Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Summary

Er wordt een gevoelige en nauwkeurige methode beschreven voor de kwantificering van celvrije microRNA's met behulp van een kleurstof-gebaseerde chemie en druppel digitale PCR-technologie.

Abstract

Circulerende (celvrij) microRNA's (miRNA's) zijn vrijgemaakt uit cellen in de bloedbaan. De hoeveelheid specifieke miRNA bij de omloop is gekoppeld aan een ziektetoestand en heeft het potentieel om te worden gebruikt als biomarker ziekte. Een gevoelige en nauwkeurige methode voor het circuleren van microRNA kwantificering met behulp van een op kleurstoffen gebaseerde chemie en druppeltje digitale PCR-technologie is onlangs ontwikkeld. Specifiek met behulp Locked Nucleic Acid (LNA) -gebaseerde miRNA-specifieke primers met een groen fluorescerend DNA-bindende kleurstof in een compatibel digitaal druppeltje PCR systeem is het mogelijk om de absolute kwantificering van specifieke miRNAs verkrijgen. Hier wordt beschreven hoe het uitvoeren van deze techniek om miRNA hoeveelheid in biologische vloeistoffen, zoals plasma en serum beoordelen, is haalbaar en effectief.

Introduction

MicroRNA's (miRNA's) worden door mogelijk alle cellen van het organisme vrijgegeven in de bloedcirculatie, als gevolg van actieve afgifte of necrotische en apoptotische processen. Celvrije miRNA's zijn gedetecteerd in de bloedbaan, hetzij als vrije stabiele moleculen of gebonden aan lipoproteïnen of omgeven in exosomen en microvesikels ^1-3. Men gelooft dat ze functioneren als cel-tot-cel communicatoren ⁴, en hun hoeveelheid verandert in aanwezigheid van kanker, hartaandoeningen of auto-immuunziekten ^5-7. Hun nauwkeurige en reproduceerbare kwantificering is de basis voor hun evaluatie als ziektebiomarkers. Echter, om verschillende redenen die elders al zijn beschreven ^8,9, kan miRNA-kwantificering in serum of plasma, evenals andere lichaamsvloeistoffen, erg uitdagend zijn ^10,11. We hebben onlangs een methode ontwikkeld voor de absolute kwantificering van circulerende miRNA's, gebaseerd op miRNA-specifieke LNA-primers en DNA-bindend kleurstof druppel digitale PCR (ddPCR) technologie ¹². Deze methodologie is toegepast op de validatie van miRNA borstkanker biomarkers ^13,14.

Na de verdeling van elk omgekeerd getranscribeerd miRNA-molecuul in een nanoliter-grootte druppel, is het mogelijk om het kopienummer van elk miRNA in elk monster te tellen, door in wezen het aantal groene, en dus positieve, fluorescente druppels te tellen. Zodra een PCR-reactie plaatsvindt, wordt een positieve telling bereikt, zonder de noodzaak om een standaardcurve vast te stellen of rekening te houden met de PCR-efficiëntie in de berekening van de doelhoeveelheid, zoals het gebeurt met kwantitatieve RT-PCR (RT-qPCR). Bovendien bleek ddPCR gevoeliger en nauwkeuriger te zijn dan RT-qPCR bij de kwantificering van circulerende miRNA's ¹⁵. In dit artikel presenteren we het gedetailleerde protocol van deze methodologie, waarbij de meest relevante stappen worden besproken en specifiek serum en plasma klinische monsters worden overwogen.

Protocol

MicroRNA isolatie uit plasma of serum

Opmerking: Plasma en serum voorbereiding is een belangrijke fase in circulerende miRNA kwantificering. Er is geen voorkeurswerkwijze voor plasma en serum bereiding. Het enige belangrijke ding om te overwegen is dat alle monsters van hetzelfde experiment moet worden verwerkt met behulp van exact dezelfde workflow. Start vanaf 200 pl serum of plasma. Totaal RNA kan worden geïsoleerd uit serum of plasma met behulp van commercieel verkrijgbare kits.

