Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Summary

We presenteren een open source hoog gehalte analyse (HCA) instrument gebruik te maken van geautomatiseerde fluorescentie lifetime imaging (FLIM) voor het testen van eiwit interacties met behulp van Förster resonance energy transfer (FRET) op basis van uitlezingen. Data-acquisitie voor deze openFLIM-HCA instrument wordt bestuurd door software geschreven in μManager en data-analyse wordt uitgevoerd in FLIMfit.

Abstract

We presenteren een open source instrument voor hoogwaardige inhoudsanalyse dat gebruikmaakt van geautomatiseerde fluorescentie-levensduurbeeldvorming (FLIM) voor het meten van eiwitinteracties met behulp van Förster resonantie-energieoverdracht (FRET) gebaseerde resultaten van vaste of levende cellen in multiwell platen. Dit biedt een manier om te screenen voor celsignaleringsprocessen die worden uitgelezen met behulp van intramoleculaire FRET-biosensoor of intermoleculaire FRET van eiwitinteracties zoals oligomerisatie of heterodimerisatie, die kunnen worden gebruikt om bindingspartners te identificeren. We beschrijven hier de functionaliteit van deze geautomatiseerde multiwell plate FLIM-instrumentatie en presenteren voorbeeldgegevens uit onze studies van HIV Gag-eiwit oligomerisatie en een tijdsverloop van een FRET-biosensoor in levende cellen. Een gedetailleerde beschrijving van de praktische implementatie wordt vervolgens gegeven met verwijzing naar een lijst met hardwarecomponenten en een beschrijving van de open source data-acquisitiesoftware geschreven in µManager. De toepassing van FLIMfit, een open source MATLAB-gebaseerde client voor het OMERO-platform, om arrays van multiwell plate FLIM-gegevens te analyseren, wordt ook gepresenteerd. De protocollen voor het beeldvormen van vaste en levende cellen worden geschetst en een demonstratie van een geautomatiseerd multiwell plate FLIM-experiment met cellen die fluorescentie-eiwit-gebaseerde FRET-constructies tot expressie brengen, wordt gepresenteerd. Dit wordt aangevuld met een doorlopende bespreking van de gegevensanalyse voor deze specifieke FLIM FRET-gegevensset.

Introduction

Het toenemende gebruik van geautomatiseerde hoog gehalte analyse (HCA) in drug discovery ¹ tot assay verbinding bibliotheken wordt aangevuld door de ontwikkeling van life science fundamenteel onderzoek in de richting van geautomatiseerde imaging-experimenten voor systematisch onderzoek, bijvoorbeeld voor fenotypische schermen van siRNA bibliotheken. Geautomatiseerde HCA wordt ook steeds belangrijker voor kleinere schaal biologische studies die typisch zijn met handmatige experimenten met tientallen gerechten cellen afgebeeld met conventionele microscopen hebben geïmplementeerd. De door de mogelijkheid om honderden testen en analyseren van duizenden gezichtsvelden verleende statistische power maakt middeling van experimentele noise (met inbegrip van "biologische ruis") en de automatisering van het data-acquisitie en analyse van grote steekproef arrays kunnen helpen elimineren operator vooroordelen en vaak kan worden gebruikt om het optreden van systematische fouten, zoals een verandering in de IRF profiel tijdens een overname detecteren. Fluorescentie gebaseerde testenworden op grote schaal toegepast in HCA, met de meeste commercieel verkrijgbare HCA instrumentatie die fluorescentie-intensiteit beeldvorming in één of meer spectrale kanalen om de relatieve verdeling en co-localisatie van gemerkte eiwitten in kaart. Meer geavanceerde fluorescentie beeldvormende technieken, zoals fluorescentie lifetime imaging (FLIM), polarisatie anisotropie beeldvorming en de tijd ontbonden fluorescentie anisotropie beeldvorming, zijn niet op grote schaal uitgebuit in de commerciële HCA instrumenten, hoewel ze bieden krachtige kwantitatieve uitlezing, bijvoorbeeld van eiwit interacties. Hier presenteren we een open source aanpak van de tenuitvoerlegging FLIM in een geautomatiseerd microscoop voor HCA.

Fluorescentie levenstijd wordt een inherent spectroscopische ratiometrische uitlezing die kunnen worden gebruikt om verschillende moleculaire soorten te onderscheiden of de lokale omgeving van een moleculaire sonde fluorofoor en is ongevoelig voor fluorofoor concentratie excitatie / detectie-efficiëntie en het effect van scattering en sample absorptie ^2. Aangezien fluorescentie levensduur metingen kunnen worden vervaardigd van één spectraal kanaal ze rechtstreeks onderling vergelijkbare instrumenten en monsters zonder kalibratie. Ze kunnen worden toegepast op endogene fluoroforen, waaronder een aantal cellulaire metabolieten, lipiden en extracellulaire matrixcomponenten, intrinsieke uitlezingen van biologische processen en ziekten te verschaffen. Zo label-free FLIM kan in kaart metabole veranderingen in de cellen ^3,4 en is toegepast om toezicht te houden stamcel differentiatie ^5,6 en de groei van collageen steigers ^7. We hebben onlangs aangetoond dat FLIM HCA kan worden gebruikt voor automatische labelvrije assays van cellulaire metabolisme gebruik autofluorescentie ^8. Vaker echter fluorescentie levensduur metingen en FLIM toegepast op exogene fluoroforen die specifieke biomoleculen label, vaak uitgevoerd met behulp van kleurstoffen die cellulaire compartimenten vlekken, gebruik kleurstoffen gekoppeld antibodies dat specifieke eiwitten targeten gefixeerde cellen of middels genetische uitdrukking fluoroforen gekoppeld aan specifieke eiwitten. Fluorescentie levenstijd kan worden gebruikt om robuuste kwantitatieve uitlezingen van fluorescente probes waarnemen van hun fysische of chemische omgeving. Voor voorbeelden, zijn kleurstoffen ingezet om de lokale lipidefase van celmembranen ⁹ of mobiele viscositeit ¹⁰ en genetische uitdrukking fluorescerend eiwit gebaseerde biosensoren zin zijn ontwikkeld om de concentratie van cellen signaalmoleculen bericht ook als IP3 ^11, PIP2 ¹² en calpaïne ¹³ of ionen zoals calcium ^14,15, kalium- ¹⁶ chloride en ^17.

Veel van dergelijke biosensoren gebruik Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ^18,19 tot uitlezingen van veranderingen in de conformatie biosensor te verschaffen. FRET tussen "donor" en "acceptor" fluoroforen gebeurt via een korte afstand direct dipool-dipool interactiewaarvoor fluoroforen worden typisch gescheiden door minder dan ~ 10 nm. Dus de detectie van FRET geeft de nabijheid van geschikte wijze gemerkte eiwitten en verschaft derhalve een middel te lezen eiwit-eiwit interacties ²⁰ zoals binden of oligomerisatie - hetzij als eindpunten in gefixeerde cellen of dynamische gebeurtenissen tijdsverloop metingen van levende cellen. Door het merken van een geschikt moleculair construct met de donor en acceptor fluoroforen, is het ook mogelijk uit te lezen conformatieveranderingen - of splitsing - het construct de verandering in FRET en dit is de basis van veel ²¹ biosensoren. Metingen van de FRET-efficiëntie kan informatie over de donor-acceptor afstand en de bevolking fractie van donor fluoroforen ondergaan FRET bieden. Aldus kan FRET-gebaseerde beeldvormende technieken worden gebruikt in kaart brengen en kwantificeren moleculaire interacties in ruimte en tijd, bijvoorbeeld op het ophelderen cell signaling verwerkt ^22. Automaating dergelijke beeldvormende technieken kunnen high throughput testen leveren gebaseerd op de uitlezing van signaalwegen of netwerken.

In HCA, de FRET uitlezing meest toegepast is spectrale ratiometrische beeldvorming, waarbij veranderingen in de verhouding van de acceptor de donor intensiteit toegewezen. Deze aanpak wordt gemakkelijk uitgevoerd - en is in vele commercieel verkrijgbare multi- plaatlezers - kwantitatief spectraal opgelost FRET metingen vereisen kalibratie van de spectrale respons van het systeem ^23. Dit omvat spectrale overspraak gevolg van spectrale doorbloeding en directe excitatie van de acceptor en de transmissie van het instrument en het monster (binnen filter effect). In principe houdt dit meting van extra "control" monsters die zijn gelabeld met hetzij donor alleen of acceptor alleen-.

