Triggering Cell Stress en Dood met behulp van conventionele uv laser confocale microscopie

Samenvatting

Gegevensmanipulaties om gerichte stress of dood in individuele cellen te veroorzaken, zijn relatief moeilijk te bereiken. Hier wordt een ablatie-aanpak met een resolutie van één cel beschreven om selectief stress te veroorzaken en individuele cellen in celkweek en levende dieren te doden, gebaseerd op een standaard confocale UV-laser.

Samenvatting

Met behulp van een standaard confocale setup kan een UV-ablatiemethode worden gebruikt om selectief cellulaire schade te induceren en single-cell reacties en cel-cel interacties in het CZS in real-time te visualiseren. Eerder vereiste het bestuderen van deze celspecifieke reacties na schade vaak gecompliceerde setups of de overdracht van cellen of dieren naar andere, niet-fysiologische omgevingen, wat de onmiddellijke en kortetermijnanalyse bemoeilijkte. Bijvoorbeeld, drug-gemedieerde ablatie benaderingen missen vaak de specificiteit die nodig is om single-cell reacties en onmiddellijke cel-cel interacties te bestuderen. Evenzo, terwijl hoogvermogen gepulseerde laser ablatie benaderingen zeer goede controle en weefselpenetratie bieden, vereisen ze gespecialiseerde apparatuur die de real-time visualisatie van cellulaire reacties kan bemoeilijken. De verfijnde UV laser ablatie benadering die hier wordt beschreven, stelt onderzoekers in staat om een individuele cel te belasten of te doden op een dosis- en tijdsafhankelijke manier met behulp van een conventionele confocale microscoop uitgerust met een 405-nm laser. De methode werd toegepast om selectief een enkele neuron te ablateren binnen een dicht netwerk van omringende cellen in het ruggenmerg van de zebravis. Deze aanpak onthulde een dosisafhankelijke reactie van de ablatieerde neuronen, wat leidde tot fragmentatie van cellulaire lichamen en anterograde degeneratie langs de axon binnen minuten tot uren. Deze methode stelt onderzoekers in staat om het lot van een individueel stervend cel te bestuderen en, belangrijker nog, de onmiddellijke reactie van cellen - zoals microglia en astrocyten - rond de ablatieplaats.

Inleiding

Fluorescentiemicroscopie al lang gebruikt om de effecten van transgenen in de zebravis CZS, vooral de effecten op de ontwikkeling ¹ bestuderen. Hoge-resolutie microscopie is een gedetailleerd in kaart brengen van de cellulaire processen die betrokken zijn in de ontwikkeling van de hersenen, spier generatie, en vele andere ontwikkelingsstoornissen evenementen ² toegestaan. Het bestuderen van de dood van een individuele cel is meer uitdagend, vooral als gevolg van de technische moeilijkheden van het induceren van selectieve celdood tijdens standaard imaging procedures. De combinatie van eencellige resolutie beeldvorming en zeer gerichte ablatie technieken maakt het onderzoek naar onmiddellijke cellulaire reacties op stress en schade, alsmede de daaruit cel-cel interacties. Inzicht in deze processen is essentieel, in het bijzonder neurodegeneratieve ziekten zoals motorneuronziekte (MND), waarbij neuron-glia interacties aangetoond bijdragen aan de progressie³ van de ziekte.

MND of amyotrofe laterale sclerose (ALS) is een verwoestende neurodegeneratieve ziekte die de motorische neuronen beïnvloedt in de hersenstam, motorische cortex, en het ruggenmerg. Het verlies van deze neuronen leidt tot spierverlies en patiënten sterven binnen 3-5 jaar na de diagnose ^4. Motorische neuronen in het ruggenmerg link de spiervezels en spelen een essentiële rol bij het faciliteren spiercontractie. Falen van deze mededeling of de dood van deze neuronen verzwakt geleidelijk de spieren en van invloed op het vermogen van de patiënt om te slikken, lopen, spreken en ademen. Het visualiseren van de dood van een motor neuron en de korte termijn gevolgen in een levend dier biedt een uitstekende gelegenheid om beter inzicht in de dynamische processen die betrokken zijn bij normale cel homeostase en ziekte.

