Methodenartikel

Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

DOI:

10.3791/54171

⸱

30 oktober 2016

 ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Oncology, Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, 2Sino-British Research Centre for Molecular Oncology, National Center for International Research in Cell and Gene Therapy, Zhengzhou University, 3School of Basic Medical Sciences, Academy of Medical Sciences, Zhengzhou University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vacciniavirus (VV) is op grote schaal gebruikt in biomedisch onderzoek en de verbetering van de volksgezondheid. Dit artikel beschrijft een eenvoudige, zeer efficiënte methode om de VV genoom bewerken met een CRISPR-Cas9 systeem.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De CRISPR-geassocieerde endonuclease Cas9 kan bepaalde genomische loci bewerken die worden aangestuurd door een enkele geleidings-RNA (gRNA). Het CRISPR/Cas9-systeem is met succes gebruikt voor het bewerken van genomen van verschillende organismen. Hier beschrijven we een protocol voor het bewerken van het vacciniavirus (VV) genoom in het cytoplasma van VV-geïnfecteerde CV-1 cellen met behulp van het RNA-geleide Cas9. RNA-geleide Cas9 induceert dubbelstrengs DNA-breuken die homologe recombinatie efficiënt en specifiek op de doelsite van VV vergemakkelijken en een transgeen kan op deze locaties worden geïntegreerd door homologe recombinatie. Door een locatie-specifiek homoloog vector met transgeen(s) te gebruiken, werd een VV met een verwijderd N1L-gen en het rode fluorescente eiwit (RFP) gen geïntegreerd in deze regio gegenereerd met een succesvolle recombinatie-efficiëntie die 10 keer hoger was dan die verkregen met de conventionele homologe recombinatiemethode. Dit protocol toont het succesvolle gebruik van het RNA-geleide Cas9-systeem om mutante VV's met verbeterde efficiëntie te genereren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vacciniavirus (VV) is een omhuld DNA-virus behoort tot het pokkenvirus familie en heeft een cruciale rol gespeeld in een van de grootste prestaties in de geneeskunde van de uitroeiing van pokken. In de periode na uitroeiing van pokken is VV ontwikkeld als een vector voor het afleveren van genen voor vaccins tegen HIV en andere infectieziekten 1-7 door het invoegen van genen van verschillende pathogenen in VV vectoren. VV is ook uitgebreid gebruikt als vector voor kankerimmunotherapie 8-14 vooral voor de ontwikkeling van tumor gerichte oncolytische replicerend vacciniavirus. Om een ​​doeltreffend vaccin vector met verbeterde selectiviteit voor kankercellen te creëren, worden wijzigingen binnen het virale genoom vereist, zoals gendeleties of inbrengen van therapeutische genen.

Met de ontwikkeling van DNA-technologie en een beter inzicht in de moleculaire biologie en virologie, insertie van vreemd DNA in VV oorspronkelijk verwezenlijkend met behulp van homologe recombinatie (HR) in 1980 15. Deze methode is nog steeds veel gebruikt voor het construeren van VV vectoren. Introductie van de genetische modificatie wordt bereikt door een shuttlevector voor HR, waarvoor recombineert met VV genoom in pre-geïnfecteerde cellen. Echter, deze methode bewezen zeer inefficiënt (minder dan 1% homologe recombinatie efficiëntie 16) zijn en vaak resulteert in willekeurige insertie van de selectiemerker in ongerichte gebieden en / of verlies van de merker bij virus expansie.

De efficiëntie van DNA homologe recombinatie voor het inbrengen van exogeen DNA aan genomische loci kan drastisch worden verhoogd in de aanwezigheid van dubbelstrengs breuken (DSB's) 17. Daarom is de technologie die DSB's at target loci kan induceren heeft een groot potentieel voor genoom engineering van VV.

