Synthese van biocompatibel Liquid Crystal elastomeerschuimen als Cell Stellingen voor 3D Ruimtelijke Cell Cultures

Samenvatting

Deze studie geeft een methode voor 3D, bioafbreekbare, schuimachtige cellen steigers basis van biocompatibele zijketen vloeibaar kristal elastomeren (LCEs) te bereiden. Confocale microscopie experimenten tonen aan dat schuimachtige LCEs zorgen voor celhechting, proliferatie en de spontane uitlijning van C2C12s myoblasten.

Samenvatting

Hier presenteren we een stap-voor-stap de bereiding van een 3D, biologisch afbreekbaar, schuim-achtige cel schavot. Deze skeletten werden bereid door verknoping sterblok copolymeren met eenheden cholesterol zijketen zijgroepen waardoor smectische-A (SMA) met vloeibare kristallen elastomeren (LCEs). Foam-achtige steigers, bereid met behulp van metalen sjablonen, voorzien van onderling verbonden microkanalen, waardoor ze geschikt zijn als 3D-celkweek steigers. De gecombineerde eigenschappen van de vaste structuur van het metaalschuim en het elastomeer resulteren in een 3D cel scaffold dat niet alleen een hogere celproliferatie bevordert vergeleken met gebruikelijke poreuze matrijs films, maar ook een beter beheer van massatransport (dwz voedingsstoffen, gassen, afval etc.). De aard van de metalen matrijs zorgt voor eenvoudige manipulatie schuim vormen (dat wil zeggen, rollen of films) en voor de bereiding van steigers met verschillende poriegrootten voor verschillende celstudies behoud van de interconnectieted poreuze aard van de matrijs. Het etsproces tast de chemie van de elastomeren, behoud van hun biologisch verenigbaar en biologisch afbreekbaar. We tonen aan dat deze smectische LCEs, wanneer ze groeien voor een uitgebreide tijdsperioden, schakelt u de studie van klinisch relevante en complexe weefsel constructies terwijl het bevorderen van de groei en proliferatie van cellen.

Inleiding

Er zijn verschillende voorbeelden van biologische en biocompatibele synthetische materialen bestemd voor gebruik in celstudies en weefselregeneratie gericht op celhechting en proliferatie ^{1, 2, 3, 4, 5.} Er zijn enkele voorbeelden van biocompatibele materialen, bekend als vloeibare kristallen elastomeren (LCEs), die kunnen reageren op externe stimuli anisotrope moleculaire bestelling ^{6, 7} zijn. LCEs zijn stimuli-responsieve materialen die de mechanische en elastische eigenschappen van elastomeren combineren met de optische functionaliteit en moleculaire ordening vloeibaar kristal ^{8, 9.} LCEs kunnen vormveranderingen, mechanische vervorming, elastisch gedrag en optische eigenschappen ervaren in reactie op externe stimuli (bijv., warmte, stress, licht, enz.) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Eerdere studies hebben aangetoond dat vloeibare kristallen (LC) de groei en oriëntatie van cellen ^{4, 17} kan voelen. Men kan dan veronderstellen dat LCEs geschikt zijn voor biologisch en medisch relevante toepassingen, zoals mobiele steigers en uitlijning zijn. We hebben eerder beschreven de bereiding van smectische biocompatibel, biologisch afbreekbaar, gegoten gegoten en LCEs dunne film van een "type Zwitserse kaas" poreuze morfologie ^{6, 18.} We bereidden ook nematisch biocompatibel LCEs met bolvormige morfologie als steigers voor celgroei ^{19 , 20. Ons werk was gericht op het afstemmen van de mechanische eigenschappen van de materialen aan die van het weefsel van belang 21 te passen. Ook zijn deze studies richten zich op het begrijpen van elastomeer-cel interacties, evenals cellulaire reactie wanneer de elastomeren, zijn aan externe stimuli.}