Uit zulke spectrale ratiometrische FRET metingen effectief FRETefficiëntie (het product van de werkelijke FRET efficiëntie en fractie van FRETing donor / acceptor moleculen) kan worden verkregen met de relatieve verhouding van donor en acceptor moleculen ^24. Spectrale ratiometrische FRET wordt vaak gebruikt met unimoleculaire FRET biosensoren, waarbij de donor / acceptor stoichiometrie kan worden bekend verondersteld. Om de populatie van de fracties FRETing donor en acceptor, bijv bepalen om een dosis respons curve te verkrijgen, is kennis van de feitelijke FRET efficiëntie vereist. Dit kan worden verkregen door het meten van een positieve FRET controlemonster met bekende eigenschappen of door een andere methode om de FRET-efficiëntie te meten, zoals acceptor fotobleken of FLIM.

Via fluorescentie levensduur uitlezingen kunnen FRET worden gedetecteerd en gekwantificeerd door meting van de donor emissie alleen - waardoor de noodzaak voor spectrale kalibratie en andere controlemonsters. Zo kan FLIM FRET uitlezingen worden vergeleken tussen de instrumentenen tussen de verschillende monsters - zodat de gegevens van endoscopie of tomografie van levende ziektemodellen ²⁵ te worden getoetst aan de metingen van cel-gebaseerde testen. Door toepassing donor fluorescentievervaltijd profielen een geschikt multi-exponentieel model overeenkomt met FRETing en niet- FRETing donor populaties, FRET-efficiëntie en bevolking fracties kunnen in principe rechtstreeks verkregen zonder verdere metingen. Deze aanzienlijke voordelen, echter ten koste van FLIM die meer gedetecteerde fotonen per pixel dan spectraal opgelost intensiteit imaging - typisch honderden fotonen moeten nauwkeurig in leven bepaling van 10% te bereiken bij bevestiging aan een exponentieel verval model wanneer fitting fluorescentievervaltijd profielen complex (multi-exponentieel) modellen, het aantal gedetecteerde fotonen nodig stijgt tot duizenden. Dit heeft gewoonlijk geleid tot lange acquisitietijden (tientallen tot honderden seconden per veld view) voor FLIM, in het bijzonder bij het gebruik van de tijd gecorreleerd single photon tellen (TCSPC) uitgevoerd met een sequentiële pixel acquisitie in laser scanning microscopen. Pogingen om de beeldvormende snelheid met gebruik van hogere excitatie intensiteit kan leiden tot aanzienlijke fotobleken en / of fototoxiciteit. Samen met onvoldoende geschikte commercieel verkrijgbare instrumenten en software, is dit FLIM verhinderd in gebruikelijke HCA voor geneesmiddelen of biologische systemen, waar honderden tot duizenden gezichtsvelden worden afgebeeld. Laser scanning TCSPC FLIM is in een geautomatiseerde multiwell plaat microscoop ²⁶ voor secundaire metingen uitgevoerd na de identificatie van "hits" van steady-state-polarisatie fluorescentie anisotropie imaging ^27, die vergelijkbaar imaging snelheden kunnen bereiken tot spectrale ratiometrische beeldvorming ²⁸ waarmee het aandelen vele voordelen en nadelen. Fluorescentie anisotropie beeldvorming exploiteert de dalingin fluorescentie anisotropie van de acceptor in aanwezigheid van FRET en is ook gevoelig voor spectrale overspraak (bijvoorbeeld directe excitatie van de acceptor). Het vereist kalibratie verantwoorden polarisatie overspraak en geeft geen directe meting van FRET efficiëntie.

Om de voordelen van FLIM voor HCA te realiseren, hebben we gewerkt om de problemen van de snelheid van het beeld overname en ruimere toegang tot de technologie aan te pakken. Hier bieden we een volledige lijst van open source software en hardware componenten die kunnen worden gebruikt om de automatische snelle FLIM multiwell plaat lezer die hieronder beschreven, samen met een exemplaar FRET gebaseerde-assays uit te voeren. In onze benadering ²⁹ wordt FLIM gerealiseerd met behulp van groothoek-time-gated beeldvorming middels een gesloten optische beeldversterker (GOI), wordt geïllustreerd in figuur 1 die snellere beeldvorming en lagere fotobleken dan één aftasting TCSPC door het kunnen verschaffen parallel pixel INTERRogation. Onze openFLIM HCA-instrument kan zonder toezicht FLIM verschaffen, is er slechts een paar seconden om FLIM Datadetecteerwerkwijze enkele 100 fotonen per pixel (afhankelijk van de helderheid van het monster) te verkrijgen. In combinatie met de tijd die nodig is om het monster uit het vorige gezichtsveld verplaatsen, de verwerving instellingen en het monster in focus te houden, resulteert typisch in multi-putjesplaat opnametijden van ~ 10 s per gezichtsveld ^25,28. Optische sectie kan worden geïmplementeerd met behulp van een quasi-wide-field Nipkow ( "spinning disc") scanner ^30.

Voor FLIM data-analyse, hebben we een open source software tool genaamd FLIMfit ³¹ dat in staat is om snel te analyseren multi-putjesplaat FLIM datasets van conventionele pc's en is een plug-in voor OMERO ³² ontwikkeld. FLIMfit biedt wereldwijde analysemogelijkheden (besproken in paragraaf 1.2) dat FLIM gegevens in staat stellen om complexe modellen met o te worden gemonteerdlleen een paar 100 fotonen per pixel in de veronderstelling dat de fluorescentie levensduur componenten zijn invariant over een afbeelding of de regio van belang (ROI), dus het aantal gedetecteerde fotonen nodig, het licht blootstelling aan het monster en beeldacquisitie tijd verminderen. Hardlopen FLIMfit op een standaard desktop PC, vereist slechts 10s seconden van computationele tijd om datasets bestaande uit honderden EPB analyseren. Dus zowel FLIM data-acquisitie en analyse kan worden uitgevoerd op tijdschalen die handig zijn in HCA zijn.

openFLIM-HCA hardware

De uitvoering van FLIM HCA omvat zes belangrijke componenten: (i) een fluorescentiemicroscoop frame met optische autofocus; (Ii) een motor (xyz) microscooptafel; (Iii) een excitatie laserbron; (Iv) een groothoek-time-gated FLIM systeem gated optische versterker (GOI), vertragingsgenerator en camera; (V) een computer voor data-acquisitie en-analyse en (vi) een Nipkowschijf scannerunit voor het optisch deelbaar beeldvorming onscherp licht te onderdrukken. Dit kan van belang zijn bij de beeldvorming van zwakke signalen, bijvoorbeeld van FRET biosensoren in de cel plasmamembraan, die kunnen worden overspoeld door bijdragen van cytoplasmatische fluorescentie of de achtergrond van dekglaasjes of het kweekmedium. Time gated FLIM gegevens verkregen door het verlichten van het monster met de ultrakorte gepulste excitatie straling, beeldvorming van de fluorescentie-emissie aan de fotokathode van de GOI en het verwerven van een reeks CCD beelden van de fosfor van de GOI voor verschillende instellingen van tijdvertraging de optische versterker uitgang na de aankomst van de excitatiepulsen. Aangezien de tijdpoort termijn na excitatie wordt verhoogd, wordt het fluorescentiesignaal gezien afneemt en de serie-time-gated fluorescentie-intensiteit beelden opgenomen op de CCD vormen de gegevensset moeten het verval profielen van alle fluoroforen analyseren het gezichtsveld . De gating van de GOI wordt gesynchroniseerd met de excitatiepulsenen, voor de reeksen van CCD acquisities de vertraging van de tijdpoort opzichte van de excitatie pulsen ingesteld op een reeks van toenemende waarden over het gewenste bereik. Deze synchronisatie wordt bereikt met behulp van de vertraging generator die een "snelle vertraging box" (het verstrekken van vertragingen tot 20 ns in 1 ps stappen) en een "grove vertraging box" dat vertragingen voorziet van een minimum stap van 25 ps omvat.

Voor FLIM, kan excitatie worden geleverd door een ultrasnelle laser. Gemakshalve we gebruiken typisch een fiber-laser gepompt supercontinuum bron die picoseconde pulsen afstembare voorziet in het zichtbare spectrum waarvan de juiste excitatie straling kan worden geselecteerd voor elk fluorofoor met een gemotoriseerde filterwiel met verschillende banddoorlaatfilters. Gewoonlijk gebruiken we een gemiddeld vermogen van ~ 100-200 uW het monster met pulsen op 40 of 60 MHz herhalingsfrequentie. Dergelijke excitatievermogens kan ook door ultrasnelle laserbronnen gebaseerd op frequentieverdubbeling van-Modus opgesloten titanium gedoopt saffier lasers. Merk op dat een excitatie pulsduur onderstaande ~ 100 ps is voldoende voor de meeste experimenten. Een tweede gemotoriseerde filterwiel met neutrale dichtheid filters wordt gebruikt om de excitatie-intensiteit te regelen. Voor veiligheid en gemak kan de excitatie straling worden geleverd via een single mode optische vezel. De configuraties voor wide-field FLIM en optisch FLIM doorsnede zijn weergegeven in figuren 2 en 3 respectievelijk. Voor meer details over de precieze componenten gebruikt, kunt u terecht op de openFLIM-HCA wiki ^33. Een kopie van de huidige stuklijst wordt gegeven in het aanvullend materiaal.

