Methodenartikel

Geheel-cel stromingen geïnduceerd door Puff toepassing van GABA in de hersenen segmenten

DOI:

10.3791/56387

⸱

12 oktober 2017

 ,  ,  , 
1School of Psychology, South China Normal University, 2School of Life Sciences, South China Normal University, 3Brain Science Institute, South China Normal University, 4Center for Studies of Psychological Application, South China Normal University, 5Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven de bladerdeeg-techniek, waarbij farmacologische reagentia tijdens geheel-cel patch-clamp opname kunnen worden beheerd, en benadrukken verschillende aspecten van de functies die cruciaal voor het succes ervan zijn.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farmacologische beheer wordt vaak gebruikt bij het uitvoeren van geheel-cel patch-clamp opnemen in plakjes van de hersenen. Een van de beste methoden van drug aanvraag tijdens elektrofysiologische opname is de techniek van bladerdeeg, die kan worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van farmacologische reagentia op neuronale activiteiten in plakjes van de hersenen. Het grootste voordeel van bladerdeeg toepassing is dat de concentratie van de drug rond de opname site snel verhoogt, waardoor desensibilisatie van membraan receptoren. Succesvol gebruik van bladerdeeg toepassing gepaard gaat met aandacht voor de volgende elementen: de concentratie van het geneesmiddel, de parameters van de micropipet van bladerdeeg, de afstand tussen het uiteinde van een puff-micropipet en het neuron opgenomen, en de duur en Druk het bladerdeeg rijden (pond per vierkante inch, psi). Dit artikel beschrijft een stapsgewijze procedure voor het vastleggen van geheel-cel stromingen geïnduceerd door puffend gamma - aminoboterzuur (GABA) op een neuron van een prefrontale corticale segment. Dezelfde procedure kan met name worden toegepast met kleine wijzigingen aan andere hersengebieden zoals de hippocampus en de striatum en verschillende preparaten, zoals celculturen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De patch-clamp techniek, een primaire hulpmiddel voor het onderzoeken van de elektrische signalen in neuronen, werd ontwikkeld in de jaren 19701,2. Een groot voordeel van deze techniek is dat het geeft kennis over hoe specifieke behandelingen (bijvoorbeeld farmacologische) neuronale functies of kanalen in real-time3kan wijzigen. Farmacologische evaluatie van neuronale functie tijdens geheel-cel opnemen in een segment van de hersenen vereist de toepassing van drugs, zoals agonisten of antagonisten van specifieke receptoren, om de neuronen wordt opgenomen. Met deze methode kunt de identificatie van neuronale veranderingen die zich na toepassing van een specifieke drug voordoen, dus leidt tot een beter begrip van de fysiologische en pathologische eigenschappen van de neuronen4. Hoewel farmacologische administratie kan worden uitgevoerd via beide perfusie5 of bladerdeeg6, is de laatste de superieure techniek. In het bijzonder: (i) bladerdeeg toepassing snel toeneemt drug concentratie rond de opgenomen neuron tot een niveau dat desensibilisatie van het membraan-receptoren wordt verhinderd; (ii) het volume van de drug gepofte is extreem laag, zodat er weinig effect op de bad-oplossing, waardoor dus eventuele ongewenste effecten van de door de overheid gereguleerde chemische stoffen op de hersenen segmenten; (iii) het bladerdeeg-protocol kan worden ingesteld en opgeslagen, waardoor het experiment zeer nauwkeurig worden gereproduceerd; (iv) bladerdeeg toepassing vertegenwoordigt economische hetgebruikvan agonisten/antagonisten, bijzonder wanneer dergelijke reagentia zijn duur of moeilijk te verkrijgen.

Hier, zullen we ons richten op recording geheel-cel stromingen geïnduceerd door puffend GABA in terdege voorbereid hersenen plakjes, een preparaat dat het voordeel van relatief goed bewaard gebleven hersenen circuits heeft. Hoe voeren we bladerdeeg-geïnduceerde remmende stromingen7 zal in dit artikel worden beschreven. Met behulp van cesium (Cs+)-op basis van interne oplossingen en houden van de neuronen op 0 mV, we zullen introduceren GABA-bladerdeeg opgeroepen remmende postsynaptisch stromingen (eIPSCs) met passende technische details. Met behulp van een muismodel van depressie veroorzaakt door lipopolysaccharide (LPS) injectie8, laten we zien dat de eIPSC amplitude opgeroepen door een GABA-bladerdeeg aanzienlijk verminderd in plakjes van LPS-geïnjecteerd muizen in vergelijking met controle van het voertuig. Onze bedoeling is dat dit artikel laten hoe de bladerdeeg techniek breed toepasbaar is aan studies gericht zien moet op de evaluatie van het effect van chemische stoffen, stoffen of geneesmiddelen op neuronale activiteiten in plakjes van de hersenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierverblijven en alle dier experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de procedures die zijn goedgekeurd door de ethische commissie voor dierlijke onderzoek bij South China Normal University, volgens de richtsnoeren voor Animal Care opgericht door het National Institute of Gezondheid.

