Een procedure voor het maken van een gezichtspreparatie van de muizencarotisarterie en aorta wordt beschreven. Dergelijke preparaten, wanneer immunofluorescent gekleurd met specifieke antilichamen, ons in staat stellen om lokalisatie van eiwitten en identificatie van celtypen in de gehele vaatwand door confocale microscopie te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Afdelingen van paraffine ingebedde weefsels worden routinematig gebruikt voor het bestuderen van weefselhistologie en histopathologie. Het is echter moeilijk om te bepalen wat de driedimensionale weefselmorfologie uit dergelijke secties is. Daarnaast kunnen de onderzochte secties van de weefsels niet het gebied bevatten in het weefsel dat nodig is voor het lopende onderzoek. Deze laatste beperking belemmert histopathologische studies van bloedvaten, aangezien vasculaire laesies op een gefocuste manier ontwikkelen. Dit vereist een methode waarmee we een breed gebied van de bloedvatmuur kunnen onderzoeken, van het oppervlak naar de diepe gebieden. Een volledige voorbereiding van de bloedvaten voldoet aan deze eis. In dit artikel zullen we aantonen hoe u een gezichtspreparatie van de muis aorta en halsslagader maakt en immunofluorescente ze voor confocale microscopie en andere soorten fluorescentie gebaseerde beeldvorming kunt vinken.
Inleiding
Voor histopathologische studies door middel van lichtmicroscopie worden drie-dimensionale stukjes biologische weefsels routinematig verwerkt voor paraffine-inbedding, gevolgd door doorsneden en kleuring. Een weefselmonster die paraffine-ingebed is, kan in alle drie de afmetingen meerdere millimeter zijn. Voor de lichtmicroscopie moet het eerst eerst worden gesneden zodat het licht door kan gaan en vervolgens wordt gekleurd zodat het dunne gedeelte voldoende contrast biedt voor afbeelden. Omdat gesneden specimens meestal 5-10 μm dik zijn, ziet men slechts een kleine deel van het hele monster in twee dimensies tegelijk. Het is mogelijk om opeenvolgende secties te verza....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De protocollen voor de muizen gedeeltelijke halsslagaderatie en isolatie van de muis aorta en halsslagader voor gezicht immunostaining worden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IBT 2014-9231).
1. Linker Partieel Carotide Arterie Ligging
- Bereid de chirurgische ruimte door een 12 inch x 14 inch verwarmingsblok op de tafel te plaatsen en bedek het paneel en de tafelblad met een grote schone chirurgische drape. Stel de arm van de boomstand aan, zodat het stereomicroscoop zichtbaar is in het midden van het verwarmingspaneel.
- Zet het verwarmingspaneel op de tafel aan en stel de 3-inste....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een typisch en gezicht immunofluorescentiebeeld van het endothelium is getoond in figuur 3 . Dit beeld toont een enkele optische sectie van een aorta van de muis die dichtbij de opening van een intercostale slagader (het grote donkere ei-vormige gebied) wordt geplaatst. De aorta was dubbelkleurig met anti-VE-cadherine (groen) en anti-VCAM-1 (vasculaire celadhesiemolecule-1) (rood). Elke endotheliale cel wordt geschetst met een groene lineaire kleuring bij de linker hecht.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Bij het hanteren van muisbloedvaten is het belangrijk om te onthouden dat het endothelium breekbaar is en dat een overmatige mechanische kracht endothelcellen zal beschadigen. Bijvoorbeeld, de endotheelcellen breken of losmaken van de vaatwand als het vat te krachtig wordt geperfueerd, wat gemakkelijk kan gebeuren wanneer de vaatwasser wordt geperfuseerd met een handbediende spuit.
Om constante perfusiedruk te verkrijgen, gebruiken we een zwaartekracht perfusie systeem met een druk van 120 c.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
De onderzoeksactiviteiten van de auteurs worden ondersteund door subsidies van het Nationaal Instituut voor Gezondheid aan Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G | |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 | |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch | Cardinal Health | 4024 | |
| Blunt retractors, 2.5 mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 | |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Curity gauze sponges 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| Electric heating pad, 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Micro cover glass 22 mm x 50 mm | VWR | 48393059 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 | |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| Petri dishes 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 | |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 | |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 | |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
Referenties
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