Voor groothoek FLIM, wordt de excitatie straling nodig is om het gehele gezichtsveld zo gelijkmatig mogelijk te verlichten. Hierbij sturen wij de excitatie laserbundel een holografisch "top-hat" diffuser die geroteerd met 10-50 Hz tijdgemiddelde de laser speckle, met het vlak van de diffuser wordt afgebeeld op de achterkant brandvlak van het objectief lens microscoop. De fluorescentie afbeelding van de uitgang van de microscoop wordt doorgegeven op de fotokathode van de GOI en de fosfor van het GOI (actieve gebied diagonaal 18 mm) wordt afgebeeld op de sensor van een gekoelde wetenschappelijke CCD (chip grootte 10,2 mm x 8,3 mm) camera met een paar cameralenzen verschaffen een vergroting van 0,7. Het systeem wordt bestuurd door een standaard PC die is gekoppeld aan de instrumenten via RS232 protocol. Bovendien wordt een Arduino microprocessor gebruikt om een ​​sluiter van het excitatielicht pad gesloten behalve wanneer de CCD camera verwerft FLIM gegevens en de signaal opnemen van een fotodiode die wordt gebruikt om het gemiddelde vermogen van de spectraal gefilterde supercontinuum waarden meten excitatie bron. Voor optisch doorsnede FLIM, wordt de excitatie laserstraling gekoppeld in een single-mode polarisatie-behoud optische vezel die rechtstreeks op de Nipkow schijf scannereenheid als shown in figuur 3. De uitvoer fluorescentie afbeelding van de Nipkow scanner wordt doorgegeven op de fotokathode van de GOI en de rest van het systeem is hetzelfde als voor wide-field FLIM.

openFLIM-HCA software

De data acquisitie software is geschreven in μManager ^34. Het biedt volledige HCA data acquisitie functionaliteit waaronder opties om de volgorde waarin de putjes van de plaat wordt belicht wijzigen om verloop in de tijd nemen voor elke FOV, automatisch gericht houden tijdens de metingen en de excitatie en emissie filterwielen en de dichroïsche wisselaar geautomatiseerde multicolor beeldvorming. Het is ook mogelijk om een "prescan" acquisitie van fluorescentie-intensiteit draaien om automatisch te identificeren en vermelden de posities van geschikte EPB voor een volgende aankoop FLIM volgens criteria, bijvoorbeeld op basis van intensiteit. FLIM HCA gegevens kunnen worden opgeslagen als een reeksvan TIFF-bestanden, als een reeks van OME-TIFF-bestanden (dat wil zeggen, één per FOV) of als een enkele OME-TIFF-bestand waarin alle gegevens van een plaat met meerdere putjes. Meer informatie en een gedetailleerde beschrijving van de μManager software is te vinden op de openFLIM-HCA wiki ^33.

De software voor gegevensanalyse, FLIMfit ^31, een open source MATLAB-client voor het beeld OMERO data management platform ^32, kan FLIM gegevens vanuit een OMERO server of computer disk, zoals in figuur 4. Het is ontworpen om gegevens van TCSPC of groothoek-time-gated FLIM instrumenten analyseert en biedt een groot aantal mogelijkheden om gegevens aanpassen van openFLIM-HCA inclusief fitting verval profielen monoexponential en exponentiële en hogere complexiteit verval profielen, met inbegrip van modellen zoals verdubbelen -polarisatie fluorescentie verval profielen. Het kan ook rekening houden met een vaste en tijdsafhankelijke achtergrond signalen en kan UtiLize een afgemeten ruimte-tijd-instrument response function (IRF) of kan passen met behulp van een geïdealiseerde IRF dat de tijd verschoven op een pixel-wise basis met een bedrag bepaald op basis van de volledige experimentele IRF meting kan zijn. Een globale tijdverschil (t ₀₎ tussen de IRF en een fluorescent monster kan worden bepaald uit een meting van een standaard fluorescentie. Ruimtelijke variatie in achtergrondsignalen en IRF kan ook rekening worden gehouden. FLIMfit is in staat om FLIM gegevens passen op een pixel-wise basis of met behulp van "global binning" of "global fitting" naar montage van FLIM data met een bescheiden (honderden) te vergemakkelijken foton nummers om complexe verval modellen.

Global binning houdt het aggregeren van alle gedetecteerde fotonen van de pixels binnen een door de gebruiker gedefinieerde ROI op elk tijdstip om voldoende foton nummers bieden passend bij complexe verval modellen in te schakelen. De ROI kan het volledige gezichtsveld (FOV) zijn, kan het handmatig worden defined door de gebruiker of kan worden bepaald met behulp beeld segmentatietools. De ROI kan ook worden gedefinieerd met behulp van maskers in FLIMfit uit andere afbeelding segmentatie software geïmporteerd. FRET toepassingen is het gebruikelijk om globale binning gebruiken te bevestigen aan een dubbele exponentieel model om de fluorescentie levenstijd overeenkomstige delen FRETing en niet- FRETing donorfluoroforen die verondersteld ruimtelijk invariant in de ROI te bepalen en vervolgens monteer een pixel-wise basis daarvan teneinde de FRETing donorpopulatie fractie elke pixel verkregen vaste component vales levensduur.

Global fitting met zich meebrengt tegelijkertijd de montage van de levensduur van componenten en pixel-wise FRETing donor bevolking fracties over de gehele FOV- of over een FLIM dataset die meerdere EPB, bijvoorbeeld kunnen bestaan uit een plaat met meerdere putjes experiment of een tijdreeks van fluorescentie levensduur beelden. Global montage kan de ruimtelijke Variati benuttenbetreffende populatie van breuken in het beeld die verloren gaat in het globale binning benadering sterker beperkingen van de component levensduur schatting geven - en daardoor betrouwbare resultaten - zij het ten koste van aanzienlijk berekening ^35. FLIMfit kan snel analyseren multiwell plaat FLIM datasets met de wereldwijde montage van conventionele pc-werkplekken met, bijvoorbeeld, een multiwell-time-gated FLIM dataset, verkregen met vijf tijdpoorten voor elk van 394 FOV elk bestaande uit 672 x 512 pixels, die slechts 32 seconden en 2 GB geheugen aan te passen aan een dubbele exponentieel verval model ^31. Dit is bereikt door gebruik scheidbare niet-lineaire kleinste kwadraat fitting algoritme geïmplementeerd met multithreaded parallelle algoritmen effectief upscaling van multicoreprocessors en FLIMfit code is geoptimaliseerd geheugengebruik minimaliseren schakelen. Figuur 5 toont een momentopname van de grafische gebruikersinterface van FLIMfiten meer informatie is te vinden op de webpagina opgegeven in verwijzing 36. Nadere informatie over wereldwijde montage en wereldwijde binning kan gevonden worden in referentie 31.

Het volgende protocol voor FLIM HCA met behulp van onze openFLIM-HCA instrumentatie en software kan worden aangepast voor een breed scala van cell imaging experimenten met FLIM uitlezingen. In het algemeen multi-putjesplaat FRET proeven worden ontworpen repliceren putjes van positieve en negatieve controles biologische naast de omvatten onderzocht. Hier hebben we de specifieke implementatie optisch doorsnede FLIM uitvoeren beschrijven (zie figuur 3) van Cos cellen die FRET-constructen bestaande uit de mTurquoise fluorescerend eiwit en fluorescerend eiwit Venus verbonden door een korte peptide verbinder. Hier de mTq32V, mTq17V en mTq5V FRET constructies (besproken in representatieve resultaten sectie) bieden laag, midden en hoog FRET efficiëntie samen met de niet-FRETing mTq5A construeren.Deze constructen en andere materialen die nodig zijn om dit protocol te volgen zijn opgenomen in de lijst Materials.