Zebravis hebben zich ontwikkeld tot een aantrekkelijk model systeem om neurodegeneratieve ziekten ¹ bestuderen. Dezeis vanwege de voordelen van deze modelorganisme, zoals externe bevruchting, korte ontwikkelingstijd, optische toegang tot het zenuwstelsel, en het gemak van transgenese. Daarnaast is de mogelijkheid om eenvoudig te genereren verbinding transgene zebravis maakt meerdere strategieën labeling van verschillende celtypen. Genetische ablatie zal gaan vermoorden specifieke celtypen laten tamelijk breed verstoring, maar missen de fijne controle van zich te richten individuele cellen ^5. -Laser geassisteerde technieken, anderzijds bieden fijne temporele en ruimtelijke controle en zijn gebruikt voor verschillende diermodellen. Hoewel de meeste benaderingen speciale apparatuur te gebruiken, zoals gepulste lasers ^{6, 7, 8, 9, 10, 11, 12} of twee-foton opstellingen ^13, andereonderzoeksgroepen hebben onlangs gebruik gemaakt van een UV-laser in de conventionele confocale microscopen ^14.

De hier beschreven techniek combineert hoge-resolutie confocale microscopie met een UV-laser gemedieerde benadering cellulaire stress of dood op een dosis-afhankelijke wijze geselecteerde motorneuronen. Het steunt op het gebruik van de gewoonlijk geïnstalleerde 405-nm laser, is met succes getest in celkweek en in levende dieren en laat de gedetailleerde karakterisering van cellulaire interacties, zoals microgliacellen klaring na neuronale dood.

Protocol

LET OP: ontwerp, uitvoering en rapportage van dierproeven moet rekening worden gehouden met de huidige richtlijnen ^15. Deze werkzaamheden moeten vooraf worden goedgekeurd door de lokale dierenwelzijn gezag (in ons geval, de Animal Ethics Committee van Macquarie University).

