Dissectie van larvale zebravis Gonadale Tissue

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren gonadale weefsel van larvale zebravis, die onderzoeken zebravis geslachtsdifferentiatie en het onderhoud vergemakkelijkt.

Samenvatting

Hoewel wild zebravis hebben een ZZ / ZW sex-bepalingssysteem werden geacclimatiseerd zebravis het geslacht chromosoom verloren. Ze maken gebruik van een polygene geslachtsbepaling systeem, waarbij meerdere genen verspreid over het genoom gezamenlijk het geslacht identiteit exemplaren bepalen. Momenteel is de genen die betrokken zijn bij het reguleren van gonade ontwikkeling en hoe ze werken blijven ongrijpbaar. Normaal gesproken, het isoleren van gonadale weefsel is de eerste stap om het geslacht ontwikkelingsprocessen te onderzoeken. Hier presenteren we een procedure om gonadale weefsel te isoleren van 17 dpf (dagen na de bevruchting) en 25 dpf zebravis larven. De geïsoleerde gonadale weefsel kan vervolgens worden onderzocht door morfologie en genexpressie profilering.

Inleiding

De belangrijkste vrouwelijke geslacht determinant in het wild levende zebravis chromosoom 4 is verloren of gewijzigd in de gedomesticeerde zebravis (dwz gemeenschappelijke lab stammen) ^1. In plaats daarvan hebben ze een polygene geslachtsbepaling systeem vergezeld door omgevingsfactoren zoals temperatuur, hypoxie, voedselbeschikbaarheid en bevolkingsdichtheid. De gedetailleerde mechanismen van de zebravis sex ontwikkeling worden niet volledig begrepen. Fundamentele vragen zoals wanneer zebravis geslachtsbepaling optreedt, wat de primaire geslachtsbepaling signaal (s) is / zijn, en welke genen reguleren de eerste stap van gonade omzetting nog worden beantwoord ^{2, 3.}

In het proces van zebravis seks ontwikkeling, hebben een aantal belangrijke stadia erkend. In de vroege fase van ontwikkeling, uitgaande van 4 HPF (uur na bevruchting) primordiale kiemcellen (PGC) ondergaan specificatie, migratie en genitale ridgeproliferatie. PGC aantallen en onderlinge interacties tussen kiemcellen en somatische cellen zijn belangrijk voor differentiatie ⁴ gonaden. Op 13 dpf (dagen na de bevruchting), de geslachtsklieren zijn in de ongedifferentieerde fase. Uiterlijk op 17 dpf, de geslachtsklieren zich ontwikkelen tot bi-potentieel eierstokken in zowel de toekomstige vrouwen en mannen. De apoptose-afhankelijke overgang van de eierstok naar de testis beginnen bij 21 tot 25 dpf en kunnen gedurende een aantal weken. Met 35 dpf, heeft het geslacht van de gonaden bepaald en geslacht-specifieke productie van gameten gang in beide eierstokken en testes ^{5, 6, 7.}

Tot op heden hebben diverse kandidaat-genen en mechanismen van geslachtsbepaling voorgesteld. Proteoomanalyse en transcriptoom analyse hebben veel genen die seksueel dimorfe expressie en deze genen zijn gebruikt om geslachtsdifferentiatie studie in zebravis ^{8, 9, 10.} Bijvoorbeeld, in larvale zebravis, de cyp19a1a gen specifiek tot expressie gebracht in de eierstok maar niet in de testis ^{11, 12.} Bovendien wordt AMH gen zwak tot expressie gebracht in de follikel granulosa cellen, maar sterk testis Sertoli cellen ^13. Daarentegen wordt vasa gen continu tot expressie gebracht in de geslachtscellen van zowel vrouwelijke als mannelijke zebravis, waardoor het een geschikte gonade marker ^{14, 15.}

Onderzoeken gonadale genexpressieniveaus is cruciaal voor het moleculaire mechanisme van de geslachtsbepaling en differentiatie begrijpen name de bi-potentiaal eierstok fase ^{3, 9.} De geringe omvang van larvale zebravis en dienovereenkomstig kleine gonaden compliceren de isolatie van gonadal weefsel voor verdere moleculaire analyse. Eerdere studies gebruikt ontleed gehele heupgebied tussen opercula en anale poriën ^16. Dit preparaat hoewel bevattende geslachtsklieren, bestaat uit meerdere weefsels en organen. Als alternatief kunnen transgene dieren met gonaden-specifiek GFP expressie zoals vasa: EGFP werden voor gonaden weefsel isoleren door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) en laser capture microdissectie ^{17, 18.} Maar hun wijdverbreide toepassing is beperkt. We beschrijven hier een eenvoudige procedure om gonaden weefsel te isoleren van larvale zebravis 17 dpf en 25 dpf. We tonen de positie van de geslachtsklieren met betrekking tot andere organen en isoleer de morfologisch intact geslachtsklieren uit de omliggende weefsels. We de gonaden-specifieke genen zoals vasa en cyp19a1a tonen verder zijn sterk tot expressie gebracht in de geïsoleerde geslachtsklieren opzichte van de romp weefsel door kwantitatieve PCR (qPCR) analyse. Het huidige protocol maakt de identificatie, isolatie, zuivering en RNA-amplificatie van specifieke gonadale genen van larvale zebravis, waardoor verdere moleculaire analyse gonadale weefsel ¹⁹ mogelijk.