Protocol

1. Voorbereiding van de multi-putjesplaat Array

1. Bereid een oplossing van 75 uM Cumarine 6 in ethanol (τ ~ 2,43 ns) voor referentie metingen om de bepaling van t ₀ in te schakelen.
2. Seed 150.000 Cos cellen in vier putjes van een plaat met 6 putjes en laat 's nachts hechten in kweekmedium (zie Materials List).
3. Transfecteren een goed elk met mTq5A, mTq5V, mTq17V en mTq32V met behulp van een commercieel transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant en cultuur voor 24 uur.
4. Los cellen met een commercieel trypsine / EDTA oplossing volgens protocol van de fabrikant.
5. Pipetteer 5000 Cos cellen gesuspendeerd in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) tot expressie mTq5A in elk van de putjes A1-G3 of a # dikte 1,5 glazen bodem 96 multi-putjesplaat die eerder behandeld is met poly-L-lysine. Herhaal dit voor mTq5V tot expressie brengen in putten A4-G6, mTq17V in putten A5-G9 en mTq32V in putten A10-G12.
6. Laat goed H1 leeg (de meting van de statische achtergrond voorzien van de multi-putjesplaat).
7. Pipetteer 200 ul HBSS slechts in duidelijk H2 (meting van elke achtergrondsignaal uit het celkweekmedium verschaffen).
8. Pipette 5000 niet-getransfecteerde cellen in HBSS in goed H3 (de meting van elke achtergrond signaal van cellulaire autofluorescentie te bieden).
9. Pipetteer 200 ul van 75 uM Cumarine kleurstofoplossing in duidelijk H4 (na controle van elke variant van t ₀ daarvan gedurende de multi-putjesplaat verkrijgen, bijvoorbeeld als gevolg van veranderingen in de omgevingstemperatuur of schommelingen in laser of timing circuit.

2. openFLIM-HCA Data Acquisition

OPMERKING: Gedetailleerde informatie vindt u op de openFLIM-HCA wiki ^33.

1. Start μManager en de OpenFLIM-HCA Plugin
2. Selecteer de kalibratiebestand voor de specifieke combinatie van delay generatoreenheid enlaser herhalingsfrequentie onder "FLIM control: Vertraging box kalibratiebestand: Calibration Files".
3. Stel de map waar de gegevens op grond worden opgeslagen "File: Set Base Folder".
4. Controleer de excitatie balk pad naar die koppeling in de levering van optische vezels zorgen voor stabiel is en dat de koppeling efficiëntie wordt gemaximaliseerd door het meten van de macht overgedragen door levering vezel met behulp van een power meter. Schommelingen van minder dan 5% zijn aanvaardbaar.
5. Controleer dat de Indiase overheid triggering is stabiel door het weergeven van de monitor uitgangssignaal van de Indiase overheid zich op een oscilloscoop veroorzaakt door de Indiase overheid ingang trigger signaal.
6. Controleer de beeldvorming van de Indiase overheid fosfor op de CCD-sensor door het bedekken van de fotokathode van de Indiase overheid, het vaststellen van zijn winst tot 750 V en zich te concentreren een van de relais lenzen zodanig dat beelden van schaars single photon gebeurtenissen (als gevolg van achtergrondlicht lekkende hoewel de Indiase overheid deksel ) opgenomen op de CCD zijn zo scherp mogelijk.
7. Controleer dat het monstergezichtsveld wordt uniform belicht door het afbeelden van een uniform fluorescent monster, zoals een daling van de referentie kleurstofoplossing op een dekglaasje met een voldoende laag excitatievermogen (<1 uW) ervoor zorgen dat de Indiase overheid niet verzadigd.
8. Selecteer het juiste bord definitie bestand, dat wil zeggen, kies optie voor 96-well platen ( "File: Load Plate eigenschappen").
9. Met de μManager GUI zorgen dat er geen dichroïsche bundelsplitser kubus in de microscoop bij selecteren een lege positie.
10. selecteert u handmatig een poort breedte van 4 ns bij de Indiase overheid voor het hele experiment.
11. Verwerven IRF beeldgegevens:
    1. Met de μManager GUI zorgen dat er geen microscoopobjectief in de stralengang door het selecteren van een lege positie. Handmatig plaats een zwart geanodiseerd balk blok boven de doelstelling revolver om eventuele laserlicht ontsnappen en de hoek van het aan een reflectie terug in de microscoop kader minimaliseren voorkomen.
    2. De μManager GUI Stel de filters in de CSUX (Excitatie, Dichroic, Emission) zodat de fractie van excitatielicht verspreid van de draaiende Nipkowschijf kan worden afgebeeld, maar zorgen de intensiteit niet voldoende is om het systeem te verzadigen van een 200 ms CCD integratie tijd. Dit is om te voorkomen dat het blootstellen van de Indiase overheid fotokathode te veel licht, dat de fotokathode kunnen beschadigen.
    3. Gebruik de Find maxpoint functie over het volledige bereik van de vertragingen die onder de programmeerbare snel vertraging doos. Controleer de uitvoer diagram weergegeven en pas de handleiding cursus vertraging vak door op de forward-knop, zodat de volledige IRF profiel binnen het scan bereik van de snelle vertraging doos.
    4. Pas de acquisitie parameters (neutrale dichtheid, Belichtingstijd, Frame accumulatie), zodat de CCD wordt niet verzadigd in de helderste tijd-poort en de effectieve integratie tijd> 200 ms.
    5. Stel vertraging stappen van 25 ps over de volle vertraging beldee ( "FLIM control: Fast vertraging doos Bevolk vertragingen").
    6. Image IRF verwerven door het "image Snap FLIM" te drukken.
    7. Een achtergrondafbeelding te verwerven door het blokkeren van de laser ( "Light control pad: Neutraal dichtheid: geblokkeerd"), het verminderen van het aantal vertragingen ( "FLIM control: Fast vertraging doos: Actueel vertraging instelling (ps)"), laat alle andere eigenschappen onveranderd en druk op "Snap FLIM imago".
12. Verwerven verwijzing dye gegevens:
    1. Selecteer goed H4 met behulp van de μManager GUI ( "XYZ control: Ga goed: H4").
    2. Met behulp van de μManager GUI selecteert u filters (excitatie 434/17 nm, Dichroic, Emission 482/25 nm) voor het afbeelden van mTqFP.
    3. Gebruik de Find maxpoint functie over het gehele bereik van de snelle vertraging doos en pas vervolgens de grove vertraging doos, zodat de volledige verval profiel binnen de vertraging bereik van de snelle vertraging doos.
    4. Stel de vertragingtot op het punt van de maximale intensiteit door het veranderen "FLIM control: Fast vertraging doos: Actueel vertraging instelling (ps)". Pas de verwervingsparameters (neutrale dichtheid Blootstellingstijd), zodat de CCD niet verzadigd.
    5. Stel vertraging stappen van 25 ps over de volle vertraging bereik ( "FLIM control: Fast vertraging doos Bevolk vertragingen).
    6. Verwerven verwijzing kleurstof data door "image Snap FLIM" te drukken.
    7. afbeelding van een CCD-camera tweede achtergrond te verwerven door het blokkeren van de excitatie laser (zie 2.11.7)
13. Verwerven FLIM gegevens van de multi- plaat monster met behulp van de μManager acquisitie software:
    1. Set die putten moeten worden afgebeeld en het aantal FOV per putje ( ": XYZ posities Setup HCA gefaseerde overname") te verwerven.
    2. Selecteer handmatig een voorbeeld FOV met het monster af te beelden. Gebruik deze FOV naar de optimale neutrale dichtheid filter, gate breedte aan de Indiase overheid te bepalen enintegratietijd van de camera om 75% van het dynamische bereik van de CCD-camera bereikt.
    3. Stel autofocus ( "XYZ control: Autofocus"): Druk op "alleen Return nadruk control", en vervolgens handmatig scherp op de cellen of de structuur van belang. Stel "Autofocus search range" tot 2000 pm en druk op "Enter". Druk op "AF nu" om een autofocus procedure in te leiden. Een offset waarde wordt weergegeven in het veld "FocusOffset (autofocus)".
    4. Voer de offset waarde verkregen in 2.13.3 in "AF offset" en twee keer herhaal de autofocus procedure ( "AF now") om te controleren of de offset waarde is nu nul is, met vermelding van de correcte werking van het autofocussysteem.
    5. Gebruik de functie "autogate" in de OpenFLIM-HCA acquisitie software om een logaritmische bemonstering van de vertraging punten te kiezen. Als alternatief kunnen deze handmatig worden geselecteerd, kunt u verwijzenENCE 36 voor meer informatie.
    6. Stel "Verzamel Frames" naar een waarde die de opbrengsten gewenste totale data-acquisitie tijd. Verhoging van het aantal geaccumuleerde frames toeneemt signaal-ruisverhouding van de FLIM gegevens ten koste van ook toenemende totale FLIM data acquisitie tijd.
    7. Voer de FLIM overname van de multiwell plaat door op de "Start HCA sequentie" knop.
14. Acquire image een verdere achtergrond CCD-camera door het blokkeren van de excitatie laser (zie 2.11.7) met identieke overname instellingen zoals gebruikt voor de aankoop FLIM data.

