ²⁸ .
   3. Herhaal het hele experiment gedurende drie opeenvolgende dagen, waarbij de volgorde van koffiemonsters en panelleden elke dag wordt gerandomiseerd.
   4. Voer monsterneming uit door een ergonomisch nosepiece in siliconenrubber op de neus van de panelen toe te passen. Verbind de nOsepiece aan de PTR-ToF-MS door middel van een PEEK buis die alleen in het eerste deel in contact is met het panellichaam, verwarmt dan bij 110 ° C in een inlaatslang, die de bemonsteringsinterface verbindt met de PTR-MS instrument.
      OPMERKING: in tabel 2 wordt een lijst van producten geanalyseerd met analoge procedures aan die gemeld door Benozzi et al. ³² , Farneti et al. ^{33 , 36} en Romano et al. ²⁸ is gerapporteerd.

Food matrix	Aantal en soort monsters	Referentie
appel	De auteurs onderzochten een collectie, vertegenwoordigd door 190 accessions, samengesteld uit zowel oude als nieuwe appelcultivars	33
Yoghurt	Vier voorgerechten werden geanalyseerd in termen van VOC's die werden vrijgelaten tijdens lactische fermentatie van yoghurt (A, FD-DVS YF-L812 Yo-Flex, Chr. Hansen; B, FD-DVS YC-380 Yo-Flex, Chr. Hansen; C, FD -DVS YC-X11 Yo-Flex, Chr. Hansen; D, YO-MIX 883, Danisco)	32
Koffie	Drie verschillende soorten gemalen koffie, verkregen uit één enkele pure Arabica koffie mix, werden gebruikt: medium gebraden, donker gebraden en gedecaffineerd medium gebraden	28

Tabel 2: Lijst van geanalyseerde producten. Lijst van producten geanalyseerd met analoge procedures aan degenen gerapporteerd door Benozzi et al. ³² , Farneti et al. ^{33 , 36} en Romano et al. ²⁸

2. Experimentele vormgeving en praktische voorzorgsmaatregelen

1. Voer ten minste drie biologische replica overdag uitTes, elk met drie technische replicaten, voor elke experimentele modus.
2. Voorafgaand aan incubatie en analyse van het monster, spoel de kopruimte met 1 minuut bij 200 sccm voor elke injectieflacon.
3. Bereid een blanco voor elke experimentele modus, incubeer en analyseer de blanco onder dezelfde omstandigheden van de monsters.
4. Randomize de volgorde van monsters / blanks voor analyse.
5. Net als andere methoden die VOC's opsporen, beperken het gebruik van geparfumeerde persoonlijke verzorgingsproducten, evenals gom en sigaretten, voordat u het instrument gebruikt. Bevestig alle vluchtige chemicaliën in het laboratorium stevig en controleer de luchtontwerpen zoveel mogelijk tijdens het testen ³⁷ .

3. Optimalisatie en analyse van PTR-MS Instrument

OPMERKING: De instrumentale condities worden beschreven in de referenties ( bijv. Makhoul et al . ²⁷ ).

1. Voer hoofdruimtemetingen van de monsters uit met een commerciAl PTR-ToF-MS apparaat in de standaard configuratie modus.
2. Spuit lucht direct in de PTR-MS drijfbuiskopruimte zonder enige behandeling. Er is een continue stroom van de monsterlucht door de PTR-MS, zodat de injectie wordt bereikt door het einde van de PTR-MS inlaat in de monsterkopruimte te plaatsen.
3. Stel de volgende ioniseringsomstandigheden in de drijfbuis vast en controleer het constant: 110 ° C buis temperatuur, 2,30 mbar drijfdruk, 550 V drijfspanning. Dit leidt tot een E / N verhouding van ongeveer 140 Td (1 Td = 10 ^-17 cm ² V ^{- 1} s ^{- 1} ). De inlaatleiding bestaat uit een PEEK capillairbuis (inwendige diameter 0,04 inch), verwarmd bij 110 ° C. Stel standaard de inlaatstroom in op 40 sccm.
4. Stel de bemonsteringstijd per kanaal van ToF-acquisitie in op 0,1 ns, wat 350.000 kanalen bedraagt ​​voor een massaspectrum tot en met m / z = 400. Elk spectrum is de som van ongeveer 28.600 acquisities die 35 durenΜs elk, wat resulteert in een tijdresolutie van 1 s.
   OPMERKING: Spectra worden dan continu opgeslagen. Spectrometrische signalen groeien vanuit een achtergrondniveau naar een stabiele waarde in een paar seconden (de tijd die nodig is om het gas in de inlaatleidingen te vervangen) en alleen de na deze overgang verkregen spectra worden in verdere analyse beschouwd.