1. bereiding van de oplossingen

  1. bereiden 500 mL van de standaard kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) met de componenten die in onze gepubliceerde werk 7 beschreven, zoals vermeld in tabel 1.
    1. Gebruik schone glazen bekers met gedeïoniseerd water tot het bereiden van een verse ACSF-oplossing. Spatels met gedeïoniseerd water schoon en droog zijn voordat u met toevoegen van NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glucose, en voeg de CaCl 2 na gelet borrelen de oplossing met 95% O 2 / 5% CO 2 mengsel voor ~ 20 min (zoals aangegeven in tabel 1) tot 500 mL gedeïoniseerd water. Roer tot het volledig ontbonden.
    2. Zorg ervoor dat de ACSF volledig is wissen zonder enige neerslag. Vervolgens Breng de pH op 7,2-7.4. Bellendiagram met een mengsel van koolwaterstofgassen bestaat uit 95% O 2 en 5% CO 2 voor ~ 20 min.
  2. Bereiden 250 mL segment snijden oplossing met de chemicaliën 7 beschreven in tabel 2.
    1. KCl, MgCl 2 NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glucose toevoegen en voeg de CaCl 2 laatste zoals vermeld in 1.1.1, aan 250 mL gedeïoniseerd water en ontbinden als beschreven in 1.1.1 en 1.1.2.
    2. Na borrelen met 95% O 2 / 5% CO 2, plaatst de oplossing in een vriezer voor 15-20 min zodat de snij-oplossing wordt ijskoud en gedeeltelijk bevroren.
      Opmerking: We gebruiken deze oplossing snijden bij het maken van segmenten van 1-2 maand-oude muizen; de formule kan verschillen voor muizen ouder dan 2 maanden.
    3. Bereiden LPS oplossing door ontbinding in steriele endotoxine-vrije isotonische zoutoplossing (0,9% NaCl). LPS is intraperitoneally toegediend (0,5 mg/kg) en beginnen met het opnemen van 2 h later.

2. Voorbereiding van de prefrontale Cortex Slice

  1. de snij-oplossing uit de vriezer en meng hiervoor een slush. Plaats van de oplossing op ijs en bubble voortdurend met 95% O 2 / 5% CO 2.
  2. Met grote, scherpe schaar, snel decapitate een muis als beschreven 9 en onmiddellijk het hoofd in een bekerglas gevuld met ijskoude (0-4 ° C) snijden oplossing.
  3. De bovenkant van de schedel langs de middellijn in een richting caudal-naar-nasale snijd met een fijn schaar en de laterale schedel gedeelten worden verwijderd. Verwijderen van de hersenen met een fijne spatel en neerzetten in ijskoude snijden oplossing.
    Opmerking: Stappen 2.2-2.3 snel moeten worden gedaan (ideaal < 1 min).
  4. Plaatst de hersenen op het deksel van een 9 cm petrischaal gevuld met ijs. Spoel de hersenen met ijskoude snijden oplossing. Afgesneden van het cerebellum en de bulbus olfactorius met een scheermesje.
    5. De houder van de
  5. toepassen Cyanoacrylaat lijm met het model van een vibratome. Zorgvuldig plaats de hersenen blokkeren op de druppel lijm, rostraal kant naar boven, en onmiddellijk onder te dompelen in ijskoud snijden oplossing.
  6. De meshouder voor de vibratome onder een hoek van 15° ten opzichte van het horizontale vlak aanpassen en bereiden van 350-µm coronale hersenen segmenten (lemmet vibratie frequentie = 85 Hz, snelheid = 0.1 mm/s).
  7. Met behulp van een precisiepipet, overdracht de plakjes in de bedwelmingsruimte herstel gevuld met ACSF, Incubeer gedurende 1 h (op RT) met het constant borrelen van 95% O 2 / 5% CO 2.