3. openFLIM-HCA Data Analysis Met behulp FLIMfit

1. Controleer of de nodige ondersteunende bestanden voor het FLIM data-analyse aanwezig zijn (dat wil zeggen, IRF en referentie-dye meting).
2. Laad de gegevens van de lege put (H1), het putje met kweekmedium (H2) en putje met ongelabelde cellen in kweekmedium (H3) in FLIMfit( "Bestand: Load FLIM data") om te controleren of er geen achtergrond bijdragen groter is dan 1% van het signaal van de cellen die 'enige donor-", dat wil zeggen, in putten A1-G3.
3. Maak een achtergrond file-tijdsafhankelijke (TVB) door het laden van het goed met kweekmedium in FLIMfit ( "File: Load FLIM data"). Laad de camera achtergrond data verkregen in paragraaf 2.14 ( "Achtergrond: Load Background") en gebruik de FLIMfit optie "Tools: Maak TVB Intensity Map" om de TVB te genereren. Zie referentie 31 voor meer informatie over de TVB.
4. Bereid de ruimtelijk variërende IRF Shift kaart door het laden van de IRF data verkregen in paragraaf 2.11 en aftrekken van de CCD-camera achtergrond verworven in paragraaf 2.11.7. Gebruik de FLIMfit optie "Tools: Maak IRF Shift Map" voor de berekening van het ruimtelijk variërende IRF Shift Map. Zie referentie [31] voor meer informatie over de IRF Shift Map.
5. Monteer een monoexponentieel verval met de referentie kleurstof data verkregen in paragraaf 2.12. Load verwijzing kleurstof en het ruimtelijk variërende IRF Map berekend in paragraaf 3.4, stelt fit parameters ( "Lifetime: No Exp: 1") met t ₀ set als een ingerichte parameter ( "Lifetime: FIT IRF Shift: Gepaste"). De waarde van t ₀ verkregen wordt vervolgens gerapporteerd in de tabel op het tabblad "Parameters".
6. Analyseer de FLIM gegevens door het laden van de experimentele FLIM data verkregen in paragraaf 2.13, het ruimtelijk variërende IRF Map berekend in paragraaf 3.4, de camera achtergrond verworven in paragraaf 2.14, de TVB dossier opgesteld in paragraaf 3.3 en typ de negatieve waarde van t ₀ verkregen in paragraaf 3.5 ( "IRF: IRF shift: t _0"). Monteer vervolgens de experimentele data aan de gewenste vervalmodel behulp FLIMfit ³⁶ volgens de eisen van het experiment.

Results

Om de mogelijkheden van de openFLIM-HCA instrumentatie te illustreren, presenteren we drie exemplaar FRET toepassingen. De eerste betreft FRET constructies die zijn aangepast van FRET model constructies ontwikkeld door Stephen Vogel's laboratorium ^38. Ze bestaan ​​uit een reeks van genetische constructen tot expressie fluorescerende waarin een donor fluorescerend eiwit (mTurquoise) is verbonden met een acceptor fluorofoor (Venus) van korte gecontroleerde lengte van 5, 17 en 32 aminozuren (mTq5V, mTq17V, mTq32V). De verschillende lengtes linker tussen donor en acceptor fluoroforen resulteren in verschillende FRET efficiëntie en dus verschillende donor levensduren. Om een negatieve controle te bieden, is de Venus in de korte 5-aminozuur linker construct vervangen door Amber - een niet-fluorescerende mutatie van YFP (mTq5A) die niet als een FRET acceptor ³⁸ kan fungeren. We vervangen Cerulean in de originele pCXV en pC5A vectoren door restrictie verteren de vectors met NheI en BglII enzymen en ligeren mTurquoise fragmenten gedigereerd met dezelfde enzymen uit de pmTurquoise-N1 vector. De linker gebied werd ongemodificeerd door deze substitutie.

Figuur 6 toont een voorbeeld FLIM FRET assay gebruik van dit modelsysteem expressie in Cos-cellen, waarin een multiwell plaat wordt bekleed met 3 kolommen elk cellen getransfecteerd met het negatieve controle (kolommen 1-3), de 5-aminozuurlinker FRET-construct (kolommen 4-6), de 17-aminozuur linker FRET-construct (kolommen 7-9) en het 32 ​​aminozuur linker FRET-construct (kolommen 10-12). Rij H bevat putten voor TVB schatting. Figuur 6 (a) toont voorbeelden van automatisch verkregen fluorescentielevensduur afbeeldingen typisch gezichtsveld in elk putje. Het is duidelijk dat de negatieve controle (kolommen 1-3) worden de langste levensduur en de donor levensduur laagst voor FRET construct met de kortste linker lenGTH (kolommen 4-6). Figuur 6 (b) laat zien hoe de gemiddelde levensduur gemiddeld over alle EPB in elk putje verschilt de multi-putjesplaat. Figuren 6 (c) en (d) tonen exemplaar donor fluorescentie-intensiteit-samengevoegde lifetime kaarten voor een FOV van mTq5A en mTq17V respectievelijk. Figuur 6 (e) toont de donor fluorescentie-intensiteit verval profiel gemiddeld over alle cellen afgebeeld in zowel A1, samen met de pasvorm van een mono-exponentiële vervalmodel en IRF (die wordt gedomineerd door het GOI poortbreedte). Figuur 6 (f) geeft de gemiddelde fluorescentie levensduur voor elke kolom van de multi-putjesplaat verkregen uit een pixel-wise monoexponential fit. Een tabel van de gemiddelde levensduur en de standaardafwijking (STD) zijn te vinden in tabel 1 hieronder. Het data-acquisitiesysteem van de in figuur 6 beelden duurde ongeveer 160 minuten te verwerven. De analyse werd 92 s op een 2,6 GHz-computer met 10 cores en 64 GB RAM.

Het tweede voorbeeld onderzoek toont de toepassing van FLIM FRET om de oligomerisatie van HIV-1 Gag uitgelezen tijdens de assemblage van HIV-1 virions als middel remmers van dit proces ^25,42 testen. Expressie HIV-1 Gag in geschikte gastheercellen verschaft een modelsysteem voor deze fase van de HIV-1 levenscyclus omdat het leidt tot de vorming van virusachtige deeltjes (VLP's) die vergelijkbaar zijn met HIV-1 virions onvolwassen zijn. Voor deze test hebben wij op HIV-1-Gag-eiwit gefuseerd met GVB in HeLa-cellen en vergeleken de werking van verschillende remmers via hun impact op de FRET signaal dat het gevolg is van de Gag oligomerisatie. Details van de remmers die worden gegeven in referentie 42.

De details van het monster voorbereiding en experimentele metingen worden uitvoerig beschreven in referentie 25, waar we laten zien dat we kunnen gebruiken FLIM te lezen both heteroFRET tussen het aggregeren van de Prop van de eiwitten stochastisch gemerkt met het GVB en YFP, en ook homoFRET in cellen die alleen Gag gelabeld met GVB. Hoewel homoFRET een verandering in donor leven meestal niet aanwezig, hij doet voor het speciale geval van de GVB waarbij de fluorofoor bestaat in twee isomeren met verschillende gemiddelde fluorescentie levens ^40,41. Het GVB homo-FRET uitlezing heeft de voordelen van vereenvoudigde monstervoorbereiding dan GFP / YFP hetero-FRET en is spectrumefficiënte, die belangrijk zijn voor gemultiplexte FRET uitlezing kan zijn.

Ons voorafgaand werk toegepast FLIM FRET het Gag oligomerisatie testen in aanwezigheid van een N-myristoyltransferase (NMT) remmer ^42. Deze remmer verstoort de endogene enzymen verantwoordelijk voor de toevoeging van myristinezuur aan Gag, Gag-eiwitten die in staat stelt om te binden aan het plasmamembraan en is een voorwaarde ⁴³ in de vorming van HIV virionen ofVLP's. We toonden aan dat zowel heteroFRET en homoFRET uitlezing Z 'van> 0,6 in dosis-respons studies konden bereiken met een NMT-remmer. Z 'een parameter die wordt gebruikt in de farmaceutische industrie om de kwaliteit van een test te geven en vertegenwoordigt het verschil in de gemiddelde waarden van de positieve en negatieve controles en hun relatieve spreads een bepaalde waarde gegeven assay kwaliteit genereren - met Z'> 0,5 wordt beschouwd als "uitstekend" voor een farmaceutisch assay ^44. We merken dat deze uitstekende prestatie werd bereikt met monsters waarvoor de verandering in gemiddelde donor levensduur in de orde van 300 ps - aantonen van de statistisch analyseren FLIM gegevens voor grote aantallen cellen, die nuttig uitlezingen mogelijk maakt te realiseren aanzienlijk geringere veranderingen in fluorescentie levensduur dan mogelijk is met de typische aantallen cellen afgebeeld in de handmatige microscopie experimenten.