1. Bereid de zebravis voor Montage en UV Cell Ablation

1. Genereer zebravis (Danio rerio) uiten van fluorescerende eiwitten.
   1. Om fluorescerende eiwitten van belang in de zebravis te uiten, uit te voeren plasmide injecties in de één-cel stadium van de zebravis ei (zoals elders ¹⁶ beschreven) of gebruik maken van tl-transgene lijnen. Als u meerdere celtypen labelen, maak verbinding transgene zebravis lijnen door het kruisen van gevestigde transgene lijnen die relevant zijn voor de kwestie van de rente. Plaats een mannelijke en een vrouwelijke zebravis aan weerszijden van een valse bodem pair paring tank in de avond en verwijder de verdeler met het begin van het lichtde volgende ochtend (zoals elders ¹⁷ beschreven). Houd de zebravis bij 28 ° C en verwerken ze volgens de vastgestelde protocollen ^{17, 18.}
   2. Het verzamelen van de embryo's na het succesvolle paaien door overbelasting van de tank water met de embryo's door middel van een plastic theezeefje. Spoel de eieren los met het systeem water en breng ze in ei water in een petrischaal.
   3. Onderzoek ze onder een lichtmicroscoop te bevruchting te bepalen. WINKEL bevruchte eieren in een petrischaal en plaats ze in een incubator bij 28 ° C ^18.
2. Optioneel: Voer een micro-injectie van specifieke celpopulaties labelen.
   Opmerking: Dit is een alternatieve methode die de expressie en visualisatie van eiwitten, zonder de noodzaak om stabiele transgene lijnen verhogen. Deze werkwijze is voordelig als het gewenste eiwit is toxisch en verbiedt het genereren van een stabiele transgene lijnen.
   1. Injecteer het plasmide constructen in de één-cel fase van zebravis embryo's, zoals elders ^{19, 20, 21} beschreven.
      Opmerking: Deze methode resulteert in het mozaïek expressie van het eiwit van belang. Het eiwit van belang wordt aangedreven door een promoter naar keuze (bijvoorbeeld islet1 ^22, -3mnx1 ^{23, 24,} met ²⁵ of ²⁶ MPEG1) geflankeerd door omgekeerde herhalingen Tol2 ^20.
3. Leeftijd vis aan de gewenste grootte.
   1. Breng de vis tot 3-5 dagen na de bevruchting (DPF) en leg ze onder een tl-samengestelde microscoop. Het scherm van de dieren voor passende fluorofoor expressie en selecteer het helder gelabelde vis. Scheid de juiste larven in een ander gerecht met ei water voor het inbedden van de later op (opslaan in een 28 ° C incubator).
      Optioneel: Embryo's kunnen in een 0,2 mM 1-fenyl-2-thioures (PTU) Ringers oplossing bij 24 uur na de bevruchting (HPF) worden geplaatst om de vorming van pigmentatie remmen. Zorg moet worden genomen PTU, omdat het giftig en kunnen nadelige fysiologische, genetische of morfologische effecten.
   2. Voor studies in een vroeg ontwikkelingsstadium (<2 DPF), dechorionate de embryo's handmatig met behulp van scherpe tang. Dechorionate grote aantallen embryo enzymatisch door toevoeging pronase (2 mg / ml) om het ei te water en incubatie gedurende 10 minuten bij 28 ° C.
   3. Passeer de embryo's op gezette tijden door middel van een plastic Pasteur pipet dechorionation verlichten. Sluit de werkwijze wanneer de meerderheid van embryo's uit de chorions door meerdere malen wassen ze met ei water ontstaan.
4. Bereid oplossingen voor zebravis inbedding in agarose.
   1. Bereid een anesthesie-oplossing door het toevoegen van 4 g / L MS222 (tricaïne voorraad oplossing, pH 7,0)druppelsgewijs aan een petrischaal met ei water. Een dosis van 50 mg / l is een aanbevolen startpunt (Figuur 1A).
   2. Bereid een voorraad van laag smeltende agarose (0,8-1,5%) in ei water en aliquot het in 1,5 ml microcentrifugebuizen. Plaats een hoeveelheid in een voorverwarmde warmte-blok (38-40 ° C) en laat het evenwicht op de ingestelde temperatuur (~ 30 min; Figuur 1B).
   3. Optioneel: Voor langere termijn imaging (> 4 uur), voor te bereiden een beetje agarose cirkel binnen de 35-mm glazen bodem petrischaal en laat het (aanvullende figuur 1) in te stellen.
      LET OP: Deze extra stap effectief bij het voorkomen van elke beweging van het gehele agarose druppel met de zebravis over langere termijnen was.
      1. Om dit te doen, plaats ~ 300 pi van agarose langs de binnenste cirkel van de glazen bodem schotel naar een donut-vormige cirkel te bereiden met een kleine opening in het midden waar de vis te plaatsen (stap 1.5.3; Aanvullende Figuur 1) .
5. Monteer de zebravis in agarose voor microscopie.
   1. Selecteer 1-3 van de vooraf gescreend vis voor ablatie en verdoven de larven door ze over (met een transferpipet) in een schaal met de verdoving oplossing (stap 1.4.1 Figuur 1C; ca. 5 min).
      LET OP: De vissen worden verdoofd wanneer ze een ondiepe opercular beweging en een verlaagde hartslag te laten zien en niet langer een keer opgeroepen escape reactie te geven (TEER, het niet te zwemmen te schieten na zachtjes aanraken van hun staart met een borstel). Zorgen voor passende verdoving voor de ethische behandeling van de vis en te trillen bij overdracht in agarose of blootstelling aan fluorescerend licht te voorkomen.
   2. Nadat de narcose wordt bevestigd, opzuigen een larve via instelbare pipet (met een cut-off 200-ul tip ingesteld op ~ 30 pi) en laten bezinken naar de bodem van de tip. Breng de larve in voorverwarmde agarose (stap 1.4.2) door het vrijgeven van een druppel van de vloeistof met delarve in de agarose (proberen om de hoeveelheid ei water in te gaan op de agarose een minimum te beperken; figuur 1D).
   3. Zuig de vis omringd door agarose. Doseer het snel in de eerder bereide glazen bodem 35-mm schotel.
   4. Gebruik een dissectie microscoop en een standaard penseel (lange liner, maat 1) om het dier binnen de agarose positioneren op de zijkant (hoofd naar links), zodat het lichaam en de staart zijn plat (figuur 1E). Als werken met meerdere vissen, sluiten alle vissen in de schaal, zodat ze gemakkelijk kunnen worden gelokaliseerd met behulp van de confocale microscoop later.
      LET OP: Snel deze procedure van de positionering en uitlijnen uit te voeren (het kan enige oefening vereisen, zoals de agarose begint onmiddellijk na blootstelling aan koudere temperaturen).
   5. Laat de agarose-ingebedde vis voor 10 - 15 min totdat de agarose goed is ingesteld. Top zorgvuldig de 35-mm petrischaal met ~ 2 ml ei water met tricaïne (Figuur 1F).