De recent ontwikkelde CRISPR-Cas9 systeem toont belofte voor het activeren van DSB's in elke VV-gen regio. CRISPR-Cas9 een RNA-begeleide nuclease betrokken bij adaptieve immuniteit tegen binnendringende fagen en ander vreemd genetisch materiaal 18-20. Er zijn drie CRISPR Cas-systemen in verschillende microbiële species 21. De type II-CRISPR Cas wordt veel gebruikt voor het bewerken van het genoom van eukaryotische cellen en grote virussen. Het bestaat uit de RNA-geleide Cas9 endonuclease (van Streptococcus pyogenes), een gids-RNA (sgRNA) en de trans-activerende crRNA (tracrRNA) 22-24. De Cas9 / sgRNA complex herkent de complementaire 20 nucleotiden genome sequentie voorafgaand aan een 5'-NGG-3 'Protospacer aangrenzende motief (PAM) sequentie in zoogdiercellen 22, 23. Het is met succes toegepast voor een effectieve vorming van genetisch gemodificeerde cellen, virussen en diermodellen 22-32.

De CRISPR-Cas9 systeem heeft zich bewezen als een efficiënt instrument voor het genoom te richten in combinatie met homologe recombinatie in het cytoplasma van VV zijn geïnfecteerd CV-1 cels mutante vacciniavirussen gegenereerd 33, 34. Om de mogelijke toepassing van deze werkwijze uit te breiden, gedetailleerde informatie over de methodologie van dit systeem stellen we. De beschreven protocol kan worden gebruikt om een ​​mutant VV met een bepaald gen deletie maken en / of de arm mutant virus met een therapeutisch transgen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van Target RNA en Cas9 bouwt en Repair Donor Vector

  1. Klonering van gRNAs
    1. Ontwerp een gids-RNA-doelsequentie gericht op de N1L gen van vacciniavirus volgens het principe eerder 25 vermeld. Lijn de gids-RNA-doelsequentie tegen het genoom van het vacciniavirus (in dit geval, Lister stam van vacciniavirus) uit te sluiten elke off-target gRNA doelsequenties.
    2. Synthetiseren en klonen gRNA oligo in een gRNA kloneringsvector zoals hiervoor 25 beschreven. Bevestigt de sequentie van iedere afzonderlijke gRNA in de resulterende vector van Sanger sequentiebepaling 33. Noem het resulterende gRNA bouwen als gRNA N2 33.
      OPMERKING: De gRNA doelwitplaats binnen de N1L gen, en in het gebied tussen de linkerarm en de rechterarm dat de reparatie donorvector deksels (zie figuur 1).
  2. Kloon de Cas9 gen ontbreekt het nucleair lokalisatie signaal (NLS) in depST1374 vector en wijzen het construct als pST-Cas9 33.
    Opmerking: Elke zoogdierlijke expressie-kloneringsvector kan worden gebruikt voor de constructie van de expressievector Cas9.
  3. De bouw van de reparatie donor vector voor HR
    1. Gebruik de N1L gen van VV als het doelgebied voor modificatie 33. Waarborgen dat de lengte van de linker en rechter armen 500-600 bp elk, en flankerende het doelgebied.
      OPMERKING: De linkerarm / rechterarm kan tot 50 bp overlap met de doelregio hebben (zie figuur 1).
    2. Kloon de N1L regio reparatie donor vector zoals eerder 33, 34 beschreven en wijzen de reparatie donor vector als PT-N1L.
      OPMERKING: Zie figuur 1 voor de reparatie donor vector en zijn doelgebied. Andere regio's van de VV kan worden gericht met behulp van regio (gen) -specifieke gRNA (s) en regiospecifieke reparatie donor vector. Elke kloneringsvector kan worden gebruikt voor de constructie van de reparatie donorvector.
    3. Uitbreiding van plasmide
      1. Transformeer de plasmide in chemisch competente E. coli volgens de instructies van de fabrikant. Zuiver het plasmide met een plasmide extractie kit verwijzing naar de door de fabrikant geleverde protocol.