Hier presenteren we een plaat met meerdere putjes FLIM FRET dataset vergelijken 4-remmer verbindingen voor HIV Gag oligomerisatie (aangeduid ICL13, ICL14, ICL15 & ICL16). Voor dit experiment gebruikt we homoFRET uitlezing met HeLa-cellen die tijdelijk getransfecteerd met de plasmide Gag-GVB. Een totaal van negen verschillende doses van elk remmer werden aangebracht naar aanleiding van de standaard protocol beschreven in referentie 32, zodat twee herhalen putten per aandoening. Als positieve controle, kolom 1 toont cellen die myr-Gag, Gag een gemuteerd eiwit dat de myristinezuur groep die kunnen vormen VLP enzovoort simuleert totale remming. Een negatieve controle werd verschaft door het doseren cellen die gag-GVB alleen met alleen het voertuiginterieur de remmers te leveren in de andere kolommen (kolom 11). Een totaal van acht FOV werden per well verworven.

Gegevens werden met één enkel exponentieel verval model op een pixel voor pixel basis en de fluorescentie levenstijd plate kaart waarop de gemiddelde levensduur per putje (voor alle pixels boven de intensiteitsdrempel over de acht gezichtsvelden) wordt hieronder in figuur 7 getoonde (a). Figuur 7 (b) toont de overeenkomstige grafiek van de fluorescentie levensduur als functie van inhibitor concentratie. Drie van de remmers tonen een remmend effect (ICL13, ICL15 & ICL16) bij incubatie met cellen die Gag-GVB. Één remmer (ICL14) vertoont geen effect op elk geteste dosis. De Z 'berekend voor deze plaat was 0,51. De waarden voor de positieve en negatieve controles zijn getoond in figuur 7 (b) de punten in zwart bij 100 pM en 0,1 nM.

De dosis respons curven voor ICL13, ICL15 ICL16 en figuur 7 (b) werden vervolgens aan de 4 parameter logistische lineaire regressiemodel met de 1 ⁴⁵ met de hoogste en laagste levens vaste Hill coëfficiënt op de vastewaarden verkregen uit de positieve (kolom 1) en negatieve (kolom 11) bestuurt respectievelijk. De geretourneerde IC _50-waarden voor de drie krommen zijn dan: 38 nM, 24 nM en 116 nM voor ICL13, ICL15 en ICL16 respectievelijk. Ter vergelijking met IC _50-waarden verkregen via intracellulaire FLIM FRET metingen bepaalden wij _IC50 voor remming van de enzymatische activiteit van recombinant humaan NMT1 in onze eerder gerapporteerde biochemische enzymtest ^42. De drie verbindingen actief bevonden door FLIM FRET ook de bij deze proef actief (IC _50-waarden van 17 nM, 51 nM en 39 nM voor ICL13, ICL15 en ICL16 respectievelijk), met ICL14, waarbij geen significante reactie vertoonden in de FLIM FRET assay, waarbij ca. 100-voudig minder actief tegen NMT1 _(IC50 van 1700 nM). Voor de actieve verbindingen, de IC _50-waarden verkregen door deze onafhankelijke test modaliteiten opmerkelijk overeen, met kleine wijzigingen waarschijnlijk worden veroorzaakt door differences in opname of metabolisme van de verbinding in cellen.

Deze kleine studie benadrukt het vermogen van FLIM HCA om de sterkte van verschillende verbindingen die inwerken op hetzelfde doelwit van belang onderscheid. Wij geloven dat het de eerste demonstratie van een scherm met geautomatiseerde FLIM in een hoog gehalte context meerdere dosisresponscurven genereren en illustreert het potentieel voor FLIM worden toegepast voor het screenen op en / of karakteriseren nuttige therapeutische verbindingen.

Het derde voorbeeld FLIM FRET experiment betreft een genetische uitdrukking FRET biosensor voor Exchange eiwit geactiveerd cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP (EPAC)), een Rap-1 guanine exchange factor die specifiek bindt aan cAMP. Deze EPAC FRET biosensor (EPAC-S ^H188) gebruikt mTurquoise2 fluorescerend eiwit (mTq2FP) als donor fluorofoor en bevat twee Venus-FP een co implementerenmposite acceptor ^46. cAMP is een alomtegenwoordige tweede boodschapper en is betrokken bij een overvloed aan intracellulaire processen in verschillende organismen. Het wordt gesynthetiseerd door adenylaatcyclase uit de omzetting van ATP in het celmembraan. Hier laten we ons vermogen om te lezen en zijn activiteit te kwantificeren levende HEK293T cellen na de toevoeging van forskoline, een adenylaat cyclase activator die intracellulaire productie van cAMP opreguleert en verhoogt dus het cytoplasmatische concentratie. Deze EPAC sensor ondergaat FRET in zijn geïnactiveerd (ongebonden) staat en zijn donor levensduur toeneemt met cAMP concentratie als de cAMP leidt tot de opening van de biosensor. De mono-exponentieel verval profiel van mTq2FP maakt deze biosensor beter geschikt voor de kwantitatieve analyse levensduur dan GVB-gebaseerde biosensoren ^45. Figuur 8 toont een voorbeeld van een tijdsverloop opgenomen met de geautomatiseerde multi- putjesplaat FLIM microscoop waar we de verandering hebben uitgezetin gemiddelde levensduur en de verandering in de fractie FRETing donorpopulatie tijd na de toevoeging van 100 uM forskoline. Voor de eenvoud veronderstellen we dat het totale signaal kan worden beschreven door een mengsel van mono-exponentiële FRETing en niet-FRETing donoren en bevolking fractie van de geactiveerde EPAC FRET biosensor werd verkregen door het aanbrengen van een dubbele exponentieel profiel vertoont in de tijdreeks.

Voor de data-acquisitie van cAMP (EPAC) vijf gate vertragingen, met een poort breedte van 4.000 ps, ​​werden gekozen met de vertragingstijd ingesteld op 1300 ps, ​​4300 ps (piek intensiteit), 4919 ps, 6656 ps, 8035 ps, 1, 0391 ps en 16.000 ps. De camera integratie tijd voor elke vertraging was 250 ms. Op een bepaald goed, we een FLIM tijdsverloop met beelden die elke 10 s meer dan 10 min verworven. De gegevenspunten verkregen soms 120 s en 130 s werden verwijderd vanwege de toevoeging van forskoline veroorzaakte een kleine verschuiving in het brandpunt van het monster en daarvoore van de fluorescentie-intensiteit die tijdens de FLIM acquisities op deze tijdstippen.

Voor de data-analyse werden de beelden geladen in FLIMfit en gesegmenteerde per cel. De fluorescentie lifetime gegevens werden gemonteerd op een dubbele exponentieel verval model met behulp van een IRF en een vaste t ₀ waarde verkregen uit een referentie-kleurstof (75 uM Cumarine 6). De donor fluorescentie gemiddelde levensduur gemiddelde van alle cellen wordt getoond in figuur 8 (a). Figuur 8 (b) toont de verandering in FRETing fractie populatie tijd berekend door het aanbrengen van dezelfde gegevens FLIM hetzelfde dubbel-exponentiële vervalmodel

waarbij β is de FRETing donor fractie. We gaan uit van een mengsel van FRETing en niet-FRETing elements de tijdstippen voorafgaand aan de toevoeging van forskoline. Om deze levens te verkrijgen, werd een dubbele exponentiële fit toegepast op de eerste drie tijdstippen geven levens van τ ₁ = 3964 ± 21 ps voor de niet-FRETing donor, en τ ₂ = 3022 ± 27 ps voor de FRETing donor. Deze werden vastgesteld voor de volgende pasvorm van het geheel ingesteld op de β waarden op elk tijdstip te verkrijgen gegevens.