De belangrijkste uitdagingen waren gedeeltelijk de porositeit van de LCEs om celhechting en permeatie door de elastomere matrix maat en beter massatransport. De porositeit van deze dunne films ⁶ liet cell permeatie door de massa van de matrix, maar niet alle poriën waren goed op elkaar en had een regelmatiger (homogene) poriegrootte. Vervolgens hebben we gemeld op biocompatibele nematisch LCE elastomeren met bolvormige morfologie. Deze nematische elastomeren toegestaan ​​voor de hechting en proliferatie van cellen, maar de poriegrootte varieerde slechts 10-30 urn, die voorkomen of beperkt het gebruik van dezeelastomeren met een grotere verscheidenheid van cellijnen ^{19, 20.}

Eerder werk van Kung et al. betreffende de vorming van grafeen schuimen onder gebruikmaking van een "sacrificial" metal template toonden dat de verkregen grafeen schuim had een vaste poreuze morfologie bepaald door de gekozen metalen matrijs ^22. Deze methode biedt volledige controle van de porositeit en poriegrootte. Tegelijkertijd de buigzaamheid en de flexibiliteit van de metalen mal maken de vorming van verschillende template vóór schuimbereiding vormen. Andere technieken, zoals het materiaal uitlogen ^23, gas templating ²⁴ of elektro-gesponnen vezels ^{25, 26} bieden ook de mogelijkheid voor de vervaardiging van poreuze materialen, maar ze zijn tijdrovend en, in sommige gevallen, wordt de poriëngrootte beperkt tot slechts enkele micrometers. Schuim-achtige 3D LCEs bereid met metalen templates zorgen voor een hogere celbelasting; een verbeterde proliferatiesnelheid; co-kweken; en, last but not least, beter massatransport beheer (dat wil zeggen, voedingsstoffen, gassen en afval) tot volle ontwikkeling van weefsel ²⁷ te waarborgen. Foam-achtige 3D LCEs lijken ook celuitlijning te verbeteren; Dit is waarschijnlijk ten opzichte van de LC hangers waarnemen celgroei en oriëntatie. De aanwezigheid van LC eenheden binnen het LCE lijkt celuitlijning verbeteren ten opzichte cellocatie in de LCE scaffold. Cellen uitlijnen binnen de stutten LCE, terwijl er geen duidelijke oriëntatie wordt waargenomen wanneer de stutten samen (knooppunten) ²⁷ sluiten.

Algemeen is LCE cel scaffold platform als Celdrager medium biedt mogelijkheden voor het afstemmen het elastomeer morfologie en elastische eigenschappen en specifiek richten van de uitlijning (individueel) celtypen een geordende ruimtelijke arrangementen creëren of cellen vergelijkbaar met levende systemen. Naast het verschaffen van een scaffold staat is tot duurzame en richten langdurige celgroei en proliferatie, LCEs maken ook dynamische experimenten, waarbij celoriëntatie en interacties kunnen worden gewijzigd tijdens de vlucht.

Protocol

OPMERKING: De volgende stappen voor de 3D LCE schuimachtige preparaat met de 3-arm sterren blokcopolymeer weergegeven in figuur 1. Voor kernspinresonantie (NMR) karakterisering worden de spectra geregistreerd in gedeutereerd chloroform _(CDCI3) bij kamertemperatuur op een Bruker DMX 400 MHz instrument en inwendig gerefereerd resterende pieken bij 7,26. Fourier transformatie infrarood (FT-IR) spectra zijn opgenomen met een Bruker Vector 33 FT-IR spectrometer met behulp verzwakte totale reflectiemodus. Voor elke stap van het volgende protocol, is het belangrijk om geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE) dragen.

