Antilichaam bindende specificiteit voor Kappa (VK-) lichte keten bevattende de Mens (IgM) antilichamen: Polysialic Acid (PSA) Gehecht aan NCAM als Case Study

Samenvatting

We presenteren een protocol om eiwitdeeltjes te identificeren die antigenen bevatten voor menselijke en muis IgM-antilichamen met specifieke kappa (Vκ) lichte ketens. Dit protocol is niet beperkt tot IgM-klasse antilichamen, maar is van toepassing op alle immunoglobuline isotypes die hun antigeen met voldoende hoge affiniteit targeten tijdens immunoprecipitaties.

Samenvatting

Antilichamen van het IgM-isotype worden vaak verwaarloosd als potentiële therapieën in menselijke onderzoeken, diermodellen van menselijke ziekten, evenals detectiemiddelen in standaard laboratoriumtechnieken. In tegenstelling hiermee hebben verschillende humane IgM's bewijs van werkzaamheid aangetoond in kankermodellen en modellen van CNS-stoornissen, waaronder multiple sclerose (MS) en amyotrofische laterale sclerose (ALS). Redenen voor hun gebrek aan overweging omvatten moeilijkheden om IgM-antilichamen tot expressie te brengen, te zuiveren en te stabiliseren, uitdagingen om (niet-eiwit) antigenen te identificeren, lage affiniteitsbinding en fundamentele kennisgaten in koolhydraat- en lipidenonderzoek.

Dit manuscript gebruikt HIgM12 als voorbeeld om een gedetailleerd protocol te bieden om antigenen te detecteren door Western blotting, immunoprecipitatie en immunocytochemie. HIgM12 richt zich op polysialische zuur (PSA) dat is bevestigd aan het neurale celadhesiemolecuul (NCAM). Vroeg postnataal muizenhersenweefsel van wild type (WT) en NCAM knockout (KO) muizen die de drie belangrijkste centrale zenuwstelsel (CZS)-splicevarianten NCAM180, 140 en 120 missen, werd gebruikt om de belangrijkheid van NCAM voor binding aan HIgM12 te evalueren. Verdere enzymatische vertering van CZS-weefsel en gekweekte CZS-cellen met behulp van endoneuraminidases leidde ons tot de identificatie van PSA als het specifieke bindingsepitop voor HIgM12.

Inleiding

Antilichamen van de IgM isotype tonen groot therapeutisch potentieel voor de behandeling van diverse ziekten waaronder kanker en aandoeningen van het CZS ^1-7. De Vollmers 'groep welke verschillende antilichamen in kankerpatiënten voor potentieel gebruik als tumor-specifieke biomarkers of actieve therapeutische middelen die kunnen kwaadaardige cellen te doden door het induceren apoptoseroutes ^4,8,9 zijn. Interessant alle geïdentificeerde antilichamen met therapeutische potentie zijn de IgM isotype en behoren tot de groep van "natuurlijke auto-antilichamen" (NAbs).

Ook de Rodriguez groep welke muis en humane antilichamen die remyelinisatie stimuleren chronisch gedemyeliniseerde ruggenmergletsels in modellen van multiple sclerose (MS). Identiek aan antilichamen met anti-kanker effecten, alle remyelinisatie bevorderen antilichamen NAbs en de IgM isotype ^1,6,7,10. De precieze antigenen voor de meeste geïdentificeerde IgM's zijn nog steeds undetermined met inbegrip van de mens-remyelination bevorderen antilichaam rHIgM22, momenteel in Fase I klinische studies voor MS-patiënten ^11. Ondanks herhaalde pogingen door deskundigen op het gebied van vetten en koolhydraten onderzoek, zowel in de academische setting en in samenwerking met de industrie ^11, probeert te identificeren rHIgM22's antigen zijn niet succesvol geweest. Het falen van standaard technieken voor antigenen van IgG-antilichamen te identificeren met IgM antilichamen identificeert een absolute noodzaak om specifieke werkwijzen voor deze antilichamen die waarschijnlijk doelwit koolhydraat of lipide antigenen verfijnen.

De focus van dit manuscript is de menselijke regeneratieve antilichaam HIgM12 en de experimentele procedures gebruikt om zijn antigeen te identificeren. HIgM12 antilichaam werd geïdentificeerd uit patiënten met macroglobulinemie Waldenström, stimuleert neurietuitgroei in vitro ^12-14 en doelen polysialic acid (PSA) gekoppeld aan de neurale cel adhesiemolecuul (PSA-NCAM) ^15,16. HIgM12 verlengt levensduur in een muismodel van ALS ¹⁷ en verbetert de functionele uitkomst in Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) geïnfecteerde muizen. Concreet HIgM12 stimuleert spontane horizontale en verticale motorische activiteit bij chronisch gedemyeliniseerde muizen en verhoogt het aantal kleine en middelgrote diameter ruggenmerg axonen acht weken na een eenmalige, lage dosis intraperitoneaal geïnjecteerd antilichaam ^18.

De neurale cel adhesiemolecuul (NCAM) is een glycoproteïne van de immunoglobuline (Ig) superfamilie tot expressie gebracht op het celoppervlak van neuronen, glia, skeletspier en natuurlijke killer cellen ^19-25. De drie belangrijkste NCAM isovormen genoemd NCAM180, NCAM140 en NCAM120, alternatieve splice varianten van een primair transcript die alleen verschillen in hun cytoplasmatische domein. In het CZS, NCAM de belangrijkste polysialylated molecuul (> 95%) met lange, negatief geladen siaalzuur homopolymeren. Polysialic eencid met n> 10 wordt genoemd PSA maar korter oligomere structuren bestaan ​​die ook biologisch relevant. Andere polysialylated eiwitten tot expressie gebracht in het centrale zenuwstelsel zijn SynCAM1 ^26, neuropiline-2 (NHP-2) ^27,28 en een natrium kanaal subunit ²⁵ (zie voor een overzicht ^29).

De hier beschreven methoden toe antigeen identificatie van mens en muis immunoglobulinen met specifieke kappa (VK-) lichte ketens (VκI, VκIII of VκIV lichte ketens voor menselijke antilichamen en VκI lichte ketens voor muizen antilichamen), ongeacht isotype van het antilichaam (bijvoorbeeld IgG, IgM , IgA, IgD of IgE). Deze beperking is van het gebruik van proteïne L agarose voor immunoprecipitaties met antilichamen van het IgM isotype. Alternatieve strategieën kunnen omvatten mannose bindende lectines en secundaire IgG anti-IgM-antilichamen covalent gebonden aan kralen agarose, die de toepasbaarheid van deze werkwijze kan worden uitgebreid tot meer IgM antilichamen incLuding mensen met een lambda (λ) lichte ketens (zie bespreking). Verhoudingen van serum IgM VK-lichte ketens vergeleken met IgM λ lichte ketens afkomstig van gezonde individuen zijn 1,5: 1 ^30.

Op basis van de chromatografische methode hier gebruikt scheiden, verrijken en immunologisch detecteren bepaalde moleculen ³¹ zijn alle antigenen moeten ten minste een kleine eiwitdomein omvatten. Specifieke binding epitoop van het antilichaam kan binnen of buiten het eiwitdomein (bijvoorbeeld in glycoproteïnen, lipoproteïnen). Initial biochemische stappen gebruikt om de specifieke antigeen identificeren HIgM12, respectievelijk om een ​​beperking van de lijst van potentiële kandidaten, zijn de meest cruciale stappen in deze methode. celtype specifieke preparaten en cel morfologie gebaseerde karakteriseringen worden beschreven gliacellen maar deze werkwijze kan worden geëxtrapoleerd naar andere celtypen binnen of buiten het CZS tegemoet.

Er is een dringendemoeten nieuwe of gewijzigde technieken toepasbaar voor het toenemende aantal IgM antilichamen met therapeutische potentie voor andere menselijke ziekten met name in die gevallen (de meeste antigenen IgM) wanneer het antilichaam doelen koolhydraat of lipide structuren.