2. Stel de confocale microscoop en imaging Parameters

1. Plaats de petrischaal met ingesloten larve op de confocale microscoop podium en focus op de dorsale zijde van het dier ruggenmerg (met helderveld). Onderzoekt het dier onder de corresponderende vergroting (40X) en fluo-omgeving en breng de structuur van belang (bijvoorbeeld fluorescentie-intensiteit van de gelabelde neuronen of microgliacellen beweging) om te bevestigen dat alle beeldvormende parameters zijn nodig voor latere ablatie (figuur 2). We routinematig gebruik van de 40X doelstelling om onze time lapse studies uit te voeren.
2. Optioneel: Een time-lapse of onderzoek enkele uren, is het raadzaam om één of enkele tijdstippen voorafgaand opnemen ablatie om de ongestoorde fysiologische respons van de cel en zijn omgeving vast (bijvoorbeeld microglia beweging basislijn snelheid vaststellen en de beweeglijkheid).
3. Bepaal de dikte van de structuurure van belang zijn voor de UV-laser ablatie.
   1. Van de z-aandrijving, controleert de boven- en onderkant van de constructie van belang (bijvoorbeeld de cel soma) van handmatig scherpstellen op en neer. Noteer de z-vlak dat wordt geablateerd (bijvoorbeeld het midden van de cel).
      OPMERKING: Uit ervaring deze methode was het meest effectief doelwit zenuwbanen die helder waren gemerkt (hoge signaal-ruisverhouding die gemakkelijk tijdsverloop visualisatie mogelijk maakt na ablatie, bijvoorbeeld, figuur 4) en ablatie het midden van de cel soma. Celkern fluorescentie kan voordelig zijn om de juiste targeting en hoge ablatie efficiency te verzekeren.

3. Voer Gerichte Laser Ablation van individuele cellen in de zebravis Spinal Cord

LET OP: Voor deze ablatie en visualisatie aanpak, een confocale microscoop (Leica SP5) werd gebruikt. De ablatieprocedure met een 405-nm diode voor celspecifieke destherrie is uitgewerkt op basis van de software (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). Echter, elke conventionele confocale microscoop die is uitgerust met een 405 nm laser en een FRAP (fluorescentie herstel na fotobleken) of bleekmiddel module de uitvoering van dezelfde cel manipulaties mogelijk, maar potentieel enigszins andere instellingen, parameters en namen.

1. Start de wizard FRAP door te klikken op het dropdown menu aan de bovenkant van de software menu (figuur 3A, 1 en 2). Observeer een nieuw venster met verschillende stappen die de set-up van de specifieke parameters voor de laser ablatie toelaat (Figuur 3B, 3).
2. Bepaal de beeldparameters voor de ablatie benadering door het selecteren van het formaat, scansnelheid (Figuur 3B, 4) en gemiddelde (Figuur 3B, 5). Een beeldformaat van 1024 x 1024 bij een scansnelheid van 400 Hz en een lijngemiddeld 4 was het meest van toepassing is.
   Opmerking: Er is gewoonlijk geen noodzaak om de spectrale detectie (bijvoorbeeld de excitatie of emissieparameters) veranderen, zoals ze in het voorgaande acquisitie bepaald.
   1. Als de z-vliegtuig voor ablatie nog niet is geselecteerd (zoals beschreven in stap 2.4.), Druk op de "Live" knop en de focus door middel van het monster tot de tl-structuur of de gewenste z-vlak, dat zal worden weggenomen is in focus.
3. Zodra de algemene beeldparameters worden ingesteld, naar het 'Bleach' stap (figuur 3C, 6) de bijzondere ablatie apparaten te bedienen.
   Opmerking: Een combinatie van de laser intensiteit (Figuur 3C, 8), de scansnelheid en de middeling die is ingesteld in stap 3,2 (Figuur 3B, 4 en 5), en het aantal herhalingen dat zal worden in stap 3,5 (figuur 3E,12), zal de totale verblijftijd van de UV laser op de ROI bleken de efficiëntie te bepalen en dus.
   1. Schakel de 405-nm laser door het activeren van het voor het bleken procedure (figuur 3C, 8).
      OPMERKING: De meeste succes met de bovengenoemde instellingen werd bereikt met 405-nm laser intensiteiten tussen 60-80% in onze experimentele opstelling. Wees ervan bewust dat deze laser vermogen is instrumentspecifieke en zal verschillen voor elke confocale setup.
   2. Gebruik de 'inzoomen' optie (Figuur 3C, 7) op het bleken intensiteit te maximaliseren op de geselecteerde ROI door het verminderen van de scan veld, dus het maximaliseren van verblijftijd. U kunt ook gebruik maken van de "Bleach point" optie van de software van de keuze voor dit proces.
4. Selecteer één of meerdere ROI (Figuur 3D, 10) voor de ablatie met behulp van een van de tekengereedschappen in het beeld overname window (Figuur 3D, 9). Target de axon heuveltje bijvoorbeeld de cirkelvormige tekengereedschap van ongeveer 4-8 urn.
   OPMERKING: De ablatie is instelbaar van een enkele pixel een groter gebied, afhankelijk van de toepassing.
5. Na de oprichting van de ROI, selecteert u de "Time Course" knop (figuur 3E, 11) en bevestig het aantal cycli de ROI wordt gescand / ablatie (figuur 3E, 12). Kies de "Pre-Bleach" en "Post-bleekmiddel" frames als gewenst om een ​​overzicht van het gehele beeld net voor en direct mogelijk na het bleekproces.
6. Na de oprichting van de nodige ablatie parameters, druk op "Run Experiment" (figuur 3E, 13) en toezicht op de efficiëntie van de ablatie.
   LET OP: In onze FRAP setup, een enkel beeld wordt genomen vóór en na de FRAP cyclus met de juiste laser excitation (bijvoorbeeld 488-nm excitatie voor EGFP-expressie brengen). Deze pre- en post-ablatie foto's maken een snelle beslissing van de manier waarop naar tevredenheid de ROI werd gebleekt en hoe effectief de gekozen ablatie parameters waren.
7. Herhaal het proces aanpassing van de laserintensiteit (Figuur 3C, 8), scansnelheid en gemiddelde (Figuur 3B, 4 en 5), en herhalingen (figuur 3E, 12) in het geselecteerde ROI toont het hoge fluorescentie-intensiteit na voltooiing van de FRAP cyclus.