    2. Seeding Cellen (dag 1)

    1. Handhaaf CV-1-cellen (Monkey nierfibroblasten) in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, bij 37 ° C met 5% CO 2.
    2. Trypsinize CV-1 cellen die 80-90% confluent
      1. Verwijder het celkweekmedium van de T-175 kolf die CV-1 cellen. Spoel de monolaag met 5 ml steriel PBS om resten serum te verwijderen en zuig het PBS. Voeg 2,5 ml 1 x trypsine-EDTA-oplossing om de cellen te dekken door de kolf in 37 ° C incubator gedurende ongeveer 5 min tot cel losraken steun.
      2. Toevoegen10 ml celkweekmedium (zie stap 2,1) aan de cellen door voorzichtig pipet actie opschorten. Tel het aantal cellen met een hemocytometer.
      3. Zaaien cellen in 6-well platen
        1. Zaad 2 x 10 5 CV-1-cellen in 2 ml celkweekmedium in elk putje van een 6-wells plaat de dag voor transfectie.
          Opmerking: Een extra centrifugatie stap om trypsine te verwijderen is niet vereist.

    3. Transfectie van Cas9 Plasmid en gRNA Plasmid (dag 2)

    1. Transfecteren CV-1-cellen (bereid in stap 2.2.3.1) met 0,5 ug pST-Cas9 plasmide en 0,5 ug plasmide gRNA N2 met een transfectie reagens volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Incubeer de cellen gedurende 24 uur in een incubator (37 ° C met 5% CO 2) en vervang het medium door 2 ml vers kweekmedium (in stap 2.1 beschreven).

    4. Infectie van CV-1-cellen en Shuttle Donor Vector Transfectie voor HR (dag 3)

    1. Verdun de ruggengraat VVL15 virus DMEM celkweekmedium tot een concentratie van 2 x 10 5 pfu / ml. 24 uur na transfectie van plasmiden Cas9 en gRNA, voeg 100 ul van de verdunde virusoplossing in elk putje van de getransfecteerde CV-1 cellen.
    2. 2 uur na de virusinfectie, transfecteren 1,0 ug donor shuttle vector in VVL15-geïnfecteerde cellen voor HR gebruikmaking van een transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant. Plaats de getransfecteerde cellen in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 24 uur.

    5. De Oogst van het recombinante virus (dag 4)

    1. Na 24 uur transfectie met een shuttle vector voor HR donor in stap 4,2, maak de getransfecteerde CV-1 cellen met een cel schraper. Verzamel de celsuspensie in een cryovial en bewaren bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
      LET OP: Veeg celkweekmedium gemorst met een ontsmettingsmiddel onmiddellijk en veeg opnieuw met 70% ethanol.

    6. Zuivering van de Modified VV (eerste ronde)

    1. Op dag 1, zaad 15 6-putjesplaten met 3 x 10 5 CV-1 cellen in elk putje.
      1. Op dag 2, dooi bevroren celsuspensie uit stap 5,1 in een waterbad bij 37 ° C gedurende 3 min en de cryobuisjes vortex krachtig gedurende 30 s tot cellysaat te verkrijgen zonder het verwijderen van celresten.
    2. Voor het infecteren van een 6-well plaat of CV-1-cellen, verdund 1 pl cellysaat met 3 ml DMEM en voeg 0,5 ml van de verdunde cellysaat in elk putje van de 6-well plaat bovenop media reeds aanwezig. Infect alle 6 putjes bereid in stap 6.1.
      Opmerking: Het verwijderen van celafval is niet vereist.
    3. Na twee dagen van infectie (dwz op dag 4), identificeren RFP-positieve plaques onder een fluorescentie microscoop met 10x objectief en label de plakken onder de plaat met een viltstift omcirkelen de plaque locatie.
      OPMERKING: Zie Figuur 3 voor representatieve RFP-positieve plaque.
      1. Bereid zes gelabeld cryovials die 200 pi serum-vrij DMEM celcultuur medium op te halen zes verschillende RFP-positieve plaques. Zuig het celkweekmedium uit de put met gemerkt plaque (s) (stap 6,3). Bevestig een 200 pi tip om een ​​P200 pipet, zet het volume op 30 pi en nemen ~ 10 pi celkweekmedium van de ene cryovial.
      2. Houd de pipet drukknop zonder het medium en gebruik de tip om het gebied van een label plaque krassen. Laat de pipet drukknop Til de losgemaakte cellen en breng deze in de cryovial met 190 gl serumvrij DMEM.
      3. Neem een ​​ander 10 pi medium uit de flacon met de bekraste cellen (van de laatste stap) en herhaal de procedure van het oppakken van dezelfde RFP-positieve plaque drie keer zo veel krassen cellen mogelijk te verzamelen. Breng alle cellen in hetzelfde buisje en bewaar het flesje bij -80 ° C.
        OPMERKING: U invriezen cryovials op droog ijs gedurende 10 min wanneer de tweede ronde van zuivering onmiddellijk uitgevoerd.