1. Synthese van α-chloor-ε-caprolacton (monomeer) (volgens de werkwijze van Jérôme et al. ²⁸⁾

1. Voor het begin van de synthese, zuiveren 27 g 3-chloorperbenzoëzuur als volgt:
   1. In 800 ml gedestilleerd water, voeg 1,28 g natriummonobasisch monohydraat en 8,24 g natriumfosfaat dibasisch heptahydraat. Breng de pH op 7,4 (toepassing van natriumhydroxide of zoutzuur) en reserve 30 ml van deze oplossing; Dit is de bufferoplossing.
   2. Met behulp van een scheitrechter, Los 3-chloorperbenzoëzuur in 35 ml diethylether. Was de organische oplossing met 10 ml bufferoplossing (bereid in stap 1.1.1.). Herhaal het wassen drie keer.
   3. Voeg 3 g natriumsulfaat rechtstreeks aan de organische oplossing; dit droogmiddel absorbeert water uit de organische oplossing.
   4. Filtreer de oplossing om het droogmiddel te verwijderen. Concentreer het filtraat onder verminderde druk onder toepassing van een rotatieverdamper bij 850 mbar en 40 ° C.
2. Oplosbaar 18,5 g gezuiverd 3- chloorperbenzoëzuur in 150 ml droog dichloormethaan onder roeren in een ultrasoonbad; Dit proces neemt meestal 20 min. Plaats de oplossing in een scheidtrechter.
3. In een twee-hals, rondbodemkolf,los 13,1 g 2-chloorcyclohexanon in 15 ml droge dichloormethaan met een magneetroerder onder stikstofgas. Blijf roeren.
4. Breng de scheitrechter met 3-chloorperbenzoëzuur oplossing (uit stap 1.2) aan de tweehalskolf in stap 1.3. Spoelen van het systeem met stikstofgas. Past het openen van de scheitrechter zodat de chloorperbenzoëzuur druppelsgewijs valt in de 2-chloorcyclohexanon oplossing (1 druppel per twee seconden) en zet roeren van het mengsel onder stikstof gedurende 96 uur.
5. Koel het reactiemengsel tot -20 ° C gedurende 1 h teneinde de m-chloorbenzoëzuur (m -CBA) bijproduct te precipiteren.
6. Filter de m-chloorbenzoëzuur (m -CBA) en was de resterende oplossing met een verzadigde oplossing van natriumthiosulfaat, natriumbicarbonaat en natriumchloride.
7. Verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk met een rotatieverdamper bij 850 mbar en 40 ° C. Zuiver het lichtgele, viskeuze vloeibare zeeid door destillatie onder verlaagde druk bij 2,3 mm Hg en 96 ° C.
8. Bewaak het succes van het synthesegas met de volgende ^1H NMR pieken. ^1H NMR (400 MHz, _CDCI3, δ [ppm]): 4,75-4,68 (m, 1H, CH CLCO), 4,37-4,26 (m, 1H, _CH2 O), 4,18-4,05 (m, 1H , _CH2 O) en 2,06-1,58 (m, 6H, _-CH2 -) ^{6, 27.}

2. Synthese van α-driearmige ster blokcopolymeer (SBC-αCl) van Ringopeningsactiviteit Copolymerisatie (Sharma et al. ⁶ en Amsden et al. ²⁹⁾