4. Voer de follow-up procedure, en Fish "Rescue" of Verwijdering

1. Indien het experiment terminal inslapen de dieren met een overdosis tricaïne. Verwijder het ei water en vervang deze door verdoving voorraad oplossing gedurende 10 minuten. Om euthanasie te garanderen, controleren onder de microscoop voor de beëindiging van de hartslag.
2. optioneel:Als het experiment is niet terminal, verwijder de vis voorzichtig uit de agarose met fijn pincet en een borstel. Leg de vissen in zoet water en eieren laten herstellen onder observatie 15 min. Als normale zwemgedrag terugkeert, de terugkeer van de vis aan de incubator.
3. Gooi transgene dieren volgens goedgekeurde stroom GGO-afval van de instelling.

Resultaten

De hier beschreven methode maakt de ablatie van motorische neuronen in de zebravis ruggenmerg via de FRAP module van commerciële confocale microscoop. Transgene zebravis lijnen die een groen fluorescerend eiwit in neuronen tot expressie onder de controle van promotoren, zoals - 3mnx1, islet1, respectievelijk opgebracht, werden gebruikt. De expressie van GFP aangedreven door de motor neuron promoter (bijvoorbeeld -3mnx1 respectievelijk opgebracht) maakt hoge-resolutie visualisatie van de cellichamen, de belangrijkste axonen, en de perifere takken uitstrekt naar de spieren (figuur 4 en Video 1).

Neuronen in het ruggenmerg van 3 tot 5 dagen oude vis met succes ablatie, met een totale verblijftijd van 60-80 s bij een laservermogen van ~ 70% en de algemene instellingen beschreven in stap 3. Succesvolle ablatie bereikt wanneer de fluorescentie verdwijnt onmiddellijk na ablatieen nooit hervat (Figuur 5, C en D). Pogingen tot ablatie met andere laserlijnen (zoals de 488-nm laserlijn) niet resulteren in permanente fading en fluorescentie werd hersteld binnen een kort tijdsbestek. Belangrijk is dat deze techniek gedemonstreerd kenmerkend voor apoptotische celdood in de UV-ablatie neuronen, zoals de aanwezigheid van annexine V, consistente morfologische veranderingen van Somal degeneratie en axonale blebbing van de geablateerd neuron ^27.

De specificiteit van deze aanpak wordt bevestigd in de experimenten met de photoconvertible fluorofoor Kaede (dat schakelt de emissie van groen naar rood na blootstelling aan UV-licht), waarbij een enkele doelwit neuron omgezet (Figuur 5, A en B) zonder tekenen van cellulaire vernietiging gedurende een aantal uren. Het gebruik van een hogere laservermogen leidt in plaats to uitsterven van de beoogde neuron (geen photoconversion of terugkeer van fluorescentie) en photoconversion (zonder dood) van de cellen in de nabijheid (~ 20 urn) om het ablatie (figuur 5, C en D).