1. Protocol voor Total RNA (inclusief miRNA) Isolatie

1. Dooi serum / plasma monsters op ijs.
2. Voeg 1 ml Lysis Reagent (bijv., QIAzol) aan 200 gl serum / plasma.
3. Door vortexen gemengd en plaats de buis met het homogenaat op de bank bij kamertemperatuur 5 minuten.
4. Voeg 3 ul van een 4,16 nM oplossing van het synthetische miRNA cel-miR-39-3p van C. elegans.
5. Voeg 200 pl chloroform. Schud de buis krachtig gedurende 15 seconden. plaats the buis op de bank bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
6. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C om de fasen scheiding te verkrijgen: de bovenste waterfase RNA.
7. Breng de waterige fase naar een nieuwe buis, ongeveer 700 pl, overdracht van enige witte interfase materiaal te voorkomen.
8. Voeg 1 ml 100% ethanol en mengen door omkeren.
9. Pipet up 700 pl monster in een mini spinkolom geplaatst op een 2 ml verzamelbuis. Sluit het deksel en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 15 sec. Gooi het doorstroomkanaal.
10. Herhaal deze stap met behulp van de resterende monster.
11. Voeg 700 ul Buffer RWT de mini centrifugeerkolom, sluit het deksel en centrifugeer 15 sec bij 12.000 xg om de kolom te wassen. Gooi het doorstroomkanaal.
12. Pipet 500 pi Buffer RPE in de mini spin-kolom. Sluit het deksel en centrifugeer 15 sec bij 12.000 tpm. Gooi het doorstroomkanaal. Herhaal deze stap opnieuw.
13. Centrifugeer de mini spinkolom op volle snelheid gedurende 2 minuten om de spinkolom droogmembraan van resterende ethanol.
14. Breng de mini spinkolom een ​​nieuwe 1,5 ml verzamelbuis en pipet 35 gl RNase-vrij water op het membraan van de kolom.
15. Centrifugeer 1 min bij 12.000 xg om het RNA te elueren.
16. Bewaar het RNA bij -80 ° C.
    Opmerking: Aangezien RNA-concentratie niet nauwkeurig kan worden bepaald, gebruik vast volumes als maat voor input bedrag.

2. MicroRNA reverse transcriptie

1. Ontdooi de reverse transcriptie (RT) reagens mix componenten: 5x reactie buffer, nuclease-vrij water. Meng voorzichtig omkeren van de buizen en leg ze op ijs. Vlak voor het gebruik, verwijder het enzym mix uit de vriezer en plaats op ijs. Spin down alle reagentia.
2. Bereid het RT reagens in ijs zoals beschreven in Tabel 1. Bereid ten minste 10% overschrijden mix.
3. Meng de reactie door pipetteren, en dan spin down.
4. Incubeer gedurende 60 minuten bij 42 ° C.
5. Hitte-inactiveren de reverse transcriptase gedurende 5 minuten bij 95 ° C.
6. Onmiddellijk afkoelen tot 4 ° C.
7. Bewaar de cDNA bij -20 ° C.

3. cDNA Verwatering

1. Verdunnen de hoeveelheid cDNA template die nodig zijn voor de geplande ddPCR reacties in nuclease vrij water. Verdun de cDNA reactie tussen 1:50 en 1: 500 in water, afhankelijk van de doelgroep miRNA overvloed. Bewaar de verdunde cDNA bij -20 ° C. Het verdunde cDNA bleek stabiel te zijn gedurende ten minste 3 maanden bij -20 ° C.

4. Droplet Generation en PCR

Opmerking: Druppeltje generatie moet worden uitgevoerd op 8 monsters tegelijk. Technische replicaten zijn niet verplicht, vanwege de hoge reproduceerbaarheid van deze technologie ^12,15 .A templateloze Control (NTC) monster moet worden uitgevoerd in elke plaat en voor elke verschillende ddPCR staat.