    7. Zuivering van de Modified VV (tweede ronde)

    1. Zaad 3 x 10 5 CV-1 cellen in elk putje van zes 6-well platen en kweken van de cellen gedurende 24 uur.
    2. Ontdooi de bevroren cryovials (uit stap 6.3.3) bij 37 ° C waterbad gedurende 3 min, daarna worden geschud cryovials krachtig gedurende 30 sec cellysaat te verkrijgen.
      1. Voeg 0,5 pi van de gemengde cellysaat één putje van een 6-wells plaat. Infect een 6-wells plaat voor elke plaque. Incubeer de VV-geïnfecteerde 6-well platen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 2 dagen (tweede ronde plaquezuivering). Herhaal dan rubriek 6.3.
        LET OP: meer dan zes RFP-positieve plaques kan worden opgehaald; twee of meer 6-well platen kunnen worden gebruikt voor de zuivering van elke plaque.

    8. Verdere Rondes van Plaque Puricatie

    1. Voeren op een verdere 3-5 ronden van zuivering volgens hetzelfde protocol in stap 7 beschreven totdat alle plaques gevormd uit één positieve plaque lijken RFP-positieve onder een microscoop.
      LET OP: Deze plaquette wordt dan pure beschouwd.
    2. Zodra de plaque zuiver (figuur 4, alle geïnfecteerde cellen die RFP), een positieve plaque te oogsten in een cryovial en bewaar bij -80 ° C zoals beschreven in paragraaf 6.3. Controleer de plaque naar aanleiding van de in stap 9 en 10 beschreven protocol.

    9. Vouw de Gezuiverd Plaque (s)

    1. Zaad 3 x 10 5 CV-1 cellen in elke well van een 6-wells plaat één dag vóór virusinfectie.
    2. Ontdooi de bevroren cryovial van 8,2 in een 37 ° C waterbad gedurende 3 min cellysaat te verkrijgen. Voeg alle lysaat (zonder het verwijderen van celresten) in een putje van een 6-wells plaat van CV-1-cellen (uitgezet in stap 9.1). Incubeer de geïnfecteerde CV-1-cellen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende maximaal 3 dagen.
      1. Vouw alle gezuiverde plaques (ten minste drie plaques).
        OPMERKING: De infectie varieert van 1-3 dagen, afhankelijk van de hoeveelheid virus in het lysaat.
    3. Oogst de VV-geïnfecteerde cellen met een cel schraper wanneer meer dan 50% cellen vertonen cytopathisch effect waargenomen onder een microscoop (cellen afgerond, gemakkelijk los en RFP positief). Verzamel de vrijstaande cellen samen met celkweekmedium in een 15 ml buis.
      1. Pellet de cellen door centrifugeren bij 300 g gedurende 3 minuten. Verwijder de supernatant en houd de celpellet bij -80 ° C tot verder gebruik of gebruik de celpellet onmiddellijk naar stap 10.