Een belangrijk voordeel van deze laser geïnduceerde ablatie techniek is de dosisafhankelijkheid van de benadering. Cellen met verschillende intensiteiten targeten, verschillende lagen fine-tuning zijn van het laservermogen aan (Figuur 3C, 8), de scansnelheid en de stippellijn gemiddeld (Figuur 3B, 4 en 5), de grootte van de ROI te ablateren (Figuur 3D, 10), en herhalingen (figuur 3E, 12). Met name kan deze benadering worden gebruikt om cellulaire stress toepassing op individuele cellen in plaats van het induceren van celdood. Zo is fine-tuning geweestheel waardevol om cellulaire processen te beoordelen tijdens de dood van een neuron. Motorische neuronen met lange axonale projecties die werden ablatie met een lagere UV laser intensiteiten geopenbaard karakteristieke 'blebbing "(de vorming en fragmentatie van cellulaire blaasjes), die begon bij de gerichte soma en bleef langs de axon na verloop van tijd (40-90 min; Figuur 4 ; 3D-film van deze ablatie in Video 1). Bijgevolg moduleren van de verschillende laserablatie parameters en derhalve het niveau van geïnduceerde cellulaire stress en het tijdsverloop van de dood stelt onderzoekers een hoge experimentele flexibiliteit.

Figuur 1: Inbedding van de zebravis voor live-imaging. (AF) Inbedding procedure voor live-imaging: (A) tricaïne wordt toegevoegd aan ei water te verdoven de zebravis een ta startdosering van 50 mg / l. (B) laagsmeltende agarose (0,8-1,5%) bereid en verwarmd tot 38-40 ° C. (C) Een transferpipet, de screening en selectie zebravissen worden overgebracht in een schaal met tricaïne oplossing. Na een succesvolle sedatie (ondiepe opercular beweging, verlaagde hartslag, het ontbreken van een keer opgeroepen respons), een vis wordt overgebracht in de voorverwarmde agarose (D). Het minimaliseren van de hoeveelheid eieren water dat in de agarose wordt overgedragen aan volgende verwatering te voorkomen. (E) Open de tab een daling van agarose (~ 30-50 pl) met de zebravis op een glazen bodem 35-mm schotel. Voer deze onder een dissectie microscoop en gebruik een borstel om voorzichtig uitlijnen van de zebravis zijn voorkeursrichting. Wacht 10 - 15 min, totdat de agarose is ingesteld en voeg ~ 2 ml tricaïne oplossing van de schaal (F).ank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Visualisatie van neuronen en microglia in het ruggenmerg van een 3-dpf zebravis. Visualisatie van microglia en neuronen in het ruggenmerg van een 3-dagen oude transgene zebravis uiten van (A) GFP-positieve neuronen (islet1: GFP) en (B) mCherry-positieve microglia (MPEG1: GAL4, UAS: mCherry). (C) Samengesteld beeld van het neuron en microglia kanaal imago van de bright-veld samen met. Het schema insert in (C) toont de oriëntatie van de vissen en beschrijft het gebied gepresenteerd. Schaal bar = 30 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Stappen in het proces van laserablatie UV (zoals beschreven in het protocol, stap 3). Stappen om de FRAP softwaremodule in de confocale software (Leica Application Suite) te controleren. (A) starten FRAP module als middel om UV laserablatie uitgevoerd. (B) Het instellen van de z-vlak voor ablatie en andere FRAP zoals indeling, snelheid en middeling, waarbij de verblijftijd van de laser bepaalt. (C) Controle van de laser intensiteit en de "zoom in" optie om het bleken van de efficiëntie te maximaliseren. (D) Selectie van een of meerdere gebieden van belang (ROI) die worden geablateerd. (E) het tijdsverloop van bleken bepaalt het bleekmiddel cycli en de totale laser rusttijd bij het ROI. Klik op haar e voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Anterograad degeneratie van een UV-geablateerd neuron. Time-lapse beeldvorming van de neurodegeneratie van een UV-ablatie spinale neuron. (AF) UV-bestraling van één spinale neuron (met: GAL4, UAS: EGFP, A, cirkel) resulteerde in de soma van de neuron krimpen en afronding tijd (AC), gevolgd door axonale fragmentatie (CF; pijlpunten) . De axonale degeneratie begon bij de soma (plaats van ablatie) en vorderde anterograde naar het distale uiteinde van het axon totdat uiteindelijk, de fluorescentie in de soma verdwenen en de gehele axon toonde "blebbing" (DF). Schaalbalken = 20 urn. De 3D time-lapse film van deze ablatie wordt in Video 1.es / ftp_upload / 54983 / 54983fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Bevestiging van het effect van eencellige UV bestraling met een photoconvertible fluorofoor (Kaede) in motorneuronen. Validatie van eencellige UV straling door de activering van de photoconvertible fluorofoor Kaede in een neuron. (AD) UV-straling van neuronen gelabeld met Kaede. (A) Photoconversion van één neuron (cirkel) met een laservermogen van 30% gedurende 10 s tot photoconversion van Kaede (van groen naar rood) slechts de aangeschreven neuron (B). Merk op dat de geconverteerde cel overleefde voor enkele uren en vertoonde geen zichtbare tekenen van achteruitgang, zoals blebbing of afronden. Ablatie van een enkele neuron (C ; cirkel) met een hogere laservermogen (95% voor 10 's) onmiddellijk verdwijnen van deze neuron (D) en vervolgens photoconversion van Kaede in een klein aantal omringende neuronen binnen een straal van ongeveer 20 urn. Schaalbalken = 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: 3D rendering oppervlak (Imaris) van de UV ablatie neuron in figuur 4.
De time-lapse video van het neuron weergegeven in figuur 4 is het oppervlak gemaakt met behulp van een visualisatie software (Imaris, Bitplane). Het benadrukt de krimpende werkwijze volgens de geablateerde soma, gevolgd door axonale fragmentatie anterogradely naar het distale uiteinde van de cel.euron_ablation-3D_rendered.mov "target =" _ blank "> Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 1: Optioneel agarose cast voor de lange time imaging.
Om beweging van de vis en de agarose gedurende lange termijn verwerving vermijden stelt een donut gevormde kring agarose langs de randen in het midden van de glazen bodem 35 mm schaal (A). Laat de agarose set voor ~ 10 min en overgebracht vis in de binnenste cirkel met een daling van agarose (B). Probeer de hoeveelheid agarose minimaliseren voor het inbedden (borstel overtollige agarose naar buiten na het oriënteren vis). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Laser Ablation Approaches