1. Ontdooi en evenwicht van de master mix (bijv., EvaGreen Master Mix), microRNA primer set en cDNA bij RT.
2. Meng de Master Mix thoroughly door het buisje meerdere malen. Spin down alle reagentia.
3. Bereid de ddPCR mix zoals beschreven in Tabel 2. Wanneer meerdere ddPCR reacties worden uitgevoerd, stelt een ddPCR mix werkende oplossing. Maak minstens 10% meer dan mix.
4. Als alles in elkaar, meng en spin down de ddPCR mix.
5. Doseer 12 pi ddPCR mengen in een 96-well PCR plaat of PCR-buizen.
6. Voeg 8 ul van verdund cDNA template aan elke buis / well.
7. Steek de druppel generator cartridge in de houder.
8. Overdracht 20 ul van elk bereid monster tot monster putjes (middelste rij) van de druppel generator cartridge voorzichtig met vermijding van luchtbellen aan de bodem van de put.
9. Vul elke oliebron (onderste rij) met 70 pi druppel generator olie.
10. Haak de pakking over de patroonhouder en in te voegen in de druppel generator.
11. Sluit het deksel druppel generatie volgens gaan pr fabrikantotocol. Wanneer druppel generatie klaar is, opent u het deksel, verwijder de wegwerp pakking. Boven putjes van de cassette bevatten de druppeltjes.
12. Pipet langzaam en vloeiend 40 pl van de inhoud van de acht bovenste putjes (de druppeltjes) in één kolom van een 96-well PCR plaat.
13. Sluit de PCR-plaat met folie onmiddellijk na de overdracht van druppeltjes om verdamping te voorkomen. Gebruik doorboren is folie plaat afdichtingen die compatibel zijn met de naalden in de druppel lezer zijn.
14. Begin thermische fietsen (PCR) binnen 30 minuten van het afdichten van de plaat.
15. Voer de fietsen protocol volgens tabel 3.

5. Droplet Reading

1. Schakel de druppel lezer.
2. Beweeg de plaat uit de PCR-apparaat aan de druppel lezer.
3. Plaats de 96-well PCR plaat met de post-PCR druppeltjes in de basis van de plaathouder.
4. Plaats de bovenkant van de plaathouder op de plaat PCR. Druk stevig op beide ontgrendelingslipjestot aan de PCR-plaat in de houder te verzekeren.
5. Start de software van het systeem PC.
   1. Klik op Instellingen om het experiment (Absolute kwantificering) te definiëren en klik vervolgens op Uitvoeren om de druppel lezen te starten.
   2. Wanneer druppel lezen is voltooid, klikt u op "Analyze" knop om te openen en de gegevens te analyseren.
   3. Gebruik de 2D-amplitude plot in de analyse software om de positieve druppeltjes (lasso tool) (Figuur 1B) te selecteren.
   4. Gebruik het tabblad Events om het aantal positieve en de totale druppeltjes te controleren. Een totaal aantal van 18.000 - 21.000 druppels wordt meestal bereikt met tijdbasis ddPCR.
   5. Zodra de positieve druppels worden geselecteerd, de uitvoer van de miRNA concentratie waarden met behulp van de optie export CSV uit het tabblad Concentratie.

Results

De absolute hoeveelheid specifieke miRNAs per ml plasma of serum kunnen worden bepaald met een groene fluorescerende DNA-bindende kleurstof en druppeltje digitale PCR techniek. Figuur 1 toont het proces van positieve-druppeltjes selectie, waarbij de uiteindelijke miRNA concentratie bepaalt (kopieën / pl ) in de amplificatiereactie berekend met de analysesoftware. De hoeveelheid van elk miRNA in het bloed zeer verschillend, waarbij sommige species miRNA overvloediger dan ...

Discussion

Circulerende miRNAs aanwezig zijn in bloed bij extreem lage concentraties en de hoeveelheid RNA die kunnen worden geëxtraheerd uit plasma en serum monsters is laag. Daarom zijn ze moeilijk te kwantificeren met andere technieken zoals microarray en RNA sequentie. Bovendien is er een algemeen gebrek aan overeenstemming over gegevensnormalisatie en de aanwezigheid van endogeen "referentie" miRNAs in het bloed. In dit verband is een gevoelige techniek zoals druppeltje digitale PCR, staat het tellen van het aantal ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	Kolommen voor totale RNA, inclusief miRNA, extractie uit serum/plasma
100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequentie: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301	Kit voor microRNA reverse transcriptie
MicroRNA LNA PCR primer set	Exiqon	204000-206xxx en 2100000-21xxxxx	Primers voor miRNA amplificatie binnen druppels
QX200 druppel generator	BioRad	186-4002	Instrument gebruikt voor het lezen van druppels
QX200 druppel lezer	BioRad	186-4003	Instrument gebruikt voor het genereren van druppels
QuantaSoft software	BioRad	186-3007	Software voor gegevensverzameling en analyse
PX1 PCR plaat sealer	BioRad	181-4000	Plaat sealer
DG8 druppel generator cartridges en pakkingen	BioRad	186-4008	Cartridges gebruikt om monster en olie te mengen om druppels te genereren
QX200 ddPCR EvaGreen supermix	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
QX200 druppel generator olie voor EvaGreen kleurstof	BioRad	186-4005	Olie voor druppelgeneratie