    10. Verificatie van de Wijziging van Mutant VV Met behulp van PCR

    1. Extract VV DNA uit de celpellet bereid in stap 9.3.1 met een DNA extractie kit volgens het protocol van de fabrikant. Elueer DNA met 200 pi van dubbel gedestilleerd water.
      OPMERKING: Gebruik de helft van het volume van de pellet om DNA te extraheren en houden de rest van virusproductie als de kloon wordt geverifieerd met de correcte wijziging / insertie.
    2. Verificatie van de schrapping van de N1L gen en het inbrengen van RFP-gen in de regio N1L.
      1. Amplificeren van een DNA-fragment verspreid over de N1L gen (L025) en L026-gen onder toepassing van primers ontworpen tegen N1L gen. Versterken de RFP gen via RFP-specifieke primers. Amplificeren controle DNA-fragment spanning A52R met PCR met gebruik A52R-specifieke primers.
        OPMERKING: Zie lijst van materialen voor specifieke primers.
        1. Voer de PCR met behulp van een PCR master mix kit. Opgericht 25 ul PCR reactie met gebruik 2 pl DNA-matrijs, denatureren de PCR reactie bij 94 ° C gedurende 2 min, en vervolgens 30 cycli van PCR als volgt: denatureren de DNA bij 94 ° C gedurende 15 s en vervolgens gloeien de primers om de DNA-matrijzen bij 52 ° C gedurende 15 s verlengen de PCR reactie bij 72 ° C gedurende 30 s.
    3. Oplossen van de PCR producten met behulp van een 1% agarosegel 33. Leg de gel beeld met behulp van een UV-gel doc. Als de N1L PCR negatief is en A52R en RFP PCR positief zijn, wordt de plaque correct gemodificeerd in het gebied N1L.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor de constructie van een nieuw VV vector, het belangrijkste uitgangspunt is het ontwerpen en bouwen van een donor shuttlevector die kan richten op een specifiek gebied van het genoom. In deze studie werd de VV N1L gen als voorbeeld doelwit. De cassette van de donor shuttle vector voor de recombinatie en het doelgebied in de VV worden weergegeven in figuur 1. Teneinde de doelmatigheid van de homologe recombinatie, plasmiden die Cas9 en N1L specifieke gRNA werden gecotransfecteerd in de CV -1 cellen 48 uur voorafgaand aan het uitvoeren van de homologe recombinatie 33. Één dag (24 uur) na transfectie, RFP werd uitgedrukt in de CV-1-cellen (Figuur 2). Na infectie van CV-1 cellen met het gehele lysaat van homologe recombinatie (stap 5), RFP-positieve en negatieve plaques werden beide waargenomen in de CV-1-cellen (Figuur 3). Na de zuivering protocol beschreven, een zuivere plaque co uld worden verkregen na 3-5 ronden van zuivering. Zoals getoond in figuur 4, alle plaques na infectie met cellysaat verkregen uit een zuivere plaque-mutante vacciniavirus presenteerde een RFP signaal. Nagaan of de zuivere mutant VV had de juiste genetische modificatie, PCR werd gebruikt om de afwezigheid van de beoogde N1L gen bevestigen, zie figuur 5. PCR van het gemodificeerde virus toonde een positief signaal voor RFP en een afwezige signaal voor N1L ( figuur 5 baan AG), terwijl de PCR resultaten van N1L voor de controle virus (Ctr) met een intact gebied N1L positief. De controle DNA fragmenten van A52R positief voor recombinante virussen en virus Ctr. De HR efficiëntie RFP-positieve plaques is 100% (6/6) in dit experiment (het aan 94% van het eerdere werk 34). De hierin beschreven werkwijze is de recombinatie efficiëntie verbeterd door meer dan 100 voudige gebruikelijke protocollen 33, 34.