Protocol

Animal protocollen en procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen en door de Mayo Clinic de institutionele dierlijke zorg en het gebruik commissies (Mayo IACUC protocol nummer # A51912) goedgekeurd.

1. Algemeen CNS Tissue Voorbereiding

1. Genereer NCAM deficiënte (KO) muizen op C57 / Bl6 achtergrond (vriendelijk verschaft door Dr. Lynn Landmesser, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio), heterozygote NCAM muizen en wild type (WT) nestgenoten (C57 / Bl6) door het kruisen van heterozygoten. Genotypering van NCAM KO muizen eerder beschreven ^32-34, niet nader toegelicht.

Opmerking: Stappen 1,2-1,6 zijn optioneel.

2. Voor de ingreep, dienen een pentobarbital oplossing (voorraad 25 mg / ml; 50/100 pl pentobarbital voor vroege postnatale respectievelijke adulte) via intraperitoneale injectie (27 gauge naald en 1 mlspuit).
3. Wacht 2 minuten of totdat het dier een chirurgische vlak van anesthesie bereikt. Dien extra verdoving nodig tijdens elke operatie een chirurgische vlak van anesthesie te handhaven. Gebruik teen knijpen-response methode om de diepte van de anesthesie te bepalen. De dieren mogen niet reageren voordat u verder zijn.
4. Maak een 0,5-1 cm laterale incisie door de omhulling en buikwand net onder de ribbenkast. Zorgvuldig scheiden van de lever van het middenrif. Voeg een kleine incisie in het membraan met een gebogen stompe schaar. Verdere membraan incisie langs de gehele lengte van de ribbenkast naar de borstholte bloot te leggen.
5. Plaats gebogen, stompe schaar langs één zijde van de ribbenkast, nauwkeurig verplaatsen van de longen, en een snede door de ribbenkast tot aan het sleutelbeen. Maak een soortgelijke bezuinigen op de contralaterale zijde. Het opheffen van het borstbeen weg, zorgvuldig trimmen elk weefsel aan te sluiten op het hart.
6. Een insnijding aan het dier'S rechter atrium met behulp van iris schaar om zo groot een stopcontact mogelijk te maken. Injecteer langzaam 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in linker ventrikel van het dier (lichtrood; stroomsnelheid: 1 ml / min) met behulp van een 10 ml spuit met 27-gauge naald. Gebruik de druk / PBS stroom niet verhogen tijdens de perfusie om weefsel vernieling te vermijden.
7. Onthoofden neonatale muizen met chirurgische schaar.
8. Verwijder de hersenen door grijpen de oogkassen met een pincet en door toevoeging van een kleine schaar in de wervelkolom. Snijd de schedel naar de voorkant op oorhoogte. Trek de schedel en plaats voorzichtig de hersenen in een 60 mm petrischaal gevuld met 10 ml ijskoud medium dissectie op ijs (tabel 1). Plaats elke hersenen in een 1,5 ml microcentrifugebuis en onmiddellijk slaan op droog ijs (-79 ° C).
9. Incise de kleine hersenen en de hersenstam uit bevroren hersenen met een schone scheermesje op ijs. Werk snel om te voorkomen dat het ontdooien van het weefsel.
10. Weeg debevroren hersenen, in een 15 ml buis op ijs en voeg ijskoude lysisbuffer (zie tabel 1) tot een eindconcentratie van 150 ug hersenweefsel per ul lysisbuffer. Herhaal dit voor de resterende cerebra. Houd hersenen op ijs te allen tijde voor de stappen die 1,9-1,11.
11. Homogeniseren hersenen in lysisbuffer door trituratie door middel van een 1 ml pipet tip (10 keer), gevolgd door tritureren door een 5 ml spuit uitgerust met een 27-gauge naald (10 keer). Incubeer hersenen lysaten gedurende nog 30 minuten op ijs om volledige lysis weefsel mogelijk.
12. Verwijderen detergens-onoplosbaar materiaal en hersenlipiden via seriële centrifugatie (vier ronden bij 19.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C). Teruggooi (wit) myeline en celafval bevatten pellet maar behouden het supernatant na elke centrifugeren stap. Aliquot hersenen lysaten en bewaar bij -80 ºC.

2. Immunoprecipitaties Met behulp van Human IgM's (HIgM12 en isotype controle IgM) als een "Pull-down" Agent van Cerebral Lysaten van WT en NCAM knock-out muizen

1. Eiwit L Agarose Bead Voorbereiding ^9,35,36
   1. Bereid 200 ml IP buffer zoals BSA (zie tabel 1). Bereid je nog eens 200 ml van hetzelfde IP-buffer zonder BSA.
   2. Per immunoprecipitatie reactie overdracht 100 ul Proteïne L agarose suspensie met behulp van een 200 gl pipet in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Niet vortex eiwit L agarosekralen! Voeg 1 ml van IP buffer (zie tabel 1) aan elke buis. Meng Eiwit L agarose en IP-buffer handmatig door middel van inversie (vijf keer).
   3. Wash eiwit L agarosekralen vier keer door centrifugeren in een benchtop centrifuge (1000 xg, 2 min, 25 ºC). Opstijgen supernatant met behulp van een 200 ul pipet zonder de agarose pellet. Herhaal wasstappen 2.1.2 tot 2.1.3 nog driemaal.
   4. Equilibreren eiwit L agarose in 1 ml vers toegevoegde IP buffer op een rollenbank gedurende de nacht bij 4 ° C.
2. Antilichaam-antigeen-Agarose L Complex Vorming en Antigen Detection in Western Blots
   1. Incubeer 30 mg gelyseerd hersenweefsel (~ 200 ul lysaat) in 1 ml ijskoude IP buffer met 20 ug IgM antilichaam (HIgM12) in een 1,5 ml microcentrifugebuis overnacht op een wals bij 4 * C.
   2. Spin down eiwit L agarose korrels (van stap 2.1.4) in een benchtop centrifuge gedurende 2 min bij 1000 x g, 4 ° C. Verwijder het supernatant met een pipet 200 ul zonder de agarose pellet. Voeg de gekoelde antilichaam-brain lysaatoplossing (uit stap 2.2.1) het eiwit L agarose met een 1 ml pipet.
   3. Incubeer de antilichaam-antigen-eiwit L agarose suspensie gedurende 2 uur op een wals bij 4 * C. Was het antilichaam-antigeen complex gekoppeld aan L agarose door middel van centrifugatie bij 1000 g gedurende 2 min, 4 ° C. gooi voorzichtig de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren en voeg 1 ml ijskoude IP buffer met 0,2% BSA.
   4. Herhaal de wasstap nog een keer met behulp van ijskoude IP buffer met 0,2% BSA en twee extra keer met behulp van ijskoude IP buffer zonder BSA.
   5. Spin down antilichaam-antigen complex gekoppeld aan L agarose bij 1000 g gedurende 2 min, 4 ° C. Gooi supernatant eerst geheel met een 200 ul pipet tot ~ 50 pi oplossing overblijven boven het eiwit L agarose pellet gevolgd door een 10 ul pipet. Houd de monsters op ijs.
   6. Voeg 40 ul van IP elutiebuffer (zie tabel 1) per 1,5 ml microcentrifugebuizen, vinger flick tubes 6 keer en verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C. Zet monsters op ijs gedurende 2 minuten en spinnen gedurende 30 sec bij 13.000 x g, 4 ° C.
   7. Transfer supernatant met een pipet 10 ui (~ 35 pi totaal) in een schoon 1,5 ml microcentrifugebuis zonder de pellet te verstoren. Bevestigen afwezigheid Proteïne L agarose korrels door spoelen in een kleine hoeveelheid geëlueerde monster aan de binnenste buiswand.
      Let op: "Granular"eiwit L agarose korrels duidelijk zichtbaar indien aanwezig.
   8. Als eiwit L agarosekorrels aanwezig zijn, spin down sample nog 30 sec bij 13.000 xg en overdragen supernatant aan de buis te reinigen. Herhaal stap totdat er geen agarose korrels worden gedetecteerd.
   9. Laad 10-20 ui geëlueerde monsters per putje op SDS-polyacrylamidegel in Tris / Glycine / SDS buffer (zie tabel 1).
      Opmerking: Gebruik 7,5% of 4-20% gradiënt gels met 50 gl per putje laadvolume voor de detectie van PSA-NCAM of NCAM isovormen (gel afmetingen (B x L x dikte: 8,6 x 6,7 x 0,1 cm).
   10. Run gels ~ 1 uur bij 100 V (1,74 V / cm ²⁾ op benchtop. Extra koeling is niet vereist voor deze stap ^37,38.
   11. Transporterende eiwitten op PVDF (polyvinylideenfluoride) membraan (poriegrootte 0,45 pm) gedurende 2,5 uur in de koude kamer bij 100 V (1,74 V / cm ²⁾ met koud transferbuffer (5-10 ° C) (zie tabel 1).
   12. Block membranen wi 10% (w / v) droge melkpoeder in PBS-T gedurende 1 uur bij 25 ° C op een benchtop orbitaalschudder, wassen membranen tweemaal gedurende 10 min met PBS-T en probe overnacht met primair antilichaam in 5% BSA in PBS T op een orbitale schudder in de koude kamer.
   13. De volgende ochtend wasbeurt membranen eenmaal kort met overmaat PBS-T bij 25 ° C (inclusief deksel en houder) gevolgd door 3 wassingen met PBS-T gedurende 10 minuten elk op een schudapparaat (80 rpm) (alle wasstappen worden uitgevoerd bij 25 ºC).
   14. Voeg secundair antilichaam (mierikswortel peroxidase (HRP) geconjugeerd anti-humaan anti-IgM antilichaam (voor HIgM12) (verdunning 1: 30.000) in 5% droge melkpoeder in PBS-T gedurende 1 uur bij 25 ° C op een schudapparaat (70 rpm ).
   15. Wassen membranen uitvoerig eenmaal kort met overmaat PBS-T bij 25 ° C (inclusief deksel en houder) gevolgd door 3 wassingen met PBS-T gedurende 10 minuten elk op een schudapparaat (80 rpm) (alle wasstappen worden uitgevoerd bij 25 ° C) .
   16. Meng 1 ml koud verbeterde chemiluminescence HRP substraat component A (luminol versterkte reagens) met 1 ml van component B (oxidatiemiddel) (per mini blot) en 25 ° C.
   17. Gebruik plastic tang om de membranen te dragen op een papieren handdoekje om overtollige vloeistof te verwijderen (houd ze op de zeer randen). Vochtdozen met keukenpapier en zet membranen terug in de houders (één per membraan). Onmiddellijk Voeg 2 ml van de voorgemengde versterkte chemiluminescentie HRP substraat (verbinding A + B) (stap 2.2.16.) Aan elk membraan en incubeer gedurende 2 minuten bij 25 ° C op een schudapparaat (90 rpm). Zorg ervoor dat membranen gelijkmatig bevochtigd door de chemiluminescentie reagens.
   18. Transfer membranen in een doorzichtige plastic hoes en verwijder overtollige vloeistof en luchtbellen met keukenpapier. Zet membranen in plastic hoes in een filmcassette en uiteindelijk tape de kunststof huls in de cassette. Sluit de cassette.
   19. Neem de cassette, film, timer en een schaar in de donkere kamer. Snijd rechter bovenhoek van elk film ter oriëntatie, bloot (verschillende) films voor verschillende perioden (10 sec, 1 min, 10 min) en films in een film ontwikkelaar ontwikkelen.

