Hier presenteren we een protocol voor het isoleren gonadale weefsel van larvale zebravis, die onderzoeken zebravis geslachtsdifferentiatie en het onderhoud vergemakkelijkt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dissectie van larvale zebravis Gonadale Tissue
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hoewel wild zebravis hebben een ZZ / ZW sex-bepalingssysteem werden geacclimatiseerd zebravis het geslacht chromosoom verloren. Ze maken gebruik van een polygene geslachtsbepaling systeem, waarbij meerdere genen verspreid over het genoom gezamenlijk het geslacht identiteit exemplaren bepalen. Momenteel is de genen die betrokken zijn bij het reguleren van gonade ontwikkeling en hoe ze werken blijven ongrijpbaar. Normaal gesproken, het isoleren van gonadale weefsel is de eerste stap om het geslacht ontwikkelingsprocessen te onderzoeken. Hier presenteren we een procedure om gonadale weefsel te isoleren van 17 dpf (dagen na de bevruchting) en 25 dpf zebravis larven. De geïsoleerde gonadale weefsel kan vervolgens worden onderzocht door morfologie en genexpressie profilering.
Inleiding
De belangrijkste vrouwelijke geslacht determinant in het wild levende zebravis chromosoom 4 is verloren of gewijzigd in de gedomesticeerde zebravis (dwz gemeenschappelijke lab stammen) 1. In plaats daarvan hebben ze een polygene geslachtsbepaling systeem vergezeld door omgevingsfactoren zoals temperatuur, hypoxie, voedselbeschikbaarheid en bevolkingsdichtheid. De gedetailleerde mechanismen van de zebravis sex ontwikkeling worden niet volledig begrepen. Fundamentele vragen zoals wanneer zebravis geslachtsbepaling optreedt, wat de primaire geslachtsbepaling signaal (s) is / zijn, en welke genen reguleren de eerste stap van gonade omzett....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Zebravis experimenten werden goedgekeurd door de Fudan University Institutional Animal Care en gebruik Comite. Zebravis zijn gerezen en gekweekt volgens standaardwerkwijzen 20.
1. Voorbereidingen
- Cultiveren 17 dpf en 25 dpf larvale zebravis
- Transfer 2 mannelijke en 2 vrouwelijke volwassen zebravissen (gezond, 3 tot 6 maanden oud, laboratorium AB-stam) tot een kruispunt tank in de late namiddag voor de kruising dag. Scheid de mannen en vrouwen met een slagboom. De volgende ochtend, vernieuwt u de tank water en verwijder de barrière voor hen in staat stellen om te paren. Eieren verzamelen in 100 m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dissecties van de geslachtsklieren werden uitgevoerd op AB stam larvale zebravis. Figuur 1 toont typische gonadale weefsel van larvale zebravis 17 dpf en 25 dpf. Eerst wordt de huid en de spieren van een zijde van de buik gesneden om de interne organen bloot. Na verwijdering van de massa van inwendige organen, de zwemblaas met de gonaden blijven in de kofferbak. De gonaden werd aan de ventrale zijde van zwemblaas (pijl in figuur .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De zebravis is uitgegroeid tot een krachtig model en wordt veelvuldig gebruikt in de ontwikkeling en ziekte-gerelateerd onderzoek. De methoden voor het isoleren van organen bij volwassen zebravis, zoals hersenen, hart, gonade, en nieren, zijn goed gedocumenteerd 23, 24, 25. Als gevolg van de kleine omvang en dynamische herinrichting van de gonadale weefsels in het larvale zebravis, isolatie van gonadale weefsel is een uitdagend.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij danken C Zhang voor vissen zorg. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31171074, 31371099 en 31571067 naar GP) en door de Pujiang Talent Project (09PJ1401900 aan GP).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cell culture dish 100 mm | Corning | 430167 | Voor embryo-incubatie |
| 20x EM | Voor een 1 L nodig: voeg 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl en 2,9 g CaCl·2H2O toe; voeg vervolgens 0,41 g KH2PO4, 0,412 g Na2HPO4 anhydrous en 4,9 g MgSO4·7H2O toe. | ||
| 1x EM | Verdun 20x EM in gedistilleerd water | ||
| AGAROSE G-10 | Gene | 121985 | Voor het bereiden van de 2% agar platen |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Voor RNA-isolatie |
| Meter glass | Shen Bo | 250 ml | Voor het bereiden van de 2% agar platen |
| Microwave Oven | Midea | M1-211A | Voor het verwarmen van de AGAR |
| Tweezer DUMONT#5INOX | World Precision Instrument | 500341 | Voor dissectie |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ168 | Voor dissectie |
| Pure water equipment | Millipore | ||
| Ringer’s solution | Voor een 1 L nodig: voeg 6,78 g NaCl, 0,22 g KCl, 0,26 g CaCl2 en 1,19 g Hepes toe; vul vervolgens aan tot 1 L; pas de pH aan tot 7,2. Steriliseer door middel van filtratie en bewaar in een geautoclaveerde doorzichtige polycarbonaat container. | ||
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Metal bath | QiLinbeier | Model GL-150 | |
| Microscope | Leica | M205 FA | Voor fotomicrografie |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micro Scale RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Voor RNA-isolatie van gonad-weefsels |
| Dnase I | Sigma | AMPD1-1KT | Voor DNA-digestie in de RNA-oplossing |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | #K1631 | Voor de synthese van eerste-strengs cDNA |
| Rnase H | Thermo Scientific | #EN0202 | Voor het verteren van de resterende RNA in de cDNA-oplossing. |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | Dit product is een op Taq DNA polymerase gebaseerde 2x mastermix voor real-time PCR en toepasbaar voor intercalatie-assay met SYBR Green I. |
| Spectrophotometer | Ne Drop | OD-2000+ | Meten van de concentratie van het totale RNA |
| Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 Hamburg | genexpressieprofilering |
Referenties
- Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
- Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
- Orban, L., Sreeniva....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