content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figure-results-1
Figuur 1:. De cassette van de donor shuttle vector voor homologe recombinatie en het doelgebied in het VV-genoom De zuivering merkergen RFP wordt gedreven door de promoter H5. De reparatie donorvector targeting regio N1L resultaten in de RFP gen dat is opgenomen in de regio N1L na homologe recombinatie. 'X' geeft aan dat de homologe sequentie in de reparatie donor vector die dezelfde volgorde op het vacciniavirusgenoom zal vervangen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2:. Beeldvorming van de CV-1-cellen één dag na homologe recombinatie een dag afteimage Fase contrast (oorspronkelijke vergroting 100X) B::. image fluorescentie microscopie (oorspronkelijke vergroting 100X) r homologe recombinatie, de cellen geïnfecteerd met VV en getransfecteerd door reparatie donor vector A zijn RFP-positief.. Schaal bar = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3:. Een RFP-positieve plaque in de eerste ronde zuivering van mutant virus In de eerste ronde zuivering van het mutant virus, de RFP-positieve plaque (omcirkeld met rode lijn) met het doelgebied deletie omgeven door plaques gevormd door wild type virus (omcirkeld met gele lijn) A:. image Phase contrast (oorspronkelijke vergroting 100X) B:. Fluorescentie MICRoscopy image (oorspronkelijke vergroting 100X). Schaal bar = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Beeld Fasecontrast (oorspronkelijke vergroting 100X) B::. Image Fluorescentie microscopie (oorspronkelijke vergroting 100X) Figuur 4: a. De zuivere mutant VV Na 3-5 ronden van zuivering zuivere plaques verkregen als alle plaques RFP-positief. . Schaal bar = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: VERIFICATIEn zuivere mutant VV. DNA werd geëxtraheerd uit VV geïnfecteerde CV-1-cellen. De deletie van het doelgebied N1L werd geverifieerd door PCR met primers N1L, het inbrengen van RFP in gebied N1L werd bevestigd door PCR met gebruikmaking van primers RFP. Lanes AF overeen met zes gezuiverde plaques, lane G is een controle-plaquette met N1L schrapping gecontroleerd in eerdere werk 33, steeg Ctr (controle) is de wild-type vacciniavirus (met N1L regio intact). A52R-gen werd versterkt als de controle-gen voor alle monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn twee belangrijke doelen met betrekking tot wijziging van VV voor therapeutische doeleinden. Een daarvan is een bepaald gen te verwijderen, zoals de thymidine kinase (TK) gen van virus verzwakken voor anti-tumor therapeutische toepassing. De andere is het VV arm met een gewenst therapeutisch gen (zoals GM-CSF) of een markergen (zoals luciferasegen). Het bereiken van een van deze omvat het verwijderen van een doelgebied / gen. Een directe DNA ligatie werkwijze 35 en een in vitro verpakkingsmethode 36 zijn eerder gebruikt om mutante vacciniavirussen met TK-gen modificaties genereren. Echter, deze methoden beperkt strekking betreffende mutatie van andere gebieden in het genoom door gebrek van unieke restrictie-enzymplaatsen in het genoom. De huidige aanpak van het creëren van mutant VV impliceert transfectie van een shuttle (donor) vector met een selectie marker (RFP of GFP) in CV-1-cellen twee uur na infectie met VV tot een homologe recombinatie incorporati inducerenng de selectie marker in het doelgebied. Selectie van marker-positieve plaques wordt gevolgd door hun zuivering 24 uur na transfectie. De plaquette zuiveringsproces kan tot 10 rondes, de laatste 3-4 weken en leidt vaak tot ongewenste recombinante virussen met de selectie markers in off-target regio's geplaatst. DNA dubbelstrengige breuken effectief induceren van homologe recombinatie in zoogdiercellen 37, en door gebruik te maken van dit mechanisme kan het rendement van het genereren van mutante VV sterk worden verbeterd. Het gRNA geleide Cas9 systeem is succesvol toegepast in genoom bewerken en verhoogt de efficiëntie van homologe recombinatie in eukaryotische organismen 22, 25. Recent, in gastheercellen het genoom van adenovirus en type I herpes simplex virus werden bewerkt door het gRNA geleide Cas9 systeem 24. Het is onlangs aangetoond dat CRISPR Cas9 systeem is een krachtig hulpmiddel voor de VV genoom efficiënt bewerken en construeren van een vector voor het tot expressie VV eenbepaald gen.