3. Endoneuraminidase-NF Digestie van PSA Gehecht aan NCAM ³⁹

1. Digest gelyseerd hersenweefsel van postnatale dag (P) 7 WT-muizen en P7 NCAM KO muizen (bereid uit stap 1,12) gedurende 2 uur op ijs met behulp endoneuraminidase-NF (ENDO-NF) zoals geïllustreerd in tabel 2 ^39.
2. Voeg 5 ul van 4x Laemmli monster buffer aan elke buis (1-6) uit stap 3.1 (tabel 2).
3. Load monsters op een 4-20% gradiënt SDS-polyacrylamidegel en herhaal stap 2.2.10 tot 2.2.19. Probe membranen HIgM12 (1 ug / ml), in de handel verkrijgbare anti-PSA-mAb (kloon 2-2B) (1 ug / ml) en β-actine antilichaam (laadcontrole) (1 ug / ml) in 5% BSA in PBS -T.

4. Voorbereiding van de Rat en Muis CNS Cultures

1. Voorbereiding van Glass Coverslips
   1. Acid-wash 25 mm dekglaasjes in 1 M HCl bij 50 - 60 ºC voor 4-16 uur in een zuurkast met een glazen container. Schud dekglaasjes zo nu en dan door middel van zachte zwenken.
   2. Was de dekglaasjes uitgebreid in gedestilleerd water (3x). Zorg ervoor te wassen uit het zuur tussen de gestapelde dekglaasjes.
   3. Spoel dekglaasjes in 100% ethanol en droog ze op Parafilm in een celkweek kap. Een dag voor gebruik, verwarm de dekglaasjes gedurende 24 uur in een glazen bak met deksel bij 100 ° C in een oven.
   4. Zet dekglaasjes in 6-putjes en jas met 3 ml van 40 ug / ml poly-D-lysine in steriel water gedurende 1 uur bij 37 ° C.
   5. Was tweemaal met steriel water, droog volledig onder celcultuur motorkap en toe te passen UV-licht gedurende 20 minuten.
2. Voorbereiding van de Tissue Culture Plastic voor CNS Cells
   1. Coat 60 mm celkweek gerechten of 75 cm ² weefselkweek kolven met 3ml of 10 ml van respectievelijk 40 ug / ml poly-D-lysine in steriel water gedurende 1 uur bij 37 ° C.
   2. Was tweemaal met water, droog volledig onder celcultuur motorkap en toe te passen UV-licht gedurende 20 minuten.
3. Rat gemengd Glia Isolation ⁴⁰
   1. Verdoven neonatale ratten in IACUC goedgekeurd knaagdier euthanasie kamer met CO ₂ gastoevoer (volledig geautomatiseerd). Gebruik teen knijpen-response methode om ongevoeligheid van het dier te bepalen. Onthoofden neonatale Sprague Dawley rat (P0P1) (6 - 10 pups per keer).
   2. Verwijder de hersenen door grijpen de oogkassen met een pincet en door toevoeging van een kleine schaar in de wervelkolom. Snijd de schedel naar de voorkant op oorhoogte. Trek de schedel en plaats voorzichtig het brein in een 60 mm petrischaal gevuld met 10 ml ijskoude ontleden medium op ijs (zie tabel 1).
   3. Herhaal dit voor de resterende jonge ratten (6-10 pups). Houd weefsel op het ijs voor de stappen 4.3.2 - 4.3.7.
   4. Verdeel de grote hersenen over de middellijn in twee hersenhelften en vervolgens afgesneden olfactorische bollen, basale ganglia onder de cerebrale cortex en de hippocampus met Dumont tang. Plaats de geïsoleerde cerebrale cortex in een schone petrischaal met het ontleden van medium op ijs.
   5. Neem een ​​cortex. Verwijder de hersenvliezen met een pincet met fijne tips onder een dissectie microscoop.
   6. Herhaal dit met de resterende cortex. Plaats alle hersenvliezen-vrije cortex in een schone petrischaal op ijs.
   7. Combineer corticale halfrond uit alle pups in een 60 mm petrischaal en het gebruik van een steriel scheermesje om het hersenweefsel snijd in 1 mm gehakt stukken.
   8. Breng het gehakt hersenweefsel met behulp van een 10 ml pipet in een steriele, ongestreken 500 ml glazen kolf en voeg 10 ml van ijskoude ontleden medium per hersenen van de rat. Zwenk de kolf tijdens het toevoegen van 1 ml trypsine-oplossing in HBSS (Hank's gebalanceerde zoutoplossing) (5 mg / ml trypsine) om 9 ml HBSS per rattenhersenen. Voeg 2% Van het totale volume DNase I-oplossing (1 mg / ml) en 2% van het totale volume _{MgSO4-oplossing} (3,82% MgSO ₄ in HBSS (w / v)) om het hersenweefsel suspensie en schud zachtjes.
   9. Trypsinize weefsel onder voorzichtig schudden op een roterende schudder gedurende 30 min bij 37 ° C. Controleer weefselstukjes zweeft tijdens deze stap en niet sedimenteren op de bodem. Verhoog de draaisnelheid indien nodig.
   10. Voeg foetaal runderserum (FBS) tot een eindconcentratie van 10% (v / v) en meng door omzwenken 10 keer gedurende 10 sec. Afkoelen weefsel suspensie in ijswater gedurende 15 minuten. Swirl kolf voorzichtig vijf keer per seconde min.
   11. Zacht overdracht het weefsel suspensie in steriele 50 ml buizen ter 25 ml of 50 ml pipetten en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g, 4 ° C.
   12. Verwijder het supernatant en resuspendeer voorzichtig gedigereerd CZS-weefsel in 15 ml ijskoude ontleden medium aangevuld met 5 ml foetaal runderserum, 0,4 ml _{MgSO4-oplossing} (3,82%MgSO ₄ in HBSS) en 1,6 ml DNase I (1 mg / ml).
   13. Split weefsel schorsing even in twee steriele 15 ml buizen (~ 10 ml elk) en langzaam fijnstampen met behulp van een 10 ml pipet (10 maal) tot de schorsing troebel / melkachtig. Houd gesuspendeerde cellen op ijs bij het verwerken van de volgende buis. Wacht 3 minuten tot overige gedigereerd CNS weefsels sediment op de bodem van de buis. Overdracht supernatant 50 ml tube reinigen zonder de pelletfractie.
   14. Optioneel passeren troebele supernatanten door middel van 40-micron cel zeef en combineer de resulterende enkele celsuspensie in steriele 50 ml buizen op ijs.
   15. Spin celsuspensie gedurende 5 minuten bij 200 x g, 4 ° C.
   16. Verwijder het supernatant met behulp van een 10 ml pipet tot ~ 2 ml ontleden medium overblijven bovenop de celpellet.
   17. Vinger flick cel pellets in 50 ml buizen (~ 10 keer). Voeg langzaam 5 ml warm groeimedium (zie tabel 1) aan de celsuspensie onder zachtde hand wervelende de buis.
   18. Eventueel herhalen DNase stap 4.3.12 voor een extra 10 minuten op ijs met verse DNase I-oplossing en _{MgSO4-oplossing} in het geval van zichtbare weefsel clusters of DNA klonten. Swirl buis handmatig 5 keer per seconde min.
   19. Plaat 50.000 cellen per 25 mm dekglaasje in een plas 400 pl groeimedium in een 6-putjes en liet de cellen hechten gedurende 30 min in een celkweek incubator (5% _CO2, 37 ° C).
   20. Voor confluent (binnen 24 - 48 uur na plating) 60 mm celkweek gerechten en 75 cm ² weefselkweek kolven, plaat 500.000 cellen (60 mm gerecht) of 2 miljoen cellen (75 cm ² flessen).
   21. Voorzichtig Voeg 2 ml (per putje, 25 mm glazen dekglaasjes in 6-putjes), 3 ml (60 mm schalen) of 10 ml (75 cm ² flessen) warm groeimedium aan elk putje. Incubeer cellen 's nachts en verander medium volledig de volgende ochtend. Dan veranderen medium elke andere dag (dag 3, dag 5, dag 7, etc.).
       Neete: Rat gemengde glia culturen zijn klaar om te gebruiken voor immunocytochemie of biochemie 24 - 48 uur na plating.
4. Mouse Mixed glialculturen
   1. Identiek aan de dissectie van de neonatale rattenhersenen is omschreven in artikel 4.3.1 tot 4.3.6, onthoofden P0 neonatale WT en NCAM knock-out muizen met C57 / Bl6 achtergrond, verwijderen hersenen en zet ze in ijskoud dissectie medium (zie tabel 1). Blijf weefsel op ijs te allen tijde.