Protocol

Zebravis experimenten werden goedgekeurd door de Fudan University Institutional Animal Care en gebruik Comite. Zebravis zijn gerezen en gekweekt volgens standaardwerkwijzen ^20.

1. Voorbereidingen

1. Cultiveren 17 dpf en 25 dpf larvale zebravis
   1. Transfer 2 mannelijke en 2 vrouwelijke volwassen zebravissen (gezond, 3 tot 6 maanden oud, laboratorium AB-stam) tot een kruispunt tank in de late namiddag voor de kruising dag. Scheid de mannen en vrouwen met een slagboom. De volgende ochtend, vernieuwt u de tank water en verwijder de barrière voor hen in staat stellen om te paren. Eieren verzamelen in 100 mm petrischalen 1-2 uur na de bevruchting.
   2. Blijf ongeveer 40 embryo's in een 100 mm plaat met 40 mL embryo medium (EM) bij 28,5 ° C gedurende de vroege ontwikkelingsperiode (4 dagen) en ververs de EM tweemaal per dag. Transfer larven 1 L tanks (40 larven 300 ml systeemwater) en voer met levende raderdiertjes (volledige voeding, tweemaal daags) na 5 dpf.Feed voor live pekelgarnalen plaats van rotifer dieet na 10 dpf. Breng de vis in recirculerende watersysteem bij 14 dpf ^21.
   3. Verhogen larvale zebravis in het recirculerende watersysteem tot 17 dpf en 25 dpf. Zorgen de licht / donker cyclus 14/10 h en pH systeemwater ongeveer 7,2. Meet de lichaamslengte van 17 dpf (5,5-6,8 mm) en 25 dpf (8-11 mm) ²² larven.
2. Bereid 2% agar platen voor de dissectie.
   1. Voeg 4 g agar met 200 ml steriel water. Verwarm het mengsel in een magnetron totdat deze transparant wordt.
   2. Koel de agar gedurende ongeveer 15 minuten, giet het in 60 mm petrischalen (ongeveer 1/3 volume van de plaat). Bewaar het gestolde agar platen bij 4 ° C.

2. Protocol 1: Ontleden de Gonadale Tissue van 17 en 25 dpf Larven

1. Voeg crushed ijs in de tank te verdoven 17 dpf larven. Breng deverdoofd larven in een 100 mm petrischaal met gekoelde oplossing van 30 ml koude Ringer's. Houd de vis geïncubeerd in de oplossing van de gekoeld Ringer's gedurende ten minste 15 minuten om volledig te verdoven de larven.
2. Breng de larven naar een voorgekoeld agar plaat met een kleine plastic lepel. Dompel het gehele vislichaam in 10 ml gekoeld Ringer's oplossing en voorzichtig leg het op zijn kant.
3. Doe de volgende handelingen onder het veld visie van 25X stereo microscoop. Klem de vis stam met een pincet om te stabiliseren. Rip de buik lengterichting van de anus naar het hart met een pincet. Verwijder voorzichtig de huid en spieren aan één kant van het lichaam om de interne organen bloot te leggen.
4. Verwijder het gewicht van organen ventraal van de zwemblaas goed. Voorkom beschadiging van de gonade verbonden aan de zwemblaas.
5. Snijd de verbinding tussen de zwemblaas en de voorste lichaam. Trek de gehele zwemblaas en gonade weefsels voorzichtig.
   LET OP: In de meeste gevallenTussen de gonadale weefsel 17 dpf bevat omringende epitheelweefsel en protonephridium. Ze zijn niet gemakkelijk van elkaar gescheiden, maar op 25 dpf kan het gemakkelijk worden gescheiden. De gonaden is eveneens verbonden met de anus. Een kruising met linker en rechter gonade met elkaar verbonden bij de anus duidelijk zichtbaar zijn.
6. Met een pincet de gonaden weefsel zorgvuldig gescheiden van de zwemblaas en het schoonmaken van het omringende vetweefsel.
7. Geeft de geïsoleerde gonadale weefsel overbrengen naar een voorgekoelde 1,5 ml centrifugebuis bevattende oplossing 200 ui Ringer's. Houd de buis op ijs tot alle gonadale weefsels worden gescheiden van de larven.
8. Ontleden de geslachtsklieren 25 dpf larven volgens de beschrijving bij 2,1-2,7.