3. Geheel-cel Patch opnemen

  1. Make glas borosilicaat micropipetten voor gebruik als opname elektroden of bladerdeeg micropipetten volgens de specifieke richtsnoeren in de bedieningshandleiding van de trekker. Voor het opnemen van elektroden, tip weerstanden zijn in het bereik 4-6 M Ω, terwijl bladerdeeg micropipetten tip diameters in het bereik 2-5 µm.
  2. Nb + kanaal blocker (TTX, 1 µM), toevoegen aan blok snel nb + kanaal en dus actie potentieel, naar ACSF en onderhouden van een constant debiet van deze oplossing van 2-3 mL/min bij de kamer van de opname, door peristaltische pomp in de kamer en aspiratie van te maken. Bubble van het ACSF met 95% O 2 / 5% CO, 2 voortdurend om de levensvatbaarheid van de plakjes.
  3. Pipetteer een plakje van de hersenen in de zaal van de opname met behulp van een gemodificeerde Pipet van Pasteur waarvan fijne punt werd gesneden te passen de segmentgrootte. Betrekking hebben op het segment met een platina segment anker met parallelle nylon draden verdeelde ≥ 2 mm uit elkaar te houden van het segment op het perron.
  4. Vullen de micropipet van de opname met interne oplossing 7 (tabel 3), en vul de bladerdeeg micropipetten met GABA op 10 µM, 50 µM, en 100 µM (ontbonden in ACSF) of ACSF als voertuig besturingselement.
  5. Om te voorkomen dat de blokkade met puin, licht positieve druk met behulp van een injectiespuit 1 mL voordat het onderdompelen van de elektrode van de opname in de ACSF van toepassing. Met behulp van een micromanipulator onder een microscoop (4 x objectief), plaatst u de opname elektrode en bladerdeeg micropipet zodat de tips worden weergegeven in het midden van het videobeeld in de monitor ( Figuur 1).
  6. Pas de focus van de Microscoop (40 x objectief) terwijl het geleidelijk verminderen van de micropipet bladerdeeg en plaatst u deze boven de opname neuron onder een hoek van 45°. Houd de afstand tussen het uiteinde van de micropipet van bladerdeeg en het neuron opgenomen tussen 20-40 µm ( Figuur 1 B). Langzaam maar zeker naderen het neuron met de opname-elektrode en laat de overdruk. Een zwak en kort afzuigen door de buis aangesloten op de elektrode-houder waarmee een giga-ohm zegel.
  7. Behouden de spanning aan 0 mV. Na de vorming van het zegel van de giga-ohm, compenseren voor snelle en trage precisiecapaciteit handmatig of automatisch. Vervolgens afzuigen een korte en sterke via de slang geheel-cel modus bovengenoemde.
  8. Record eIPSC in spanning-clamp modus. Lage gasdruk (stikstof, 4-6 psi) van toepassing op de micropipet van de bladerdeeg met behulp van een Picospritzer, aangestuurd door een Master 8 spanning stap generator te leveren van enkele of gekoppelde GABA Soezen ( Figuur 2).
  9. Wijzigen van de duur van de bladerdeeg voor het verkrijgen van de beste eIPSC resultaten ( Figuur 3) en het meten van de eIPSC in het LPS-induced depressie model ( Figuur 4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bladerdeeg-techniek kan onderzoekers te bestuderen van het effect van drugs op bepaalde receptoren op het oppervlak van een bepaalde neuron. In dit artikel focussen we op stromingen gemedieerd door GABA receptoren. Figuur 1 toont de bladerdeeg en opname micropipetten. Te heffen geen effect op opgenomen neuronen van de fysieke druk gegenereerd door het bladerdeeg, ACSF en sacharose soezen(Figuur 2)worden gebrui...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bladerdeeg toepassing wordt algemeen gebruikt ter beoordeling van postsynaptisch receptor functie3,4,7, maar vereist nauwkeurige controle in elk experiment. Hier beschrijven we een procedure waarbij geheel-cel patch klemmen, waaruit blijkt hoe dat Gaba-bladerdeeg geïnduceerde IPSCs (bijvoorbeeld eIPSCs) in plakjes van de prefrontale corticale hersenen. De weerstand van de opname-elektrode is ongeveer 5 MΩ, terwijl de tip diamete...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedank de volgende organisaties: nationale Natural Science Foundation van China (31171018, 31171355), de wetenschap en technologie afdeling van Guangdong (2013KJCX0054), de Natural Science Foundation van de Guangdong provincie ( 2014A030313418, 2014A030313440), en Guangzhou wetenschap en technologie Bureau (201607010320).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Glass Borosilicate micropipettesShutter InstrumentsBF150-86-101.50 mm buitendiameter; 0.86 mm binnendiameter
Micropipette PullerShutter InstrumentsMODEL P-97 Flaming/Brow Micropipette Puller
MicromanipulatorsShutter InstrumentsMP-285
Computer controlled Amplifier   Molecular DevicesMulticlamp 700B
Digital Acquisition system Molecular DevicesDigidata 1440A
Imaging CameraNikon 2115001Inspectieapparatuur
Microscopy Nikon Eclipse FN1 
Master 8A.M.P.I.Master-8 Pulse stimulator
Vibratome SlicerLeicaVT 1000S
Razor bladeGillette74-SFLYING EAGLE
Video monitorPanasonicWV-BM 1410
502 GlueDeli7146Cyanoacrylaatlijm
Peristaltic pumpShanghai JIA PENG CorporationBT100-1F
Video CameraOlympus America MedicalOLY-150
Transfer PipetsBiologix30-0138A1

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  2. Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
  3. Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
  4. Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
  5. Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33(2012).
  6. Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).
  7. Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
  8. Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
  9. Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
  11. Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
  12. Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
  13. Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Whole cell patch clampGABA elektrofysiologiepreparatie van hersensectiesmicropipettechniekvoltage clamp registratieIPSC stroommetingprefrontale cortexsectiefarmacologische toedieningelektrofysiologische registratie

Gerelateerde artikelen