Beide N1L gRNA-begeleide Cas9 en de traditionele methode homologe recombinatie (HR) resulteerde in een succesvolle HR gebeurtenissen in dezelfde doelgroep plaats van N1L. Interessant genoeg gRNA geleide Cas9 geïnduceerde HR bij veel hogere efficiëntie dan de traditionele methode HR. Zo is het gebruik van gRNA geleide Cas9 elimineert de noodzaak om zoveel plaques zuiveren mutant VVS verkrijgen. In dit werk, we aanzienlijk verbeterd de efficiëntie en het tijdschema voor het genereren van mutant VV met behulp van de gRNA-begeleide Cas9 systeem 33. Opmerkelijk is een belangrijke stap voor het verkrijgen van een hoge efficiëntie van homologe recombinatie om CV-1-cellen met plasmiden die Cas9 en gRNA gedurende 24 uur transfecteren alvorens de conventionele homologe recombinatie. De 24 uur interval maakt Cas9 en gRNA worden uitgedrukt op een redelijk niveau. Verder kan de sequentie gRNA gericht op een bepaald gen moeten worden geoptimaliseerd als we vonden dat de verschillende sequenties t gRNAargeting N1L gen variëren in hun efficiëntie 33, 34.

De beperking van de CRISPR / Cas9 in bewerken VV is de lage snelheid van de RFP-positieve plaques in de eerste ronde van recombinatie. Om voldoende RFP-positieve plaques die recombinant virus, meestal minstens tien 6-well platen nodig zijn, die eerste ronde maakt screening vervelend vinden. Daarom is er nog steeds behoefte aan het protocol om deze beperking te overwinnen optimaliseren.

De geringe omvang van RFP-positieve plaques is een potentieel probleem, dat wordt veroorzaakt door een grote hoeveelheid lysaat gebruikt om een ​​6-wells plaat infecteren. Om dit te ondervangen dient een kleiner volume lysaat gebruikt om een ​​6-well plaat geïnfecteerd met groter formaat RFP-positieve plaques verkregen. Met een kleiner volume lysaat ook mogelijk voor een betere scheiding van RFP-positieve plaques van de RFP-negatieve. Bijgevolg minder rondes van plaque zuivering moeten zuivere RFP-positieve plaques verkregen.

Off-target effecten zijn altijd een ongewenste kwestie gen bewerken. CRISPR-Cas9 heeft off-target effecten getoond. Echter, met een zorgvuldig ontwerp van gRNA, off-target effecten worden vermeden bij het bewerken van VV Genomes 33, 34. Dit is het bijzondere voordeel van het gRNA geleide Cas9 systeem voor het bewerken van het genoom van VV. Gezien de beloften van VV, met behulp van de CRISPR / Cas9 systeem zal versnellen van de ontwikkeling van de mutant VVS voor biomedisch onderzoek en in Translational Medicine. Bovendien zou een dergelijk systeem ook ontdekkingen in celbiologie, zoals dissectie van de signaalwegen die door VV voor zijn actine gebaseerde motiliteit versnellen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de MRC DPFS-subsidie (MR/M015696/1) en het Ministerie van Wetenschap en Technologie van China (2013DFG32080).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Plasmid #4182441824AddgenegRNA klonering vector
pST137413426AddgeneCas9 klonering vector
pGEMT easyA1360promegareparatie donor vector klonering
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coliC4040-10Invitrogentransformatie
QIAprep Spin Miniprep Kit 27106Qiagenplasmide extractie
Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM)11965-092Life Technologiescelcultuur medium
fetal bovine serum (FBS) SH30088.03HIHyclonecelcultuur serum
penicillin, streptomycin15070-063Thermo Scientificantibiotica
Effectene301425Qiagentransfectie
Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mLW-06754-96Thermo Scientificvirus verzamelen
fluorescence microscoop Olympus BX51 Fluorescerend OlympusRFP-positieve plaque vinden
DNeasy Blood & Tissue Kit69506QiagenDNA extractie
Extensor Long PCR ReddyMix Master MixAB-0794/BThermo ScientificPCR reagent
10 cm kweekschaalZ688819-6EAsigmacelcultuur 
6-well plateZ707759sigmacelcultuur 
cel schraperC5981sigmacellen schrapen
1x Trypsin-EDTA oplossingT4299sigmacellen trypsiniseren
Virkon95015661Anachem Ltdontsmettingsmiddel
Falcon tubeCLS430791-500EASigmacellensuspensie houden
N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’SigmaPCR primer
N1L reverse  5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3'SigmaPCR primer
A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’SigmaPCR primer
A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’SigmaPCR primer
RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’  SigmaPCR primer
RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’SigmaPCR primer
ArgaroseA7431SigmaPCR product oplossen
G:BOX F3G:BOX F3SyngeneUV gel doc