   2. Verdeel de grote hersenen over de middellijn in twee hersenhelften en vervolgens afgesneden olfactorische bollen, basale ganglia onder de cerebrale cortex en de hippocampus met Dumont tang. Plaats de geïsoleerde cerebrale cortex in een schone petrischaal met HBSS op ijs.
   3. Neem een ​​cortex. Verwijder de hersenvliezen met een pincet met fijne tips onder een dissectie microscoop. Herhaal dit met de resterende cortex. Plaats alle hersenvliezen-vrije cortex in een schone petrischaal op ijs.
   4. Transfer corticale hemispheres met 1 ml pipet uit elke muis in afzonderlijke, steriele 15 ml buizen. Voeg 1,2 ml ijskoude ontleden medium aan elke hersenen en mechanisch verstoren het hersenweefsel te pipetteren 2 maal op en neer met een 1 ml pipet tip.
   5. Voeg 150 ul papaïne oplossing (10 mg / ml in PBS), 100 ul DNase I-oplossing (1 mg / ml in HBSS) en 50 gl MgSO ₄ (3,82% in HBSS) aan elke hersenen en meng door de vinger te vegen.
   6. Incubeer de hersenen suspensie gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een waterbad en meng hersenen schorsingen elke tweede minuut door de vinger te vegen. Voeg 1 ml FBS per buis, mengen en afkoelen van het weefsel suspensie gedurende 10 minuten op ijs.
   7. Spin down het hersenweefsel gedurende 4 min bij 200 xg, 4 ° C en resuspendeer de weefsels pellet in 1 ml ijskoude ontleden buffer aangevuld met 70 ul DNase I-oplossing (1 mg / ml in HBSS) en 30 gl _MgSO4 oplossing (3,82% in HBSS).
   8. Vermaal het hersenweefsel met een FBS-gecoate 1 ml pipetpunt(~ 5 maal) totdat de bovenstaande vloeistof troebel wordt. Passeer de bovenstaande vloeistof door een 40-micron cel zeef en breng in een schone buis op ijs.
   9. Pellet gemengde gliale cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 200 x g, 4 ° C. Aspiraat supernatant tot ~ 100 ul medium overblijven bovenop de celpellet. Resuspendeer celpellet door de vinger te vegen (~ 5 keer) en voeg 1 ml warm groei muis medium (zie tabel 1).
   10. Eventueel los toegankelijk celgroepen en gelyseerde cellen / DNA geprecipiteerd door voorzichtig pipetteren de celsuspensie op en neer (vijfmaal).
   11. Plate muis gemengde gliacellen op PDL-gecoat glas dekglaasjes of 60 mm gerechten zoals beschreven in stap 4.3.19 - 4.3.21. Was de cellen de volgende ochtend met warm groei muis medium en vervolgens om de andere dag. Muis gemengde glia is gebruiksklaar voor immunocytochemie 48-72 uur na uitplaten.
5. Rat Microglia Isolation
   1. Cultuur rat gemengdglia in 75 ^cm2 weefselkweek flessen in groeimedium (zie tabel 1) gedurende 10 dagen. Schud microgliale cel clusters van gemengde gliale kweken op een roterende schudinrichting in een celkweek incubator (5% _CO2, 37 ° C) bij 140 rpm gedurende 1 uur.
   2. Haal de microglia-bevattende supernatant van gemengde glia culturen, door te geven door middel van een 40-micron cel zeef en houd de cel suspensie in steriele 50 ml buizen.
      Opmerking: Microgliale culturen gewoonlijk> 95% zuiver na deze stap met weinig verontreinigende OPC en zeer weinig astrocyten.
   3. Eventueel vervangen groeimedium op gemengde glia culturen voor toekomstige microglia shake-offs. Typisch voer transactie in verschillende microglia shake-offs (eenmaal per week) van gemengde gliale culturen.
   4. Eventueel naar hogere zuiverheid 95% plaat krijgt 10 ml van de microglia-supernatant (stap 4.5.2) per 100 mm petrischalen en geïncubeerd in een celkweek incubator gedurende 30 minuten bij 37 ° C. alleen microglia zal hechten aan petrischaaltjes, terwijl de astrocyten en OPC's in de bovenstaande vloeistof blijven.
   5. Schud petrischaaltjes met de klok mee en tegen de klok in (vijf keer per stuk) in de celkweek kap. Aspireren celkweekmedium volledig en vervangen door 10 ml groeimedium. Resulteert microglia culturen> 98% zuiver.
   6. Cultuur microglia tot 7 dagen in DMEM aangevuld met 1% FBS en 1% penicilline / streptomycine.
6. Rat OPC / oligodendrocyt Isolation
   1. Voor het verkrijgen van sterk verrijkt OPC culturen schudt microgliacellen eerst van 10 dagen oude gemengde gliale kweken gekweekt in 75 ^cm2 kolven op een roterende schudinrichting bij een celkweek incubator (5% _CO2, 37 ° C) bij 140 rpm gedurende 1 uur. Gooi microglia alleen bevattende bovenstaande vloeistof of het gebruik voor microglia-specifieke experimenten (zie stap 5.5).
   2. Vervang de microglia-bevattende bovenstaande vloeistof met 10 ml groeimedium en afschudden gemengde gliale culturenander 18 uur op een roterende schudinrichting bij 200 opm (5% _CO2, 37 ° C).
   3. Verzamel de microglia- en OPC-bevattende supernatant van gemengde glia culturen en passeren door een 40-micron cel zeef. Verzamel de celsuspensie in steriele 50 ml buizen.
   4. Eventueel vervangen groeimedium op gemengde glia culturen voor toekomstige OPC shake-offs.
      Opmerking: OPC's blijven woekeren op astrocytaire feeder lagen en kan worden geschud-korting op het tweede en derde keer (één keer per week), zij het met een lager rendement.
   5. Plaat 10 ml microglia- en OPC-supernatant in 100 mm Petrischalen en incubeer in celkweek incubator gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Microglia zal hechten aan de petrischaaltjes, terwijl OPC's en astrocyten in de bovenstaande vloeistof blijven.
   6. Schud petrischaaltjes met de klok mee en tegen de klok in (5 keer elk) in een celkweek kap. Neem slechts een paar petrischaaltjes in een tijd van celkweek incubator (microglia start loskomen van het Huisdierri gerechten als krachtig geschud in koelere gemiddeld).
   7. Verzamelen en combineren de OPC-bevattende supernatant in 50 ml buizen. Voeg desgewenst kweekmedium Petrischalen voor gebruik bij microglia-specifieke experimenten.
   8. Eventueel verdere verhoging van de zuiverheid van OPC culturen Herhaal stap 5.6.5 en 5.6.6 eenmaal met verse petrischalen belope van microglia in OPC preparaten verlagen.
   9. Spin down-verrijkt OPC bevattende supernatant in centrifuge gedurende 5 minuten bij 250 xg, 4 ºC. Zuig het supernatans zonder de celpellet. Reactie 3 ml van de bovenstaande vloeistof boven de pellet te resuspenderen en start OPC door vinger te vegen (10 keer).
   10. Voorzichtig fijnstampen OPC celgroepen door middel van een 10 ml pipet (5-10 maal).
   11. Aantal cellen en plaat 50.000 OPC per 25 mm dekglaasje (PDL-coating) in een plas 400 pl groeimedium in een 6-putjes en liet de cellen hechten gedurende 30 min in een celkweek incubator (5% _CO2, 376, C). Zachtjes voeg 2 ml warm proliferatie medium (zie tabel 1) aan elk putje. PDL-gecoate 60 mm celcultuurschalen, plate 1-1.500.000 OPCs in 3 ml medium proliferatie.
   12. Zorgvuldig vervangen FBS-bevattend proliferatie medium met verse proliferatie medium 3 uur na plating de OPC (zorg ervoor dat OPC's goed bevestigd en niet los tijdens het medium verandering). Exchange medium elke tweede dag.
       Opmerking: Rat OPC culturen bereid met behulp van dit protocol zijn meestal 90% zuiver met microglia als de belangrijkste soort vervuilende cel, gevolgd door astrocyten.