Samengevat, hebben we voorbeeld FLIM HCA resultaat van drie proefmonsters gepresenteerd. De eerste was een 96 wells plaat bekleed met Cos cellen die FRET-constructen omvattende een mTqFP donor verbonden zijn aan een Venus FP acceptor of een niet-fluorescerend Amber opbouwen door kortere of langere peptide linker. De verandering in FRET efficiëntie en dus donor levensduur met linkerlengte duidelijk zichtbaar en de standaarddeviatie van de gemiddelde levensduur van elk construct was minder dan 36 ps. Het tweede voorbeeld ASSAy een "scherm" vier potentiële inhibitoren voor myristoylering van de HIV Gag eiwit waarvoor het% remming werd berekend uit het verschil van de gemiddelde donor fluorescentie levensduur van inhibitor concentratie gemeten in Hela cellen die Gag eiwit gelabeld met GVB. Deze uitlezing is gebaseerd op homoFRET, die meestal niet een verandering in de donor leven zou presenteren, maar doet voor het GVB, omdat deze bestaat in meerdere isomeren met verschillende fluorescerende levens. Dit kan handig zijn in termen van spectrale efficiëntie, bijvoorbeeld, voor het multiplexen verschillende FRET uitlezing ²⁵ zijn. Het derde exemplaar assay was een tijdsverloop bewaken levende HEK293T cellen die de cAMP FRET biosensor, EPAC. Dit toonde de verwachte respons na behandeling met forskoline en de toepassing van FLIMfit behulp van een dubbele exponentieel verval model met het aantal gedetecteerde fotonen zijn in verhouding met live-cell imaging - zoals we eerder hebben getoond met de LIBRA FRET Biosensor voor IP3 ^47.

Figuur 1. Schematische voorstelling van wide-field-time gated FLIM met behulp van een gated optische beeldversterker (GOI). Linkerkant, toont een schema van het experimentele systeem. Rechtsboven, schema van excitatiepuls, de positie van de tijd gated beelden en monoexponential fit om gegevens. Rechtsonder, cartoon toont de fluorescentie verval van de twee objecten getoond in het experimentele systeem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Schematische voorstelling van wide-field openFLIM-HCA met behulp van een gated optische beeldversterker (GOI). Zie hoofdtekst voor meer gedetailleerde beschrijving van desysteem componenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Schematische voorstelling van optisch doorgesneden openFLIM-HCA met behulp van een gated optische beeldversterker (GOI) met een Nipkowschijf scanner unit. Zie hoofdtekst voor meer gedetailleerde beschrijving van de systeemonderdelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Schematische voorstelling van beeldgegevens stroom van acquisitie Manager programma server of computer schijf en in FLIMfit Omero voor analyse. De stroom van gegevens begint in de top l eft hoek waar ruwe beeldgegevens wordt verkregen in μ-Manager acquisitie software. De items in de gestippelde rechthoek representeren de fasen van de FLIM gegevensanalyse, terwijl die buiten corresponderen met de data-acquisitie en opslag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Screenshot van FLIMfit gebruikersinterface. Linksboven, de lijst van gezichtsvelden momenteel fluorescentie-intensiteit beeld van de geselecteerde gezichtsveld geladen en. Linksonder, de selectie van montage model en montage omstandigheden. Rechtsboven, fluorescentievervaltijd voor de huidige regio van belang (blauwe cirkels), geschikt om gegevens (rode lijn), IRF (rode stippellijn) met fit residuen hieronder (blauwe lijn).g5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. multi-putjesplaat FLIM van FRET model construeert mTq5V, mTq17V, mTq32V uitgedrukt in COS-cellen. (A) voorbeeld fluorescentie levensduur afbeeldingen FOV in elk putje voor verschillende FRET constructen tot expressie gebracht in COS-cellen zoals beschreven in de tekst. (B) warmte-kaart van de gemiddelde Venus fluorescentie levens gemiddeld over alle cellen in elk putje. (C) intensiteit beeld van mTurquoise Amber bedekt met levenslange kaart (schaal bar 20 pm). (D) intensiteit beeld van mTurquoise Venus (17 aminozuur) bedekt met levenslange kaart (schaal bar 20 pm). (E) gemeten intensiteit verval profiel (blauwe cirkels) van mTq5A construct (negatieve controle) fluorescentie gemiddeld over alle cellen afgebeeld in zowel A1, samen met de fit van de gegevens naar een mono-exponentiële decay (blauw getrokken lijn) en IRF (gestippelde oranje lijn). (F) grafiek van de gemiddelde levensduur van gemiddeld over elke kolom aan de overkant van de multi-putjesplaat, met fout bars tonen de standaarddeviatie van de fluorescentie levensduur tussen de velden van uitzicht. Voor (ad) lifetime waarden worden weergegeven met behulp van een valse kleur schaal met de aangegeven grenzen in picoseconden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7. Exemplar multiwell plaat FLIM scherm van Gag-remmers gebruiken HeLa-cellen die Gag-GVB. (A) Warmte kaart van de gemiddelde donor fluorescentie levensduur per well voor multiwell plaat bekleed met kolom 1 presenterende cellen die met myr-Gag-GVB als Positiv e controle voor remming, kolom 11 cellen met gag-GVB blootgesteld aan alleen vehikel en de gestippelde gekleurde vierkanten waarin de putjes die werden gedoseerd met een van de vier verschillende inhibitoren met concentraties variërend van hoge dosis kolom 2 naar lage dosis kolom 10 . de valse kleuren schaal staat voor de gemiddelde fluorescentie levensduur, variërend van 2.200 tot 3.100 ps ps. (B) percelen fluorescentie levensduur voor elke remmer met fout bars die de standaardafwijking tussen repeat putten. Punten in zwart bij 2 en -4 op de horizontale as zijn de positieve en negatieve controle punten respectievelijk verkregen uit respectievelijk de kolommen 1 en 11. De getrokken lijnen geven een fit aan de dosis responscurve gegevens voor de verschillende inhibitoren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

guur 8 "src =" / files / ftp_upload / 55119 / 55119fig8.jpg "/>
Figuur 8. Exemplar gebruik van FLIM te lezen uit de EPAC FRET biosensor in een time-lapse metingen met behulp van HEK293T cellen. Wijziging (a) gemiddelde fluorescentie levensduur en (b) fractie van FRETing donor als functie van de tijd na toevoeging van forskoline aangegeven door de groene balk. De fout balken geven de standaardfout per cel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

	per Well	STD	ERR			per Well	STD	ERR
mT5A	4008	32	12		Mt17V	3004	26	10
mT5V	2717	35	13		mT32V	3133	30	11

Tabel 1. levensduur Gemiddelde en standaarddeviatie (STD) van de FRET-constructen.

Discussion

We hebben beschreven een geautomatiseerde multiwell plaat microscoop ontworpen voor het gebruik van HCA-time gated FLIM. Dit instrument wordt gecontroleerd met behulp van open source software geschreven in μManager met de mogelijkheid van het opslaan van de gegevens naar een OMERO server en de FLIM data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van FLIMfit ^36, een open source programma geschreven in Matlab en verkrijgbaar als OMERO client ³² De μManager instrument besturingssoftware, openFLIM-HCA, is online ³³ verkrijgbaar met een overzicht van de systeemcomponenten ⁴⁸ tot academische onderzoekers in staat te stellen hun eigen FLIM HCA instrumenten te bouwen.

Om robuuste FLIM gegevens te verwerven, is het noodzakelijk om de Indiase overheid en CCD overname instellingen te optimaliseren en rekening te houden met variaties van t _0. Zoals beschreven in 3.8.2, moet het GOI versterkingsinstelling en CCD-camera integratietijd worden bereikt ~ 75% van de CCD dynamisch bereik. Uzing hogere GOI spanningen en meerdere CCD lijst accumulaties op elk tijdstip poortvertraging verhoogt de signaal-ruisverhouding ⁴⁹ maar dit verhoogt de totale FLIM acquisitietijd (omdat er minder fluorescentiefotonen per frame wordt verkregen voordat de CCD camera verzadigde en zo het aantal lijst voorkomens te verhogen) en dus deze afweging moeten worden vastgesteld voor elk experiment. De kalibratie van de vertraging generator is afhankelijk van de laser herhalingsfrequentie en het is daarom noodzakelijk om ervoor te zorgen dat de juiste kalibratie-bestand voor de herhalingsfrequentie gebruikt in de acquisitie software is geladen. De procedure voor het kalibreren van de vertraging box kan worden gevonden op de openFLIM-HCA wiki ^33.

Als de cellulaire autofluorescentie is laag in vergelijking met het fluorescentiesignaal, gebruiken we het signaal van een putje met alleen kweekmedium in de tijd variërende achtergrond (TVB) verschaffen. Op de achtergrond fluorescentie van de cel kweekmedium te minimaliseren, vermijden wemedium dat fenolrood. Als de cellulaire autofluorescentie significant is, wordt de TVB kan worden gemeten met de ongelabelde cellen. In dit geval moet worden, omdat dit veronderstelt dat de autofluorescentie achtergrond is hetzelfde voor elke pixel in het beeld. Deze veronderstelling is niet geldig indien de autofluorescentie varieert aanzienlijk tussen een cel of indien de excitatiebundel of detectiegevoeligheid niet uniform over het gezichtsveld.