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain. Cell. 28, 315-324 (1982).">Baroudy, B. M., Venkatesan, S., Moss, B. Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain. Cell. 28, 315-324 (1982).
  2. Brock biology of microorganisms, 9th edn. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2000).">Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Brock, T. D. Brock biology of microorganisms, 9th edn. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2000).
  3. Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein. Lancet. 337, 567-572 (1991).">Cooney, E. L., et al. Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein. Lancet. 337, 567-572 (1991).
  4. Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle. Science. 227, 433-435 (1985).">Mackett, M., Yilma, T., Rose, J. K., Moss, B. Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle. Science. 227, 433-435 (1985).
  5. Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes. J Virol. 78, 2770-2779 (2004).">Legrand, F. A., et al. Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes. J Virol. 78, 2770-2779 (2004).
  6. Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).">Panicali, D., Davis, S. W., Weinberg, R. L., Paoletti, E. Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).
  7. Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene. Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).">Wiktor, T. J., et al. Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene. Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).
  8. Danger signals: SOS to the immune system. Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).">Gallucci, S., Matzinger, P. Danger signals: SOS to the immune system. Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).
  9. The danger model: a renewed sense of self. Science. 296, 301-305 (2002).">Matzinger, P. The danger model: a renewed sense of self. Science. 296, 301-305 (2002).
  10. Vaccinia as a vector for gene delivery. Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).">Guo, Z. S., Bartlett, D. L. Vaccinia as a vector for gene delivery. Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).
  11. Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy. Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).">Kwak, H., Horig, H., Kaufman, H. L. Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy. Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).
  12. Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer. Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).">Tysome, J. R., et al. Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer. Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).
  13. Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion. Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).">Kirn, D. H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C. H., Thorne, S. H. Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion. Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).
  14. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).">Park, B. H., et al. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).
  15. Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).">Panicali, D., Paoletti, E. Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).
  16. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. J Virol. 61, 1788-1795 (1987).">Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. J Virol. 61, 1788-1795 (1987).
  17. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).">Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).
  18. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).">Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., Schouls, L. M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).
  19. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).">Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
  20. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).">van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).
  21. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. Science. 343, 1247997(2014).">Jinek, M., et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. Science. 343, 1247997(2014).
  22. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).">Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
  23. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).">Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  24. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathog. 10, 1004090(2014).">Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathog. 10, 1004090(2014).
  25. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).">Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  26. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).">Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).
  27. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).">Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
  28. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).">Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
  29. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156, 836-843 (2014).">Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156, 836-843 (2014).
  30. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).">Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).
  31. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).">Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  32. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Res. 24, 122-125 (2014).">Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Res. 24, 122-125 (2014).
  33. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. J Virol. 89, 5176-5179 (2015).">Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. J Virol. 89, 5176-5179 (2015).
  34. A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9. Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035(2015).">Yuan, M., et al. A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9. Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035(2015).
  35. Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors. Virology. 190, 522-526 (1992).">Merchlinsky, M., Moss, B. Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors. Virology. 190, 522-526 (1992).
  36. Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper. Biotechniques. 31, 534-540 (2001).">Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper. Biotechniques. 31, 534-540 (2001).
  37. Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells. Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).">Johnson, R. D., Jasin, M. Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells. Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CRISPR Cas9homologe recombinatieCV 1 cellenRFP positieve plaquesN1L gen deletieshuttle donorvectorfluorescentiemicroscopiezuivering van cellysaatrecombinatie effici ntie

Gerelateerde artikelen