3. Protocol 2: Analyse genexpressie van de geïsoleerde Gonadale Tissues

1. Extract totaal RNA uit de larvale gonadale weefsels.
   1. Breng de geïsoleerde gonadale weefsels naar een nieuwe RNase-free 1.5 mL buis en verwijder Ringer's. Voeg 100 ul lyseoplossing. Vortex totdat de weefsels zijn volledig vernietigd.
   2. Voer de totale RNA-extractiewerkwijze volgens de instructies van de fabrikant.
   3. Voeg 1/10 volume 10x DNase I-buffer en 1 pi DNase I bij de RNA-oplossing en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
   4. Voeg 1/10 volume DNase inactivatie reagens om het RNA-oplossing. Incubeer gedurende 10 minuten bij 70 ° C. Meet de concentratie van het totale RNA met behulp van een spectrofotometer. Bewaar bij -20 ° C.
2. Uitvoeren van eerste streng cDNA synthese
   1. Gebruik een oligo (dT) primer-linker eerste streng cDNA-synthese uit te voeren volgens het protocol van de fabrikant. Voeg 1-2 ug RNA tot een totaal reactievolume op 20 ui.
   2. Incubeer de reactieoplossing gedurende 90 minuten bij 45 ° C. Beëindig de reactie door verwarmen bij 70 ° C gedurende 5 minuten.
   3. Voeg 1 pl RNase H om het cDNA zodatlutie om de resterende RNA te verwijderen. Meng voorzichtig en centrifugeer gedurende 10 seconden bij 13.000 x g ~. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Voeg 20 ul nuclease vrij water. Bewaar bij -70 ° C.
3. Voer fluorescerende kwantitatieve PCR
   1. Uitvoeren qPCR cycler op een systeem met een fluorescerende kleurstof. Gebruik de volgende PCR-cycling condities: 35 cycli bij 95 ° C gedurende 15 s, Tm-5 ° C gedurende 15 s, 68 ° C gedurende 30 s. Gebruik primersequenties als volgt: AMH (fwd: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; rev: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG), cyp19a1a (fwd: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; rev: CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), nanos3 (fwd: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), vasa (fwd: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) en β-actine (fwd: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rev: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) ^19.

Resultaten

Dissecties van de geslachtsklieren werden uitgevoerd op AB stam larvale zebravis. Figuur 1 toont typische gonadale weefsel van larvale zebravis 17 dpf en 25 dpf. Eerst wordt de huid en de spieren van een zijde van de buik gesneden om de interne organen bloot. Na verwijdering van de massa van inwendige organen, de zwemblaas met de gonaden blijven in de kofferbak. De gonaden werd aan de ventrale zijde van zwemblaas (pijl in figuur ...

Discussie

De zebravis is uitgegroeid tot een krachtig model en wordt veelvuldig gebruikt in de ontwikkeling en ziekte-gerelateerd onderzoek. De methoden voor het isoleren van organen bij volwassen zebravis, zoals hersenen, hart, gonade, en nieren, zijn goed gedocumenteerd ^{23, 24, 25.} Als gevolg van de kleine omvang en dynamische herinrichting van de gonadale weefsels in het larvale zebravis, isolatie van gonadale weefsel is een uitdagend...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cell culture dish 100 mm	Corning	430167	Voor embryo-incubatie
20x EM			Voor een 1 L nodig: voeg 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl en 2,9 g CaCl·2H2O toe; voeg vervolgens 0,41 g KH2PO4, 0,412 g Na2HPO4 anhydrous en 4,9 g MgSO4·7H2O toe.
1x EM			Verdun 20x EM in gedistilleerd water
AGAROSE G-10	Gene	121985	Voor het bereiden van de 2% agar platen
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026	Voor RNA-isolatie
Meter glass	Shen Bo	250 ml	Voor het bereiden van de 2% agar platen
Microwave Oven	Midea	M1-211A	Voor het verwarmen van de AGAR
Tweezer DUMONT#5INOX	World Precision Instrument	500341	Voor dissectie
Stereomicroscope	Motic	SMZ168	Voor dissectie
Pure water equipment	Millipore
Ringer’s solution			Voor een 1 L nodig: voeg 6,78 g NaCl, 0,22 g KCl, 0,26 g CaCl2 en 1,19 g Hepes toe; vul vervolgens aan tot 1 L; pas de pH aan tot 7,2. Steriliseer door middel van filtratie en bewaar in een geautoclaveerde doorzichtige polycarbonaat container.
Transfer pipette	Samco	202, 204
Metal bath	QiLinbeier		Model GL-150
Microscope	Leica	M205 FA	Voor fotomicrografie
Centrifuge	Eppendorf	5417R
Micro Scale RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	Voor RNA-isolatie van gonad-weefsels
Dnase I	Sigma	AMPD1-1KT	Voor DNA-digestie in de RNA-oplossing
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	#K1631	Voor de synthese van eerste-strengs cDNA
Rnase H	Thermo Scientific	#EN0202	Voor het verteren van de resterende RNA in de cDNA-oplossing.
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	TOYOBO	QPK-201	Dit product is een op Taq DNA polymerase gebaseerde 2x mastermix voor real-time PCR en  toepasbaar voor intercalatie-assay met SYBR Green I.
Spectrophotometer	Ne Drop	OD-2000+	Meten van de concentratie van het totale RNA
Mastercycler	Eppendorf	AG 22331 Hamburg	genexpressieprofilering