5. Immunocytochemie behulp HIgM12 in het jeugdwerk Cellen Glial

1. Triple-label Immunofluorescentie behulp HIgM12, anti-PSA mAb, en het type cel specifieke markers in het jeugdwerk Glial Cellen van WT en NCAM knock-out muizen
   1. Onder levende cellen omstandigheden, label 60% confluent muis gemengd glia culturen uit WT en NCAM KO muizen gekweekt op PDL-gecoate25 mm dekglaasjes met HIgM12 (10 ug / ml) en anti-PSA mAb (kloon 2-2B) (10 ug / ml) in PBS aangevuld met 10% FBS bij 4 ° C gedurende 30 min.
   2. Was de cellen drie keer gedurende 20 seconden elk met ijskoude PBS gesupplementeerd met 10% FBS en bevestig met 4% paraformaldehyde in PBS, pH 7,4 gedurende 15 minuten bij 25 ° C.
   3. Wassen gefixeerde cellen tweemaal gedurende 1 minuut elk met PBS gesupplementeerd met 10% FBS en doorlaatbaar cellen met 0,1% Triton-X100 in PBS, pH 7,4 gedurende 2 minuten bij 25 ° C. Was de cellen tweemaal gedurende 1 minuut en label met gliale merkers GFAP (astrocyten) of IBA-1 (microglia) (1 ug / ml) in PBS aangevuld met 10% FBS overnacht bij 4 ° C in de koelcel.
   4. Ga verder met standaard immunofluorescentie voorwaarden waaronder DAPI-bevattend montage medium ^31.
      Let op: het gebruik van fluorescent gelabelde Fab _2-fragmenten als secundaire antilichamen voor menselijke (HIgM12) en muis (anti-PSA mAb, kloon 2 - 2B) IgM's wordt sterk aanbevolen.
   5. Neem fluorescerende afbeeldingen in 60X of 100X vergroting. Gebruik dezelfde instrument voor alle beelden en verwerken van afbeeldingen identiek.
2. Immunofluorescentie Labeling van endo-NF-behandelde WT gliacellen met behulp HIgM12 als Primary Antibody
   1. Cultuur WT muis gemengd glia gekweekt 3 dagen in Neurobasal A aangevuld met 10% FBS en B27 supplement (1:50) op PDL-gecoate 25 mm dekglaasjes. Add ENDO-NF (30 ug / ml) aan 1 ml cultuurmedium en incubeer overnacht in een celkweek incubator (37 ° C, _5% CO2).
   2. Label cellen leven in de kou met HIgM12 en interne astrocytaire marker GFAP na fixatie en permeabilisatie zoals beschreven in de stappen 5.1.1 tot en met 5.1.5. Neem fluorescerende beelden op 60X of 100X vergroting. Gebruik dezelfde instrument voor alle beelden en verwerken identiek.

Resultaten

In dit gedeelte worden voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen door het bestuderen van humaan IgM-specifieke PSA-antigenen in het CNS. Het gebruik van menselijke IgM antilichamen met specifieke VK-lichte ketens in biochemische instellingen en door tl-immunocytochemie wordt getoond.