1. Voordat synthese silaniseren 20 ml ampul door deze te vullen met een 2% (v / v) oplossing van 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane in tolueen en roeren gedurende ongeveer 24 uur. Spoel met isopropanol en droog door het in een oven bij 140 ° C gedurende 30 minuten.
2. Voeg 30,64 g gedestilleerd ε-caprolacton, 0,5 g α-chloor-ε-caprolacton en 0,25 ml glycerol aan de ampul. Meng met behulp van een vortex gedurende 1 minuut.
3. Voeg 4,90 g D, L-lactide de ampul en ontlucht met stikstof. Plaats de ampul in een oven bij 120 ° C aan de D, L-lactide smelt; dit proces duurt typisch ongeveer 2 uur. Meng opnieuw met een vortex om ervoor te zorgen dat alle inhoud goed gemengd en voeg 66 gl tin (II) 2-ethylhexanoaat (Sn (Oct) ₂₎ aan de ampul.
   OPMERKING: D, L-lactide zal afkoelen tijdens dit proces en moet opnieuw worden verwarmd in de oven te smelten.
4. Heftig één keer gemengd met de vortex en spoelen met stikstof.
5. Sluit de ampul met een rubberen stop. Plaats een naald verbonden met een zuigbuis (het huisvacuüm is meestal voldoende) door de rubberen stop. Zet de vacuüm en met behulp van een vlam, smelt de lange nek van het glas, draaien langzaam tot de glass op zichzelf inklapt. Wees voorzichtig om niet smelt de rubberen stop. Zodra de ampul dichtgesmolten, plaats het in een zandbad, een oven, of passend verwarmingselement bij 140 ° C gedurende 48 uur.
6. Haal de ampul en laat het afkoelen op kamertemperatuur.
7. Breek de ampul in de afgedichte markering en los de hoogviskeuze vloeistof door toevoeging van 10 ml dichloormethaan. Breng de oplossing in een scheitrechter.
8. Bereid een kolf met 100 ml koude methanol (gekoeld met behulp van een droogijs / acetonbad bij een temperatuur van ongeveer -78 ° C). Bevestig de scheitrechter (stap 2.7) bovenop de kolf. Past het openen van de scheitrechter zodat ongeveer twee druppels per twee seconden (druppelsgewijs) vallen.
9. Verzamel het witte neerslag door filtratie (met een papierfilter) en droog in een vacuümoven van 50 tot 60 ° C.
10. Bewaak het succes van het synthesegas met de volgende ^1H NMR en FT-IR pieken. ^1H NMR (400 MHz, _CDCI3, Δ [ppm]): 5,29-5,03 (m, COCH _CH3), 4,43-4,25 (m, CH Cl), 4,24-4,12 (m, _CH2 O), 4,11-4,03 (t, J = 4,6 Hz, _CH2 O), 3,80-3,68 (m, CH _CH2), 3,09-2,64 (breed, s, OH), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, α- H), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, α- H) en 1,77-1,25 (m, _{CH2, CH3);} FT-IR (1 / λ [cm ^-1]): 2932 (s), 2869 (m), 1741 (s), 961 (s), 866 en 735 (m) ^{6, 27.}
    Opmerking: Om een ​​hydrofiel 3D LCE bereiden, bereidt een lineair blokcopolymeer (LBC) in plaats van een SBC, na ringopening copolymerisatie (ROP) die hierboven is beschreven.
    1. Voeg 0,3 g polyethyleenglycol (PEG), 3,15 g ε-caprolacton, 1,0 g α-chloor-ε-caprolacton en 5,0 g D, L-lactide de gesilaniseerde flesje mix.

3. Synthetische Modificatie van α-Cl-Drie Arm SBC aN ₃ -Three Arm SBC (SBC-aN ₃₎ (Volgens Sharma et al. ⁶⁾

1. In een rondbodemkolf onder stikstof, los 5 g SBC-αCl in 30 ml droge N, N'-dimethylformamide.
2. Voeg 0,22 g natriumazide en laat 's nachts omgezet bij kamertemperatuur.
   Voorzichtig: Natriumazide is giftig; Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE).
3. Verwijder het N, N'-dimethylformamide onder verminderde druk met een rotatieverdamper bij 11 mbar en 40 ° C. Los het mengsel in 30 ml tolueen. Centrifugeer de oplossing driemaal bij 2800 xg gedurende 15 min aan het gevormde zout te verwijderen. Verdamp het tolueen onder verminderde druk met een rotatieverdamper bij 77 mbar en 40 ° C.
4. Bewaak het succes van het azide substitutie met gebruikmaking ^{van 1H-} NMR en FT-IR pieken.
   NOTITIE: ^{1H NMR spectrum kwam overeen met het oorspronkelijke SBC-αCl, met uitzondering van de verschijning van een piek bij 3,90 ppm met betrekking tot het azide voorstelt; FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2928, 2108 (s, azide), 1754 (s), 1450 (s), 960 (m), 865 (s), 733 (s) en 696 (m).}