Laser-assisted ablatie technieken maken de precieze targeting van individuele of kleine groepen van cellen. Het combineren van deze techniek met een hoge-resolutie microscopie en genetische manipulaties in dierlijke modellen zoals zebravis stelt onderzoekers in staat het systematisch bestuderen van het lot van een individuele cel en de interacties na een blessure.

De UV (405 nm) laser ablatie hier beschreven protocol beschrijft hoe individuele cellen kunnen worden benadrukt of selectief gedood (op een dosis-afhankelijke wijze), terwijl aangrenzende neuronen, glia en axonen onaangetast gelaten. We hebben met succes deze aanpak in celcultuur experimenten gebruikt en beschrijf hier de gedetailleerde aanpak van de zebravis ruggenmerg. We tonen de uitvoering van deze aanpak in de zebravis ruggenmerg door selectieve nadruk individuele neuronen in een netwerk van andere cellen (figuur 5, A en B), of door één neuron doden onmiddellijk en terugwinning (Figuur 5, C en D).

Voorheen gespecialiseerde lasersystemen, zoals gepulste stikstoflaser of twee-foton lasersystemen, moesten weefselbeschadiging en motorische zenuw doorsnijdingen ^{10, 11, 12, 13} opwekken. De lasersystemen zijn met succes gebruikt om celbeschadiging, zoals trombose in de slagaders en aders ^6, acuut nierfalen ^7, hartletsel ⁸ veroorzaken, en calcium golven en microglia reactie na hersenletsel ⁹ bestuderen. Verder Soustelle en collega's gebruikt een conventionele confocale setup (351 nm en 364 nm UV-lasers) om schade aan het epitheel en gliacellen te induceren in Drosophila ^{14 <}/ Sup>.

Relevantie van zebravis Models for Understanding ALS (en andere ziekten bij de mens)

De zebravis is een veelgebruikt modelorganisme, in het bijzonder voor de ontwikkelingsbiologie studies ^{28, 29, 30.} Terwijl zij bepaalde beperkingen, hun vermogen om menselijke ziekten te modelleren en geven een inzicht in pathogene moleculaire mechanismen is enorm. Zebravismodellen zijn goed ingesteld voor de studie van MND en hebben tot belangrijke moleculaire inzichten ^{31, 32, 33, 34.} Transgene zebravis lijnen kunnen snel worden gegenereerd (4-5 maanden) en laat het selectief volgen van een bepaald celtype, hardware die hem een ​​waardevolle toevoeging aan bestaande diermodellen ALS maken. Zebravis embryo's / larven zijn optisch transparant en bieden een unieke ervamentale voordelen die langdurige live beeldvorming mogelijk bij de enkele-cel in de hersenen of het ruggenmerg, die niet gemakkelijk kan worden bereikt knaagdiermodellen (of mens). In combinatie met moleculaire technieken, zoals eencellige ablatie Dit biedt een unieke experimenteel platform voor het bestuderen precieze moleculaire mechanisme in vivo.