HIgM12 immunoprecipitaten zijn antigeen van cerebrale hersenen lysaten en fungeert als detectiemiddel (primair antilichaam) in Western blots. Noch isotype controle antilichaam of L agarose korrels immunoprecipitatie eenzelfde antigeen, die de specificiteit van het pull down (figuur 1) toont. Western blots met behulp CNS lysaten van WT en NCAM KO muizen tonen de specificiteit van binding aan HIgM12-PSA-NCAM bevattende (Figuur 2A). Enzymatische vertering van CZS-weefsel van WT-muizen gebruikt ENDO-NF identificeert PSA verbonden NCAM het specifiek bindende epitoop voor HIgM12 (Figuur 2B). Met de werkwijze die hierin beschreven worden IBA-1-positieve rat microgliale kweken van hoge zuiverheid verkregen (figuur 3). Commercieel beschikbare anti-PSA antilichaam (kloon 2-2B) niet labelen celoppervlak of inwendige PSA pools in vaste en gepermeabiliseerd IBA-1-positieve microglia cellen door fluorescentie microscopie. In overeenstemming met eerder gepubliceerde literatuur, die geen celoppervlak expressie van PSA-NCAM in microglia ^16,41 HIgM12 niet celoppervlak antigenen in gezuiverde rat microglia label verslagen. Interessant HIgM12 etikettering van vaste en gepermeabiliseerd microglia resulteert in een intracellulaire, perinucleair patroon dat niet is beperkt tot specifieke organellen (figuur 3). De resultaten zijn in tegenstelling met die verkregen onder toepassing van een anti-PSA-IgG-antilichaam (kloon 735) ²⁶ die PSA-SynCAM richt in microglia op het niveau van het Golgi ^41.

In tegenstelling tot microglia, HIgM12en A2B5 doelceloppervlak antigenen sterk verrijkt rat OPC kweken onder omstandigheden levende cellen (figuur 4). OPC kweken bevatten ~ 5% contaminerende microgliacellen. Figuur 5 toont een nagenoeg identieke cel-oppervlak kleurpatroon tussen HIgM12 en anti-PSA mAb (kloon 2-2B) in GFAP-positieve astrocyten (Figuur 5A). Immunofluorescente etikettering van ENDO-NF-gedigereerde WT astrocyten vergeleken met controle behandelde WT astrocyten buffer gebruikt HIgM12 toont de aanwezigheid van astrocytaire PSA (figuur 5B). De aanwezigheid van PSA-positieve astrocyten in vivo nog moet worden bevestigd.

Figuur 1: HIgM12 fungeert als een "pull-down" Agent in Immunoprecipitaties Immunoprecipitaties van totale brein lysaat van drie maanden oude muizen met behulp van HIgM12, menselijke isotype controle HIgM.126 of agarose L kralen alleen als "pull down" agenten. Geëlueerde eiwitten werden uitgevoerd in Western blots met membranen gesondeerd tegen HIgM12. Molecuulgewichten geëlueerde eiwitten van HIgM12 beklede korrels waren in het bereik van 160-200 kDa naast de IgM zware keten (~ 65-73 kDa). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van J. Neurochem. ^15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: HIgM12 Doelen de Polysialic Acid (PSA) groep aan NCAM. A. Brain homogenaten van P7, P13, P16 en P27 NCAM totaal KO muizen en heterozygote littermate controles werden uitgevoerd in Western blots met membranen gesondeerd tegen HIgM12, PSA en β-actine als het laden van controle. B. 10 ug volwassen WT muizenhersenen lysaat in 1% NP40 in PBS, pH 6,5 werd behandeld met endoneuraminidase N (endo-N) (exo) neuraminidase met α2-3 polysialic zuur polymeer specificiteit (Sialidase) of PBS overnacht bij 37 ºC, draaien als wambuizen in Western blots en onderzocht tegen HIgM12, PSA en β-actine als het laden van controle. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van J. Neurochem. ^15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: De afwezigheid van PSA op Rat Microglia wordt weerspiegeld door een gebrek aan HIgM12 Labeling Rat microglia werden gekweekt gedurende 48 uur op poly-D-lysine gecoate dekglaasjes en ofwel live-gelabeld op ijs met HIgM12 of na fixatie met HIgM12 of anti. -PSA mAb (kloon 2-2B). Cellen werden triple gelabeld met microglia marker IBA-1 (groen), HIgM12 / PSA (rood) en DAPI (blauw). Afbeeldingen uitwijzen dat de microgliale celoppervlakbinding behulp HIgM12 (bovenste rij) en het gebrek aan anti-PSA binding (kloon 2-2B) aan het celoppervlak en de interne opslag in primaire rat microglia (onderste rij). Op basis van de bipolaire morfologie en afwezigheid van IBA-1 kleuring, werd de kleine PSA-positieve cel (onderste rij) stelde voor om een ​​OPC zijn. In vaste cellen, HIgM12 kleuring resulteerde in een punctated, perinucleaire patroon dat niet is beperkt tot specifieke organellen en werd beschouwd als niet-specifieke binding (middelste rij). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: HIgM12 Doelen celoppervlak PSA-NCAM op Rat Rat OPC OPC's en microglia waren cultu.rood voor 4 dagen in de proliferatie medium op poly-D-lysine gecoat glas dekglaasjes en driedubbele live-gelabeld op ijs met HIgM12 of A2B5 (groen), interne macrofaag / monocyt marker CD68 (kloon ED-1) (rood) en DAPI (blauw) . Beelden tonen celpopulaties majorly positief voor OPC marker A2B5 (bovenste rij) en HIgM12 (onderste rij) met weinig CD68-positieve microglia (~ 5%). Fase contrast en DAPI afbeeldingen werden toegevoegd aan de cel integriteit en mobiele nummers voor elke populatie te onthullen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: HIgM12 en anti-PSA mAb co-label een astrocyten subpopulaties in muis Mixed Glia. A. Mouse gemengde gliacellen van WT en NCAM totaal KO dieren die astrocyten, oligodendrocyt-lineage cellen en microglia werden gekweekt gedurende 3 dagen en live gelabeld op ijs met HIgM12 (groen), anti-PSA mAb (kloon 2-2B) (rood) en vervolgens gedurende astrocytaire marker GFAP (paars) en DAPI (blauw). HIgM12 en anti-PSA blijkt dat er een virtueel identieke kleurpatroon op GFAP-positieve astrocyten WT maar gebrek aan binding aan gekweekte astrocyten van NCAM knock-out muizen. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van J. Neurochem. ^15. B. gemengde glia gelijk werden gekweekt zoals beschreven onder A. en overnacht behandeld met endoneuraminidase-NF (vriendelijk verschaft door Dr. Martina Muehlenhoff) of PBS controle. De cellen werden live-gelabeld op ijs met HIgM12 (groen) en vervolgens gekleurd voor interne markers GFAP (rood) en DAPI (blauw). HIgM12 richt celoppervlak antigenen op PBS-controle behandelde gemengde gliale culturen, maar niet endoneuraminidase-NF behandeld gemengde glia. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van JNSCI ^16. Plverlichten klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Alle beelden werden genomen bij 60X vergroting met behulp van hetzelfde instrument instellingen en op identieke wijze verwerkt.

Tabel 1:. Buffer en Solution Recipes Klik hier om deze tabel te downloaden.

	CNS weefsel	ENDO-NF / PBS	lysisbuffer	Totale volume
1. WT muis	67 g (0,45 ui)	2 pi (12 ug) ENDO-NF	7.55 ul	10 gl
2. WT muis	67 g (0,45 ui)	2 pl PBS	7.55 ul	10 gl
3. WT muis	67 g (0,45 ui)	geen PBS of ENDO-NF	9.55 ul	10 gl
4. NCAM KO muis	67 g (0,45 ui)	2 pi (12 ug) ENDO-NF	7.55 ul	10 gl
5. NCAM KO muis	67 g (0,45 ui)	2 pl PBS	7.55 ul	10 gl
6. NCAM KO muis	67 g (0,45 ui)	geen PBS of ENDO-NF	9.55 ul	10 gl

Tabel 2: ENDO-NF digestie van CZS-weefsel van WT en P7 NCAM KO muizen.

Discussie

Menselijke natuurlijke IgM auto-antilichamen zijn aantrekkelijk kandidaten voor immuuntherapie en therapeutisch potentieel voor de behandeling van diverse ziekten waaronder kanker en CZS ^1-7 geïllustreerd. Met voordeel zullen deze antilichamen geen immuunrespons waarbij het opwekken van neutraliserende antilichamen in hoofdzaak effectieve therapeutische dosis en werkzaamheid vermindert wekken. Belangrijk is dat alle antilichamen met therapeutische potentie van het IgM isotype zijn en behoren tot de NAb repertoire ^{3-5,8,9,37,40,42-45.} Een belangrijke hindernis voor de potentiële klinische toepassing van IgM antilichamen het identificeren van de antigenen, die onbepaald vaak. Standaardtechnieken toegepast voor IgG antilichamen zijn vaak niet op een IgM het antigeen te identificeren.