4. Synthese van Cholesteryl 5-Hexynoate (LC rest) (Volgens Sharma et al. ⁶ en Donaldson et al. ³⁰⁾

1. In een rondbodemkolf, meng 3 g 5-hexynzuur en 130 ml dichloormethaan. Koel tot 0 ° C met een ijsbad.
2. In een rondbodemkolf, meng 8,28 g N, N'-dicyclohexylcarbodiimide, 10,3 g cholesterol en 0,2 g 4-dimethylaminopyridine.
3. Breng de 5-hexynzuur oplossing druppelsgewijs aan de kolf die het mengsel cholesterol en handhaven van de uiteindelijke mengsel bij 0 ° C gedurende 1 uur.
4. Laat het mengsel overnacht opwarmen tot kamertemperatuur.
5. Verwijder het verkregen neerslag dicyclohexylureum door filtratie met een cijfer 415 papieren filter en gooi dit weg.
6. Concentreer het filtraat onder verminderde druk met een rotatieverdamper bij 850 mbar en 40 ° C. Los het residu verzameld in 150 ml hexaan.
7. Damp het oplosmiddel onder verlaagde druk met een rotatieverdamper bij 335 mbar en 40 ° C. Voeg 350 ml ethanol aan het olieachtige residu aan het eindproduct te verzamelen. Was de gebroken witte vaste stof gevormd met ethanol en droog het vaste product onder vacuüm bij 50 ° C.
8. Controleer de synthese met de volgende ^1H NMR en FT-IR pieken. ^1H NMR (400 MHz, _CDCI3, δ [ppm]): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, CH = C), 4,70-4,58 (m, 1H, CH OCO), 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, _CH2 CO), 2,34 (m, 2H, _CH2-CH =), 2,31 (m, 2H, _{CH2 CH2-COO),} 2,28 (s, 1H, HC = C), 2,27 (d, J = 2,3 Hz, 2H, ≡CC _H2), 2,07-1,06 (m, 2H, _CH2, CH), 0,94 (s, 3H, _CH3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, _CH3 CH) en 0,88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, _CH3-CH), 0,67 (s, 3H, _CH3). FT-IR (1 / λ [cm ^-1]): 2,830-2,990 (brede en sterke piek), 2104 (m), 1695 (s), 1428 (m), 1135 (m), 999 (s), 798 (s) en 667 (s).

5. Synthetische Modificatie van _α-N3 -Three Arm SBC tot a-Cholesteryl-Three Arm SBC (SBC-αCLC) via een azide-Acetyleenalkoholen Huisgen cyclo-additiereactie ( "klik" Reaction) Het verkrijgen SBC-Chol (volgens Sharma et al. ⁶⁾

1. In een rondbodemkolf, los 1 molequivalent SBC-aN ₃ (1,5 g) in 100 ml vers gedestilleerd tetrahydrofuran (THF). Voeg 1,2 mol equivalent cholesteryl 5-hexynoate (1,94 g), 0,1 molequivalent koper (I) jodide (0,06 g) en 0,1 molair equivalent triethylamine (0,03 g). Roer het mengsel overnacht bij 35 ° C onder stikstof.
2. Damp het oplosmiddel onder verlaagde druk met een rotatieverdamper bij 357 mbar en 40 ° C.
3. Los het resterende mengsel in 80 ml dichloormethaan en centrifugeer 5 min bij 2800 xg bij kamertemperatuur om ongereageerde materialen en bijproducten te verwijderen.
4. Controleer de synthese met de volgende ^1H NMR en FT-IR pieken. ^1H NMR (400 MHz, _CDCI3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-triazool), 5,43-5,34 (m, C = CH cholesterol), 5,10-5,06 (m, COCHCH _3), 4,68 -4,55 (m, O-CH cholesterol), 4,24-4,19 (m, _CH2 O), 4,18-4,13 (t, J = 5,0 Hz, _CH2 O), 4,11-4,05 (t, J = 4,4 Hz, CH ₂ O), 2,47-2,41 (t, J = 4,9 Hz, _COCH2), 2,31-2,25 (m, _COCH2), 2,07-1,02 (m, _CH2 , _CH3), 1,05-1,03 (s, _{CH2, CH3),} 0,96-0,92 (d, J = 3,3 Hz, _{CH2, CH3),} 0,91-0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, _CH3) en 0,71-0,68 (s, _CH3). FT-IR (1 / λ [cm ^-1]): 3260 (s), 2920 (s), 1710 (s), 1460 (s), 1370 (s), 1240 (m), 1190 (s), 733 (s) en 668 (s).