De overname van een IRF beeld met behulp van verstrooid excitatielicht impulsen biedt het tijdelijke IRF profiel dat is convolved met het datamodel in de fitting proces en biedt ook een kaart van de ruimtelijke variatie van de IRF over het gezichtsveld. De IRF kan worden gemeten door beeldvorming een verstrooiing monster zoals een colloïdale suspensie hoewel in ons instrument, middels verstrooid excitatielicht van de Nipkow schijf zorgt voor een zuivere meting van de IRF. Nauwkeurige bepaling van de timing of de IRF is belangrijk omdat fouten in de tijd tussen de excitatie en de tijd-gating belangrijke invloed kunnen het passingsproces, met name bij het aanbrengen van complexe exponentieel verval modellen. De IRF verkregen door verstrooid excitatielicht niet precies wat nodig is voor de montage proces, omdat het is opgenomen in de excitatiegolflengte plaats bij de golflengte fluorescentie-emissie, die de timing kunnen beïnvloeden, hoewel de ruimtelijke variatie van de IRF even hoog is aan beide golflengten. Bovendien kan de verstrooide IRF globaal worden verschoven in tijd ten opzichte van de ware IRF door een uiteenlopende optische weglengte van de verstrooiing object, zoals het geval is voor een IRF verkregen van de Nipkow schijf optisch doorsnede FLIM. Deze correctie, t _0, die de vereiste globale temporele verschuiving die moet worden toegepast op de verkregen verstrooid excitatielicht IRF, wordt berekend uit het referentie monoexponential kleurstof gegevens zoals aangegeven in Protocol stap 4.4. De volgende kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor verschillende golflengten: een 75 uM Cumarine 153 in methanol (τ ~ 4,3 ns ⁵⁰⁾ kan worden gebruikt voor excitatie in het bereik 295-442 nm; een 75 pM Cumarine 6 in ethanol (τ ~ 2,43 ns ³⁷⁾ kan worden gebruikt voor excitatie in het bereik van 430-500 nm; en 75 uM Rhodamine B-oplossing in water (τ ~ 1,7 ns ³⁷⁾ kan worden gebruikt voor excitatie in het bereik 488-575 nm. Wij merken op dat hoewel in FLIMfit een andere IRF gebruiken voor elke pixel van het systeem mogelijk, meestal is het redelijk om te veronderstellen dat de ruimtelijk variërende IRF dezelfde tijdsprofiel voor elke pixel in de afbeelding, maar vormt een reeks ruimtelijk variërende tijd offsets ten opzichte van de globale _t0. We beschrijven dit als het IRF shift kaart, die wordt bepaald uit het verstrooide licht IRF. Samen vormen de IRF profiel, t ₀ en IRF shift kaart zijn gebruikt enzorgen dat elk pixel in de FOV is voorzien van een geschikte IRF. Belangrijk is, kunnen t ₀ langzaam variëren in de tijd, dus het moet worden gemeten voordat FLIM data-acquisitie.

De gebruiker moet beslissen hoe de fluorescentievervaltijd profielen bemonsteren en moet de breedte van de tijd-poorten en hun relatieve vertraging na excitatie ingesteld. In het algemeen is het wenselijk om brede poortbreedten om het gedetecteerde signaal te maximaliseren en typisch gebruik gemaakt poortbreedten ingesteld op 4 ns FLIM cellen gelabeld met fluorescentie eiwitten. Het aantal time-poortvertragingen moet voldoende zijn om de fluorescentie verval profiel (inclusief een poort ingesteld op het signaal gemeten vlak voor de excitatiepuls) Omdat fitting model dat wordt gebruikt in de monsteranalyse zijn. De optimale waarde kan afhangen van de levensduur en de relatieve amplitudes van de verval componenten. Over het algemeen 4 poorten voldoende voor montage monoexponential vervalt terwijl 7 of meer poorten kunnenworden gebruikt voor meer complexe modellen verval.

We merken op dat FLIM kan worden geïmplementeerd met behulp van een reeks van tijd-domein of frequentiedomeinen technieken en geautomatiseerde FLIM HCA van multi-putjesplaat arrays werd voor het eerst in een (niet-snijden) geïmplementeerd wide-field microscoop met frequentiedomein levensduur uitlezing van FRET ^51. De eerste geautomatiseerde optische sectie FLIM multiwell plaatlezer voor HCA het gebruik van wide-field-time-gated imaging ²⁸ werd vervolgens gemeld. Vervolgens werd groothoek (niet snijden) frequentiedomein FLIM HCA toegepast om te screenen op posttranslationele modificaties (tyrosinefosforylering) over een genbibliotheek behulp FRET ⁵² en time-gated FLIM HCA is toegepast om testen van HIV-1 Gag FRET oligomerisatie ⁵³ en sumoylation van FOXM1 ⁵⁴ en Raichu RhoA en Rac1 biosensoren ^33. Het is ook mogelijk om TCSPC gebruiken multi-putjesplaat FLIM ²⁶ maar tot op heden het moeilijk is gebleken t overeenkomenHij doorvoer technieken benutten van wide-field detectie. Een nieuwe benadering die deze oplossing zou kunnen het gebruik van arrays van single photon counting detectors zoals SPAD arrays ^55.

We merken dat uitlezingen van FRET met fluorescerende eiwitten moeten met voorzichtigheid worden behandeld en dat de absolute waarden van parameters verkregen FLIMfit of andere FLIM analysesoftware zal afhangen van de aannames in verband met de fitting model. Wanneer bijvoorbeeld het FRET donor aanzienlijk verval tweede component, kan het gebruik van een bi-exponentieel model om de FRET FLIM gegevens aanpassen gevolg van de bijdrage van de sneller bederf component, die gewoonlijk met de FRETing bevolking verschijnen hoger dan de bedoeling was. Het is daarom wenselijk om donoren te gebruiken met een mono-exponentiële levensduur zoals mTq2FP. Zelfs dan, recente studies hebben aangetoond dat FRET analyse nog kunnen worden beïnvloed door duistere toestanden van acceptor fluorescentie eiwitten of doorheterogeniteit van de oriëntatiefactor κ ² door een verdeling van fluorofoor conformaties met verschillende chromofoor hoeken en afstanden ^56. Toch hebben wij en anderen aangetoond dat fluorescentielevensduur uitlezingen van FRET produceren wel nuttige resultaten die correleren met biochemische metingen en kan worden gebruikt om te screenen op eiwit interacties of dynamiek van biosensoren volgen. Waardoor deze openFLIM HCA platform kan worden toegepast op een breed scala van fluorescentie-levensduur gebaseerde testen met gebruikmaking FRET of cellulaire autofluorescentie ^8, alsmede het verschaffen van kwantitatieve uitlezing van op kleurstof gebaseerde probes ^25.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
microscope frame	Olympus	IX81	http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
optical autofocus	Olympus	ZDC	http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
motorized (x-y-z) microscope stage	Marzhauser	00-24-565-0000	Stage met Corvus controller
excitation laser source	Fianium	SC400-4	Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
gated optical intensifier	Kentech	High Rate Imager (HRI)
delay generators	Kentech	---	Zie snelle delay generator en nauwkeurige delay generator
camera	Hamamatsu	ORCA-ER-II
Nipkow disc scanner unit	Yokogawa	CSU-X1	http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Top hat diffuser	Thorlabs	ED1-S20-MD	Geconstrueerde diffusers
mTq5V	Oxford Genetics	P3850	mTurquoise Venus construct met 5 aminozuur linker
mTq17V	Oxford Genetics	P3847	mTurquoise Venus construct met 17 aminozuur linker
mTq32V	Oxford Genetics	P3848	mTurquoise Venus construct met 32 aminozuur linker
mTq5A	Oxford Genetics	P3849	mTurquoise Amber construct
HEK293T	---	---	gebruikte celtype
phenol red-free HBSS	Sigma Aldrich	55021C-1000ML	beeldvormingsmedia
culture media			DMEM + 10% FBS + 0,5% Antibiotica
DMEM	Sigma Aldrich	D6046-500ML	voor kweekmedia
FBS	Sigma Aldrich	12003C-500ML	voor kweekmedia
xTremeGene9	Sigma Aldrich	6.37E+09	voor transfectie, volg online protocol van La Roche
trypsin/EDTA Solution	Thermo Fischer	R001100	voor het losmaken van cellen, volg online protocol van Thermo Fischer