Dit protocol beschrijft de identificatie van PSA-NCAM als antigeen voor de regeneratieve humaan IgM-antilichaam HIgM12, in diermodellenMS en ALS ^15-18. De gebruikte methode is vooral van toepassing op alle humane antilichamen met specifieke VK-lichte ketens VκI, VκIII en VκIV en muis antilichamen met VκI lichte ketens, ongeacht isotype van het antilichaam.

De meest kritische stap in dit protocol is het gebruik van IgM antilichamen in affiniteitschromatografie toepassingen. Meer in het bijzonder, zijn succesvol antilichamen nodig om op te treden als pull-down agenten in immunoprecipitaties te isoleren of om een ​​antigeen te verrijken uit complexe weefsel- of celcultuur lysaten. Verrijkte fracties antigeen kan worden vergeleken met immunoprecipitaties van isotype controle antilichamen en vervolgens geanalyseerd op verschillen door massaspectrometrie. Een essentiële voorwaarde of beperking van deze stap is de aanwezigheid van het juiste antilichaam VK-lichte keten en gastheer (mens, muis) antilichaam in staat te binden aan eiwit L agarose. Gebruik van mannan-bindend eiwit gebonden aan agarose (ook called mannose-bindend lectine) in plaats van eiwit L agarose is een potentieel alternatief voor IgM's immunologisch zonder specifieke VK-lichte ketens. Echter, zoals door Arnold et al. ^35, antigeen IgM-antilichamen niet binden aan mannan-bindend eiwit, als het doel glycan lijken ontoegankelijk wordt wanneer het IgM is gebonden aan het antigeen ervan. Op basis van deze bevindingen mannan-bindend eiwit kan niet worden gebruikt als een bindende matrix immunoprecipiteren antigengeladen IgM moleculen ^35. Andere mogelijke alternatieven kan het gebruik van secundaire-agarose gebonden anti-IgM IgG-antilichamen ^46,47 of het gebruik van oppervlakte geactiveerde magnetische korrels ⁴⁸ worden. IgG antilichamen tegen IgM kan chemisch verknoopt agarose A of G agarose om de omvang van geëlueerde antilichaam verminderen samen met het antigeen van belang. Een goede vergelijking tussen verschillende varianten van IgM immunoprecipitatie met betrekking tot succes geïdentificeerde proteïnes iis moeilijk omdat de meeste immunoprecipitaties werden uitgevoerd om te isoleren of afbrekende IgM's zonder verdere interesse in hun antigenen. Daarnaast werden immunoprecipitaties gebruik IgM hoofdzakelijk gebruikt om een reeds bekende of verwachte blootstelling enkel antigeen antilichaam tegen gezuiverde antigenen ⁴⁹ te bevestigen. Een nadeel van agarose-gekoppelde IgG's gericht tegen humaan IgM is een zeer lage opbrengst (10-15%) van immunogeprecipiteerd serum IgM-moleculen in vergelijking met het uitgangsmateriaal ^50. Daarentegen werden oppervlak-geactiveerde magnetische korrels met succes toegepast om antilichamen van verschillende isotypen waaronder IgM naar scrapie associated fibrils ⁴⁸ immunoprecipitatie. Deze methode is niet beperkt tot specifieke kappa (VK-) of lambda (λ) ketens of een bepaalde gastheer en kan het spectrum van IgM antilichamen die in hoofdzaak immunoprecipitaties verbreden.

Een andere belangrijke stap in het protocol is het vermogen van het antilichaam om te functioneren als een detecterende antilichaam (primair antilichaam) in Western blots of andere screening platforms. Succesvolle antilichamen moeten hun antigeen gericht met voldoende hoge affiniteit om antigeen binding in aanwezigheid van niet-ionische of mogelijk ionische detergentia. Antilichamen met hoge affiniteit komen veel voor bij-affiniteit gerijpt IgG antilichamen, maar minder vaak tussen antilichamen van het IgM isotype, wat een van de redenen waarom er relatief weinig in de handel verkrijgbaar IgM antilichamen detecteren agenten in biochemische instellingen. Hoge affiniteit binden van antilichamen is een vereiste voor immunoprecipitaties moleculaire antigenen en Western blotting. Het verlagen van detergent concentraties of het volledig ontbreken van wasmiddelen in IP buffers en lysis buffers laat antigen gericht door lage affiniteit antilichamen via de Fab-domein. Daarentegen wordt het vermogen van het antilichaam om doeleiwit L agarose via het Fc gedeelte niet wezenlijk beïnvloed bij isotype controles op een aantal verschillende detergens concentraties. De lage detergens concentratie in lysisbuffer en IP buffer voorkomt celmembraan verstoring en isolatie van specifieke moleculen. Ook een lage detergens concentratie Western blot wasbuffers (bijvoorbeeld PBS-T) maakt antigeenbindend lage affiniteit antilichamen maar tegelijkertijd neemt aspecifieke binding en is dus geen optie.

De aanwezigheid van een antigeen eiwitkern is een eis voor deze methode. Eiwitten met posttranslationele modificaties (bijvoorbeeld, glycoproteïnen, lipoproteïnen) en ongemodificeerde eiwit, maar niet uitsluitend lipiden of koolhydraten, detecteerbaar in Western blots. Het is niet mogelijk om lipiden (bijvoorbeeld sfingolipiden) uit weefsel of immunoprecipitatie van cellysaten in aanwezigheid of afwezigheid van detergentia. De fysicochemische eigenschappen van detergentia en lipiden te lijken op selectieve lipide-antilichaam interacties mogelijk, terwijl tegelijkertijd wasmiddelen essentieel te verstorenmembranen om selectieve isolatie van specifieke moleculen toelaten. Naar ons beste weten, immunoprecipitaties uitsluitend bestaande uit koolhydraten, in afwezigheid van een eiwitkern, zijn niet eerder beschreven. Dit is bijzonder relevant omdat dikwijls IgM-antilichamen gericht koolhydraten en glycolipiden, die niet noodzakelijk in verband met een eiwit unit. Andere chromatografische technieken vereist voor de scheiding en immunologische identificatie van lipiden en koolhydraten in de afwezigheid van een eiwitkern. Zo kan dunnelaagchromatografie (TLC) van cellulaire lipiden latere detectie van antistoffen op de TLC plaat (immuno-TLC) uitgevoerd ^51,52.