6. Synthese van 2,2-bis (1-caprolacton-4-yl) propaan (verknopingsmiddel, BCP) (Volgens Gao et al. ²⁷ en Albertsson et al. ³¹⁾

1. In een rondbodemkolf, maak een oplossing met 10,8 g 2-bis (4-hydroxycyclohexyl) propaan en 52 ml azijnzuur.
2. Bereid een oplossing van 11 g chroomtrioxide in 50 ml azijnzuur en 8 ml gedestilleerd water. Voeg deze oplossing druppelsgewijs aan de oplossing bereid in stap 6.1 onder handhaving van de temperatuur van het mengsel tussen 17 en 20 ° C (bijvoorbeeld in eenwaterbad); Dit druppelsgewijs duurt 2 uur. Wanneer het proces is voltooid, laat de oplossing roeren gedurende ongeveer 30 minuten.
3. Voeg 50 ml 2-propanol. Roer de oplossing overnacht bij kamertemperatuur.
4. Concentreer de donkerpaarse oplossing onder verlaagde druk met een rotatieverdamper bij 137 mbar en 40 ° C. Voeg 300 mL gedestilleerd water neer te slaan; de neerslag moet licht paars.
5. Filtreren van het ruwe product met behulp van een cijfer 415 papieren filter. Spoel de vaste stof met -250 ml gedestilleerd water of totdat de vaste stof wordt wit.
6. Los de vaste stof in 15 ml benzeen bij 40 ° C en laat het herkristalliseren bij 25 ° C.
7. Voeg 8,34 g droog diketon, opgelost in droog dichloormethaan en een oplossing van 6,0 g 3-chloorperbenzoëzuur in 75 ml dichloormethaan aan de kolf.
8. Terugvloeitemperatuur van de oplossing bij 40 ° C gedurende 24 uur.
9. Koel het reactiemengsel tot -20 ° C gedurende 10 minuten om de m precipiteren chloorbenzoëzuur bijproduct.
10. Verwijder m-chloorbenzoëzuur afgefiltreerd (met een papierfilter) en concentreer de oplossing onder verminderde druk.
11. Was het ruwe product viscose met 200 ml 2-heptanon en droog het precipitaat onder vacuüm bij 50 ° C overnacht.
12. Controleer de synthese met de volgende ^1H NMR en FT-IR pieken. ^1H NMR (400 MHz, _CDCI3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, _CH2 OC = O), 4,21-4,15 (t, 2H, J = 11,3 Hz, _CH2 OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, _CH2 COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, CH ₂ COO), 2,04-1,93 (m, 4H, _{-CH2 CH2} OC = O), 1,70-1,56 (m, 4 H, _{-CH2 CH2} COO), 1,48-1,38 (m, 2H, - C H C _{(CH3) 2),} 0,84 (s, 6H, _CH3 C-).

