Het menselijke netvlies is samengesteld uit functioneel en moleculair verschillende regio's, met inbegrip van de fovea, macula en perifere retina. Hier beschrijven we een methode met behulp van punch biopsieën en handmatig verwijderen van de lagen weefsel van een menselijk oog te ontleden en deze verschillende retinale regio's voor downstream Proteoom analyse te verzamelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dissectie van menselijke netvlies en RPE-vaatvlies voor proteoom-analyse
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het menselijke netvlies is samengesteld uit de sensorische neuroretina en de onderliggende retinale pigment epitheel (RPE), die is stevig complexvorm aan de vasculaire choroideus laag. Verschillende regio's van het netvlies zijn anatomisch en moleculair verschillend, vergemakkelijking van unieke functies en demonstreren van differentiële gevoeligheid voor ziekte. Proteoom analyse van elk van deze regio's en lagen kan belangrijke inzicht verwerven in de moleculaire proces van vele ziekten, waaronder Age-Related macula degeneratie (LMD), diabetes mellitus en glaucoom. Scheiding van retinale regio's en lagen is echter noodzakelijk voordat kwantitatieve Proteoom-analyse kan worden bereikt. Hier beschrijven we een methode voor dissectie en verzameling van de foveal, macula en perifere Retina regio's en onderliggende RPE-vaatvlies complex, waarbij regionale punch biopsieën en handmatig verwijderen van de lagen weefsel van een menselijk oog. Eendimensionale SDS-pagina evenals downstream Proteoom analyse, zoals vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS), kan worden gebruikt voor identificatie van eiwitten in elke ontleed retinale laag, moleculaire biomarkers voor retinale ziekte onthullen.
Inleiding
Het netvlies, vaatvlies en RPE zijn complexe weefsels waaruit belangrijke regionale verschillen in eiwit expressie, fysiologische functie en pathologische gevoeligheden1,2. Bijvoorbeeld, tonen ziekten zoals Age-Related macula degeneratie (LMD), retinitis pigmentosa en centrale sereuze retinopathie elke karakteristiek localisatie binnen de fovea, macula of netvlies periferie1,3, 4,6. Hier presenteren we een methode aan te tonen hoe verschillende retinal regio's kunnen onafhankelijk worden bemonsterd. Het algemene doel van deze methode is een betrouwbare gids om te verzamelen van weefselmonsters uit de foveal, macula en perifere gebieden van de menselijke netvlies en RPE-vaatvlies voor proteoom-analyse. De reden voor de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek is dat door middel van Proteoom analyse van deze specifieke retinale gebieden, belangrijke moleculaire inzichten kunnen worden verkregen tot de functies van het fysiologische en pathofysiologische van deze regio's.
Deze aanpak belooft te onthullen de proteomic-basis voor relatieve regionale ziekte gevoeligheden, en de identificatie van nieuwe specifieke therapeutische doelen te vergemakkelijken. Inderdaad, proteomic onderzoeken van het glasvocht en zijn interacties met het netvlies hebben verstrekt belangrijke inzichten in de moleculaire samenstelling en functie van gezonde en zieke weefsel5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. echter, duidelijke vergelijkende proteomic analyses van verschillende retinale gebieden ontbreken. De techniek helpt ter ondersteuning van deze broodnodige studies, bieden voordelen ten opzichte van andere methoden door het tonen van een betrouwbare en reproduceerbare weefsel collectie aanpak. Meer nog, de aanpak is heel toegankelijk, profiteren van standaardformaat en gemakkelijk beschikbaar weefsel punch biopsie tools. Onze techniek benadrukt de juiste inzameling en opslag van weefsels voor proteomic verwerking, waardoor belangrijke overwegingen voor eiwitstabiliteit en afbraak. Dus, deze methode is meest geschikt voor onderzoekers downstream moleculaire analyse van proteomic factoren te overwegen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
deze studie werd goedgekeurd door de Universiteit van Iowa ' s institutionele Review Board en houdt zich aan de beginselen die zijn uiteengezet in de verklaring van Helsinki.
1. Foveal en Macula Biopsy Punch
- Open en vlinder het menselijk oog, zodanig dat het bestaat uit 4 aparte flappen van weefsel, zoals beschreven in een eerdere publicatie. 5
- beginnen met een butterflied menselijk oog geplaatst in een petrischaal, een 4-mm punch biopsie tool centreren over de fovea druk naar beneden en zachtjes rollen totdat een incisie rond de fovea gemaakt.
- Genereren vervolgens een incisie rond de macula door centreren en te drukken op down een 8-mm huid punch biopsie instrument binnen de arcades van de macula, zachte druk uit te oefenen en rollen. Dit zal een tweede, de buitenste ring van weefsel rondom de eerste produceren.
2. Perifere Retina Biopsy Punch
- Gebruik de punch 4-mm huid biopsie hulpmiddel om een serie van stoten in de perifere retina, net buiten de arcade. Hier, maken twee stoten voor elk kwadrant klep.
Opmerking: Nadat alle de stoten zijn gemaakt, het oog twee concentrische stoten in het midden hebben zal, die de fovea en macula, vertegenwoordigt en twee aan de basis van elke klep-totaal stoten 8 stoten in de perifere retina.
3. Fovea en Macula biopsie collectie
- zoals het weefsel nu klaar voor inzamelen is, verzamelen van alle weefsel biopsieën in aparte microfuge buizen en bevriezen met behulp van vloeibare stikstof voor downstream processing. Alle monsters bij-80 ° C bewaren tot gebruik.