Andere anti-PSA-antilichamen zijn beschreven in eerdere studies en resultaten vergeleken met HIgM12 en in de handel verkrijgbare anti-PSA IgM (kloon 2-2B). De meest gebruikte antilichaam in het gebied van de PSA een IgG-antilichaam (kloon 735) beschikbaar als muis monoclonal of konijn polyklonaal antilichaam ^53. Deze anti-PSA-antilichaam IgG gedetecteerd PSA op SynCAM en NCAM verschillende neuronale celtypen zoals microgliacellen ^41. In tegenstelling tot de anti-PSA-antilichaam IgG, humane IgM antilichamen HIgM12, HIgM42 en de anti-PSA-muis IgM (kloon 2-2B) zijn niet PSA richten op SynCAM (maar NCAM) bij verschillende embryonale en vroege postnatale fase in muizen , terwijl niet-polysialylated SynCAM gemakkelijk detecteerbaar ^15. De IgM-antilichamen die ook niet kunnen PSA te detecteren op microgliacellen (figuren 3 + 4). Een mogelijke verklaring voor verschillen waargenomen tussen antilichaam isotypes kunnen lage PSA-SynCAM niveaus vergeleken met niveaus van PSA-NCAM combinatie met de potentieel lagere affiniteit binding van IgM-antilichamen in vergelijking met de anti-PSA IgG. Om deze hypothese te testen, voerden wij immunoprecipitaties in NCAM KO dieren bij embryonaal stadium E17 met enorme hoeveelheden SynCAM heden en gebruikt HIgM12 als een "pull-down-middel" ^{15. In E17 WT littermate controls HIgM12 immunogeprecipiteerd PSA-NCAM in een mate die vergelijkbaar intensiteiten van "afgebroken" PSA-NCAM opzichte van de IgM zware keten gedetecteerd door densitometrie van Western blot latere gebruik geëlueerd antigenen vertoonden. Dit resultaat suggereerde ten minste een voldoende affiniteit van HIgM12 om zijn doel PSA. In tegenstelling tot WT hetzelfde nest bestuurt HIgM12 niet PSA in NCAM KO dieren verbonden SynCAM detecteren. Identieke resultaten werden verkregen in immunoprecipitaties met het menselijke anti-PSA IgM HIgM42. HIgM12 en HIgM42, en de muizen anti-PSA IgM (kloon 2-2B) konden richten op PSA SynCAM in Western blots van WT en NCAM KO dieren in embryonale en postnatale ontwikkelingsstadia. Gezien de geringe hoeveelheid benodigde HIgM12 (0,1 ug / ml) specifiek detecteren PSA in Western blots gebruik van kleine hoeveelheden van CZS-weefsel (0,1 pg per putje CZS) verbonden NCAM 15 lijkt het onwaarschijnlijk dat lage affiniteiten alleen wordenbelast absoluut geen PSA-SynCAM detectie door HIgM12 drie verschillende methodes.}

We concluderen dat er significante verschillen tussen de anti-PSA-antilichamen IgM en de vaak gepubliceerde anti-PSA-IgG-antilichaam (kloon 735). Het is niet duidelijk waarom de handel verkrijgbare anti-PSA-antilichamen IgM niet vaker gebruikt in het verleden verkregen met antiPSA IgG antilichaam 735. Dit is met name interessant omdat HIgM12 al werkzaamheid aangetoond in diverse ziektemodellen bevestigen. Terwijl andere anti-PSA IgM antilichamen vergelijkbare therapeutische effecten kan hebben het blijft onduidelijk of de anti-PSA IgG-antilichaam (kloon 735) heeft een vergelijkbare therapeutische resultaat in modellen van MS en ALS.

In het kort werden hier beschreven methoden voornamelijk gebruikt om het antigeen van de regeneratieve menselijke antilichaam HIgM12 potentiële klinische trials voor MS en mogelijk andere neurodegeneratieve ziekten ondersteunen identificeren. De identificatie van de mierigens op antilichamen met biologische activiteit is als essentiële stap om hun werkingsmechanisme begrijpen. Dit is bijzonder relevant in de context van een groot aantal monoklonale antilichamen momenteel getest op veiligheid en werkzaamheid bij humane proeven. Terwijl het aantal klinisch getest IgM-antilichamen tot nu toe is klein, recente vooruitgang in hybridoma technologie voor een groeiend aantal studies over het therapeutische potentieel van deze antilichaamklasse ^{1-10,37,40,42-45} dringt de ontwikkeling van nieuwe of gewijzigde methoden van toepassing op niet-eiwit IgM antigenen te identificeren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM	Fisher Scientific	MT-10-013-CVRF	Hoge glucose, met glutamine, met natriumpyrovaat, 500 ml
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml, L-glutamine, natriumpyrovaat, hoge glucose
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122	10.000 U/ml, 100 ml
N-2 Supplement (100x)	Life Technologies	17502-048	5 ml
B-27 Supplement (50x)	Life Technologies	17504-044	serumvrij, 10 ml
Fetal Bovine Serum - Optima	Atlanta Biologicals	S12450	500 ml
Steriele water voor irrigatie	Baxter Healthcare	#2F7114	USP-1.000 ml, 12/CA
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7886-50MG	D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, moleculair gewicht 30.000-70.000 g/mol, 50 mg
bovine serumalbumine fractie V	Sigma	A-3294-100G	hitteshockfractie, proteasevrij, pH 7,  zuiverheid 98%, 100 g
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767-500G	C6H12O6, moleculair gewicht: 180,16 g/mol, ACS reagens, 500 g
Trypsine uit runderpancreas	Sigma	T9935-100mg	vrijwel zout-vrij, gelyofiliseerd poeder, 9.000 BAEE eenheden/mg proteïne
Deoxyribonuclease I uit runderpancreas	Sigma	D5025-150KU	Type IV, gelyofiliseerd poeder, 2.000 Kunitz eenheden/mg proteïne
Recombinant Rat FGF basic Protein	R&D systems	3339-FB-025	BSA als dragereiwit, 25 µg, gelyofiliseerd, > 95%, 16,2 kDa
Recombinant Rat PDGF-AA Protein	R&D systems	1055-AA-50	zonder dragereiwit, 50 µg, gelyofiliseerd, > 97%, E. coli-afgeleid, 12,5 kDa
Neurobasal-A	Life Technologies	10888-022	500 ml, Geen Glutamine, Geen Asparaginezuur, Geen Glutaminezuur
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-1KG	kristallijn, 1 kg, reagenskwaliteit, moleculair gewicht 30,03 g/mol (als monomeer)
Tris[hydroxymethyl]aminomethaan (Tris bas	Biorad	#1610719	1 kg, 99,8% zuiver, poeder
Natriumdodecylsulfaat (SDS)	Biorad	#1610302	1 kg, poeder
Glycine	Fisher Scientific	BP-381-5	C2H5NO2, moleculair gewicht: 75,07 g/mol, wit kristallijn poeder, 5 kg
Natriumchloride	Sigma	S7653-5KG	NaCl, moleculair gewicht: 58,44 g/mol, 5 kg
Natriumfosfaat monobasisch	Sigma	S0751-500G	NaH2PO4, moleculair gewicht: 119,98 g/mol, 500 g
Fosfaat-gebufferde oplossing 1x (PBS)	Cellgro	MT-21-040-CV	Zonder calcium en magnesium, 6 x 500 ml
Falcon 60 mm TC-behandelde celcultuurschaal	Corning Life Sciences	#353002	60 mm celcultuurschaal, TC-behandeld polystyreen, 20/verpakking, sterieel
Falcon 60 mm x 15 mm Petri-schaal	Corning Life Sciences	#351007	Niet TC-behandelde bacteriologische Petri-schaal, 20/verpakking
6 wel celcultuurplaten	Corning Costar	CLS3516	6 wel, platte bodem (Afzonderlijk verpakt), gamma-bestraald, groeigebied 9,5 c
75 cm² weefselcultuurflacon	Corning Life Sciences	430720U	75 cm² U-vormige hoekige hals celcultuurflasco met Plug Seal-dop
Pierce™ Protein L Plus Agarose	ThermoFisher Scientific	#20520	2 ml, verknoopt 6% korrelvormig agarose (CL-6B), bindcapaciteit: 10 tot 20 mg IgG
4 - 20% Mini-PROTEAN TGX voorgevormd gel	Biorad	456-1094	10-wel, 50 µl, voor gebruik met Mini-PROTEAN elektroforesecellen
Immobilon-P Membraan	Millipore	IPVH00010	PVDF, 0,45 µm, 26,5 cm x 3,75 m rol
Anti-Polysialic Acid-NCAM Antilichaam, klon	Millipore	MAB5324	50 microliter, Gastheer: muis, monoklonaal IgM
4x Laemmli-monsterbuffer	Biorad	#1610747	10 ml, 4x voorgemengde eiwitmonsterbuffer
2-mercaptoethanol	Biorad	#1610710	25 ml, 98% zuiver, 14,2 M
Endoneuraminidase-N (Endo-N)	ABC Scientific	ABC0020	50 microliter, 200 µg/ml, 3.500 U/mg
25 mm glazen dekpotten	Fisher Scientific	12-545-102	Kringen nr. 1; Dikte: 0,13 tot 0,17 mm; Maat: 25 mm
HEPES-bufferoplossing	ThermoFisher Scientific	15630-080	100 ml, 1 M
Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS)	Cellgro	MT-21-022-CV	50