7. Creatie van 3D poreuze elastomeer steiger met behulp van hexamethyleendiisocyanaat (HDI) of 2,2-bis (1-caprolacton-4-yl) propaan (BCP) ²⁷ als verknopingsmiddel (Volgens Gao et al. ²⁷⁾

1. Bereid driearmige elastomeer onder toepassing van 0,75 g SBC-αCLC door 0,25 ml HDI (of 0,45 ml BCP) en 0,24 ml gedestilleerd ε-caprolacton monomeren. Voeg 60 ul van Sn (Oct) _2. Bij gebruik BCP plaats van HDI, gemengd SBC-αCLC en BCP behulp van een vortex en plaats ze in een oven bij 140 ° C totdat het BCP volledig smelt en oplost (deze stap kan tot 2 uur). Zodra de BCP opgelost is, te verwijderen uit de oven en de Sn (Oct) ₂ en vortex.
2. Bereid een "sacrificial" metaalschuim matrijs door het snijden van een 1 x 4 cm metaaldeel. Rollen van een van de korte uiteinden zodat de uiteindelijke rol is ongeveer 1 x 1 cm metaaldeel (zie figuur 4).
3. Plaats het metaalschuim in een glazen flesje of aluminiumfolie pakket en giet het mengsel bereid in stap 7.1 doorgronden van het schuim gedurende 2 min. Het overtollige mengsel met een Pasteur pipet. Laat het in een oven gedurende de nacht bij 80 ° C.
4. Schil van de aluminiumfolie of het glas te breken. Met behulp van een scheermesje scheren elastomeer rond het metaalschuim het nikkelmetaal bloot.
5. Bereid 1 M ijzer (III) chloride _(FeCl3) opgelost in 100 ml water. Plaats het schuim in een kolf en voeg 70 ml _{FeCl3-oplossing.} Roer gedurende drie dagen bij kamertemperatuur en verander de _FeCl3 oplossing elke dag. Vóór elke verandering, roer het schuim met geïoniseerd water gedurende 0,5 uur.
   OPMERKING: Het etsproces wordt typisch voltooid na drie dagen. Opdat het etsen is voltooid, voert tactiele drukproeven totdat het schuimen zacht aanvoelen. Schuim weerstand tegen tactiele drukproeven de aanwezigheid van een resterende metalen matrijs.
6. Spoel de elastomer schuim met ethanol en in een vacuümoven overnacht bij 40 ° C.
7. Karakteriseren materialen behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM), differentiële scanning calorimetrie (DSC), drukproeven mechanische en thermische gravimetrische analyse (TGA) ^27.
   LET OP: Voor het bereiden van een hydrofiele 3D LCE, vervangt u de SBC met LBC (zorg ervoor dat de LBC bevat ook een LC-eenheid) volgens de in stap 7.5 beschreven stappen.

8. Het zaaien van Elastomer Steiger met SH-SY5Y neuroblastomacellen en cultuur met steriele technieken

1. Steriliseer de elastomeer door tweemaal te wassen met 1 ml 70% ethanol. Uitvoeren UV-bestraling gedurende 10 minuten en wassen met 1 ml 70% ethanol. Spoel tweemaal met 1 ml steriel water en 1 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Plaats de elastomeren in 24-putjes.
2. Bereid celgroei medium voor SH-SY5Y bevattende 90% Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (Pen-Strep).
3. Na het tellen van de cellen onder toepassing van een hematocytometer Bereid 1,5 x 10 ⁵ SH-SY5Y cellen gesuspendeerd in 100 pi groeimedium (kiemoplossing). Voeg de oplossing op de top van de elastomeren, en zorg ervoor dat een druppel te vormen.
4. Incubeer de geënte elastomeren bij 37 ° C en 5% _CO2 gedurende 2 uur celadhesie bevorderen. Voeg 0,5 ml groeimedium. Incubeer opnieuw bij 37 ° C met 5% _CO2.
5. Verander het medium om de andere dag na het wassen met 1 ml PBS.