- Gebruiken een gebogen 0,12 Colibri pincet te grijpen van de randen van het doorschijnend weefsel van de retinale fovea. Verzamelen, verheffen en de foveal weefsels scheiden van de onderliggende RPE-vaatvlies. De verlostang Colibri 0,12
- ook gebruiken om te begrijpen van de buitenste ring van het doorschijnende macula weefsel. Als het weefsel is nog steeds gekoppeld aan onderliggende of aangrenzende weefsel, kunt u een paar van schaar Westcott zorgvuldig trim de rand, net het netvlies onderdeel vastleggen en ontleden weg een weefsel van de oogzenuw opgenomen in de punch.
4. Perifere Retina collectie
- gebruiken de gebogen 0,12 Colibri pincet voorzichtig de perifere retinale weefsel schijven te scheiden van de onderliggende RPE-vaatvlies en plaats binnen de afzonderlijke microfuge buizen.
- In het geval van residuele glasvocht gel, gebruikt u de verlostang om te heffen en te scheiden van de gel weg zoveel mogelijk vóór de verzameling van het netvlies weefsel. Zodra het netvlies is verwijderd, de gepigmenteerde RPE-vaatvlies blijft onder.
5. Foveal en Macula RPE-vaatvlies collectie
- Gebruik de 0.12 Colibri pincet te begrijpen van de randen van het donkere RPE-vaatvlies weefsel dat onder het gebied van de verwijderde fovea ligt. Zorgvuldig scheiden dit weefsel van de sclera en verzamel.
- Met behulp van de verlostang dezelfde, begrijpen de randen van de buitenste ring van donkere RPE-vaatvlies weefsel ten grondslag liggen aan het verwijderde macula gebied. Zorgvuldig dit weefsel van de sclera door grijpen de randen op verschillende punten rond de ring en licht trekken te scheiden. Uiteindelijk, de ring van RPE-vaatvlies weefsel zal worden verdreven en mogen worden verzameld.
Opmerking: Secundaire pincet in de tegengestelde hand kunnen nuttig zijn in het manipuleren van de RPE-vaatvlies weefsel tijdens de verwijdering. Zoals het netvlies weefsel, Wescott schaar kan worden gebruikt om te helpen bij het verwijderen van alle weefsel dat was niet volledig ingesneden met het gereedschap stempel.
6. Perifere Retina RPE-vaatvlies collectie
- gebruik van de verlostang Colibri 0,12 schil weg de RPE-vaatvlies in de 8 gebieden van de perifere punch.
- Zoals eerder, plaats het weefsel RPE-vaatvlies in microfuge buizen en bevriezen met behulp van vloeibare stikstof voor downstream processing. Houden van alle monsters bij-80 ° C tot benutting.
7. Scissor dissectie
Opmerking: als het blad van de biopsie punch saai is of de punch biopsie tool is niet hard genoeg geduwd, kan niet er een clean-cut rondom het weefsel.
- In deze gevallen, trek het weefsel weg zoveel mogelijk, en gebruik vervolgens Westcott schaar te trimmen en aparte.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Retina en RPE-vaatvlies weefsel kunnen op verschillende manieren aan een afzonderlijk onderzoek worden verwerkt. Na het verzamelen bezitten de onderzoeker monsters van de retina en RPE-vaatvlies weefsel uit de foveal regio, buitenste macula en perifere retina (Figuur 1). In het bijzonder zal de foveal regio punch omvatten de fovea, de parafovea en een kleine hoeveelheid van de aangrenzende perifovea. De macula punch omvat de rest van de perifoveal-regio evena...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Na weefsel zijn collectie, sample handling en behandeling cruciaal overwegingen14. Behoud in vloeibare stikstof heeft de voorkeur boven chemische fixatie, zoals de laatste kan resulteren in schade aan eiwitstructuur, die stroomafwaarts analyse kan scheeftrekken. Daarnaast is de vloeibare stikstof behoud aangenamer zijn wanneer u de methoden die geen bevriezing van monsters. Met name Ferrer et al. toonde significante verschillen in eiwitniveaus tussen hersenen monsters bewaard bij 4 ° C of...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
VBM is ondersteund door subsidies van de NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 en R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103 en onderzoek te voorkomen blindheid (RPB), New York, NY. MT en GV worden ondersteund door de NIH T32GM007337 verlenen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4-mm huidpunchbiopsie-instrument | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm huidpunchbiopsie-instrument | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri pincet | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott schaar | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge buizen | Eppendorf | #022364111 | 1,5 mL |
| Vloeibare stikstof | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
Referenties
- Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
- Zhang, P., et al. Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid. Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).
- Funke, S., et al. Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples. Sci Rep. 6, 29759(2016).
- Decanini, A., et al. Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes. Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex. JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. J Vis Exp. (50), (2011).
- Skeie, J. M., et al. Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques. Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex. PLoS One. 8 (11), e82140(2013).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M. Translational vitreous proteomics. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).
- Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. Proteomic insight into the molecular function of the vitreous. PLoS One. 10 (5), e0127567(2015).
- Velez, G., et al. Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease. JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).
- Velez, G., et al. Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment. Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Ferrer, I., et al. Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).
- Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization. J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).
- Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics. J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).
- Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains. PLoS One. 6 (6), e21405(2011).
- Nagy, C., et al. Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain. J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).
- Mukherjee, S., et al. Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection. Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