Motor Neuronen selectief worden Gerichte Met behulp van UV Laser Ablation

Spinale neuronen in zebravis beginnen te ontwikkelen binnen 10 uur na de geboorte en worden na ongeveer 48 uur ^{35, 36} vastgesteld. Deze snelle ontwikkeling maakt de visualisatie van deze neuronen in korte tijd frames en met een hoge throughput. Motorische neuronen vormen de essentiële schakel tussen de hersenen en spieren, en in ALS, worden beïnvloed in de motorische cortex (bovenste motorische neuronen), de hersenstam en het ruggenmerg (onderste motorische neuronen). Verlies van deze neuronen leidt onvermijdelijk tot muSCLE atrofie en zwakte. Motorische zenuwcellen in het ruggenmerg van de zebravis kan worden geïdentificeerd door hun verschillende projecties en door het gebruik van de motor-neuron specifieke promotors zoals -3MNX1. Gericht op de cel soma van dergelijke projecteren neuronen bleek de anterograde degeneratie langs de axonen projectie in de tijd (figuur 4 en Video 1). Eencellige resolutie beeldvorming van spinale motorische neuronen bovendien bevestigd fosfatidylserine translocatie en de daaruit voortvloeiende annexine V-etiket na laser ablatie (zie Figuur 4 en aanvullende Video 3 in referentie 27). Hoewel we verslag de activering van Annexine V in stervende neuronen na onze UV ​​laserablatie benadering, kunnen we niet vergewissen van de cascade van dood die wordt geactiveerd tijdens de versnelde exact overeenkomt met de neuronale dood die optreedt tijdens neurodegeneratie of normale cel homeostase.

Hoewel deze benadering ablatie is zeer reproduceerbaaren specifieke, verschillende verankering strategieën kunnen ook invloed hebben op de doeltreffendheid van de UV ablatie. In onze ervaring, het was de meest succesvolle van de laag van agarose we onze vis ingebed in een minimum te beperken. Dikkere lagen van inbedding medium met een extra laag van ei water kan de UV macht uiteindelijk door de cel ontvangen te verminderen als gevolg van verzwakking en verstrooiing effecten die optreden langs de stralengang.

In de toekomst zal het overschrijden van verschillende transgene vis lijnen mogelijk maken de visualisatie van de onmiddellijke en korte termijn (tot 12 uur) reacties van andere betrokken cellen, zoals glia, de lasergeïnduceerde celvernietiging. Bijvoorbeeld, astrocyten en niet-cel autonome toxiciteit bij neurodegeneratieve aandoeningen zoals ALS in het onderzoek schijnwerpers en zijn sterk betrokken bij de pathogeniciteit van sporadische en familiale ALS ^{37, 38.} Echter, de mechanismen die ten grondslag liggen aan gliale toxiciteit en selectiviteitin de richting van motorische neuronen blijven onduidelijk. Wij en anderen hebben onlangs voordeel van deze aanpak voor de engulfment sterven neuronen door microglia bestuderen en gevisualiseerd de goedkeuring van de neuronale resten ^{27, 39, 40.}

Combineren van de ablatietechniek met hoge resolutie microscopie en merkers voor neuroinflammation kunnen de onderzoekers in de toekomst het begrip van single-celfunctie en onderling celsystemen breiden. Karakterisering van deze processen in een in vivo omgeving is essentieel niet alleen in ontwikkeling instellingen maar ook in modellen van neurodegeneratieve ziekten, waaronder MND, waar de cellulaire interacties kunnen worden verminderd ^{3, 41.}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose low melting	Fisher-Scientific		Oplossen in eiwater met tricaïne (0,02%) bij 0,8 - 1,5%
Tricaine	Argent Labs	MS-222	0,02%
Harvard standard wall Borosilicate met filament Capillary Glass	World Precision Instruments, Inc.	GC100F-10 (kort) GC100F-15 (lang)	Trek tot een weerstand van 2 - 7 MΩ
Eiwater			0,6 g Instant Ocean zeezout, 4 mL van 1 mg/mL methyleenblauw in 10 L gedeïoniseerd water
1-fenyl-2-thioureum (PTU)	Sigma	P7629
Pronase	Sigma	10165921001
Heat block	Select BioProducts	Digitale blokverwarmer (SBD110_)
Micro-injectieapparaat	World Precision Instruments, Inc.		Micro-injectie werd met de hand uitgevoerd onder een stereomicroscoop (Leica) met een geladen glazen naald en een Picospritzer II (General Valve Corporation)
Stereoscoop	Leica		Heldere veldverlichting microscopie werd uitgevoerd op een Leica M165FC stereo dissectie microscoop (Leica)
Microscoop	Leica	SP5
35 mm glazen bodem schaal	MatTek Corporation	P35G-0-20-C