9. Microscopische Beeldvorming van elastomeer Construct

1. Fixeer de cellen gekweekt op elastomeren met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 15 min. Spoelen met 3 ml PBS driemaal gedurende 5 minuten elk en leg het elastomeer met de gefixeerde cellen in een kweekschaal met een aangrenzende dekglaasje.
   Let op: PFA is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermende kleding (PPE).
2. Stain het vaste monsters met 0,1% 4' , 6-diamino-2-fenylindool (DAPI) in 500 pi PBS gedurende 10 minuten en spoel tweemaal met 1 ml PBS gedurende 5 min.
3. Onmiddellijk beeld elastomeren via confocale microscopie met DAPI fluorescentie verkrijgen afbeeldingsstapels dat het monster omvatten.
   LET OP: Hier werden image stacks verkregen met behulp van een 20X objectief en een 60X objectief.
4. Analyseer de afbeelding optische confocale stapels behulp ImageJ ^32.

Resultaten

Dit rapport toont de bereidingswerkwijze van een poreuze 3D LCE als matrix voor celkweek onder toepassing van een nikkelmetaal template. De verkregen 3D LCE toont een complex onderling kanalennetwerk voor probleemloos celinfiltratie, alsmede geschikter massatransport ^27. Er werd gevonden dat cellen volledig kunnen doordringen in de onderling verbonden kanalen netwerken kunnen ook uitlijnen binnen LCE. Hier een metalen metaalschuim (99% Ni, dichtheid 860 g / ^c...

Discussie

Vloeibaar kristallijne elastomeren zijn onlangs bestudeerd als biocompatibel cel steigers vanwege hun stimuli responsiviteit. Zij hebben bewezen dat ideaal platforms zoals mobiele steigers zijn. Echter, een belangrijke factor in gedachten te houden bij de voorbereiding van en het ontwerpen van een nieuwe LCE schavot is porositeit. De opname van uitloogbare vaste stoffen of gassen ²³ niet altijd tot homogene poreusheid of volledig onderling verbonden poriën. Het gebruik van een metalen mal die geë...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silaniseringsmiddel
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propaan	TCI	B0928	Reagens
2-chlorohexanon	Alfa Aesar	A18613	Reagens
2-heptanoon	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoëzuur, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagens
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagens
4',6-diamidino-2-fenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Kernkleuring
5-hexynzuur	Alfa Aesar	B25132-06	Reagens
Azijnzuur	VWR	36289	Solvent
Aceton	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagens
Benzeen	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolacton	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagens
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagens
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagens
Koper(I)jodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagens
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagens
Dichloormethaan	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Di-ethylether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s aangepast Eagle-medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Celmedia
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixatief
Fetaal bovien serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Mediacomponent
Filterpapier, graad 415, kwalitatief, crêpe	VWR	28320	Filtratie
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Centraal knooppunt (3-arm)
Hexamethyleendi-isocyanaat, HDI	Sigma Aldrich	52649	Vernettingsmiddel
IJzer(III)chloride	Alfa Aesar	12357	Etsmiddel
Isopropylalcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodi-imide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nikkel metaalsjabloon	American Elements	Ni-860	Schuimsjabloon
Neuroblastoomcellen (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cellijn
Penicilline streptomycine	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotica
Polyethyleenglycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagens
Natriumazid	VWR	97064-646	Reagens
Natriumbicarbonaat	AMRESCO	865	Droogzout
Natriumchloride	BDH	BDH9286	Droogzout
Natriumfosfaat dibasisch heptahydraat	Fisher Scientific	S-374	Droogzout
Natriumfosfaat monobasisch monohydraat	Sigma Aldrich	S9638	Droogzout
Natriumsulfaat	Sigma Aldrich	239313	Droogzout
Tetrahydrofuraan	Alfa Aesar	41819	Solvent
Natriumthiosulfaat	AMRESCO	393	Droogzout
Tin(II) 2-ethylhexanoaat	Aldrich	S3252	Reagens
Tolueen	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagens
Trypsine	HyClone	SH30042.01	Celdetachment
Olympus FV1000