4. Aangepaste data-analyse

OPMERKING: Aangepaste data analyse is ontwikkeld met behulp van een procedure in MATLAB.

1. Corrigeer de teltverliezen als gevolg van de ionendetector dead time via een methodologie gebaseerd op Poisson statistieken zoals beschreven door Cappellin et al. ¹⁰ .
2. Voer interne kalibratie uit volgens een procedure beschreven door Cappellin et al. ³⁸ om een ​​goede massa nauwkeurigheid te bereiken (tot 0.001 Th).
3. Uitvoering van samengestelde annotatie vergeleken verkregen spectrale data met fragmentatiegegevens van referentienormen en met data rUitgegeven in de wetenschappelijke literatuur.
4. Voer geluidsreductie, basislijnverwijdering en piekintensiteitswinning uit volgens Cappellin et al. ³⁹ , met behulp van gemodificeerde Gaussianen om de toppen te passen.
5. Bereken piekintensiteit in ppbv (delen per miljard op volume) via de formule beschreven door Lindinger et al. ⁵ , door gebruik te maken van de juiste reactietempo coëfficiënt of een constante waarde voor de reactietempo coëfficiënt (k = 2,10 ^{- 9} cm ³ s ^-1 ), wanneer de onderliggende verbinding niet bekend is. Deze laatste introduceert een systematische fout van maximaal 30% die kan worden verantwoord als de werkelijke coëfficiënt bekend is ⁴⁰ .
6. Mijn gegevens worden uitgevoerd door Principal Component Analysis, Variance Analysis, Tukey's post-hoc test en andere statistische testen / analyses aan te passen die bestaande pakketten ontwikkelen die zijn ontwikkeld met behulp van R (bijvoorbeeld Cappellin et al. ^10).

Results

Het vluchtige profiel van monsters resulteerde in een compleet massaspectrum voor het gewenste massa bereik verworven elke seconde. In figuur 2 wordt een voorbeeld van de verworven gemiddelde spectra tijdens de yogurt online bioproces gegeven ³² . In elk spectrum kunnen meer dan 300 massa pieken in het m / z bereik tot 250 Th worden geïdentificeerd ³² .

Discussion

Proton-transfer-reactie-massaspectrometrie (PTR-MS) gekoppeld aan tijdstip van vlucht (ToF) massaanalysatoren vormen een geldig compromis tussen de noodzaak tot identificatie en kwantificering van vluchtige organische verbindingen en de noodzaak voor snelle analytische profilering. De hoge massa resolutie die de ToF massanalysator kenmerkt geeft relevante gevoeligheid en massaspectra met aanzienlijke informatief inhoud. Bovendien verhoogt de toepassing van PTR-ToF-MS in combinatie met een auto-sampler en op maat gemaakt...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTR-TOF 8000 High-Resolution PTR-TOF-MS	Ionicon Analytik Ges.m.b.H.	PTR-TOF 8000	Een detector voor vluchtige organische verbindingen (VOC's) die continue VOC-kwantificering mogelijk maakt met een zeer hoge massa-resolutie
GERSTEL MPS 2XL	Gerstel		Een multifunctionele autosampler
Gas Calibration Unit	Ionicon Analytik Ges.m.b.H.	GCU-s / GCU-a	Een dynamisch gasverdunningssysteem dat variabele maar bekende hoeveelheden van verschillende standaardverbindingen levert in een dragergasstroom
TofDaq	Tofwerk AG	Gratis beschikbaar op http://soft.tofwerk.com/	Een data-acquisitiesoftware (voor spectra-acquisitie)
MATLAB	MathWorks	http://it.mathworks.com/products/matlab/	Een technische programmeertaal en interactieve omgeving voor algoritmeontwikkeling, datavisualisatie en data-analyse
R	The R Foundation	Gratis beschikbaar op https://cran.r-project.org/mirrors.html	Een taal en omgeving voor statistische computing en grafische weergave