Method Article

Visualiseren van extracellulaire Traps Macrophage met behulp van de Confocal Microscopie

DOI:

10.3791/56459

⸱

October 19th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macrophage vallen extracellulaire een nieuw beschreven entiteit. Dit artikel zal zich concentreren op confocale microscopie methodes en hoe ze zijn gevisualiseerd in vitro en in vivo van longkanker monsters.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een primaire methode gebruikt om te definiëren van de aanwezigheid van neutrofiele extracellulaire vallen (netten) is confocale microscopie. Wij hebben gevestigde confocale microscopie methodes om te visualiseren macrofaag extracellulaire vallen (METs) bewerkt. Deze extracellulaire traps worden gedefinieerd door de aanwezigheid van extracellulaire chromatine met co uitdrukking van andere onderdelen zoals de submodule proteasen, citrullinated histonen en peptide arginase deiminase (PAD). De expressie van METs is over het algemeen gemeten na blootstelling aan een stimulans en vergeleken met un-gestimuleerd monsters. Monsters zijn ook opgenomen voor achtergrond en isotype controle. Cellen worden geanalyseerd met behulp van welomschreven afbeelding analysesoftware. Confocale microscopie kan worden gebruikt om te definiëren van de aanwezigheid van METs zowel in vitro als in vivo in longweefsel.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofiele extracellulaire vallen (netten), werden voor het eerst beschreven door Brinkmann et al. 1 ze zijn overwegend geproduceerd in reactie op de infectie (vooral voor bacteriën) en hebben een belangrijke rol in host defense1,2. Ze zijn ook beschreven moet worden uitgevoerd in reactie op niet-besmettelijke ziekte, met inbegrip van vasculitis en systemische lupus erythematosus (SLE); en naar de mitogeen phorbol 12-myrisate 13-acetaat (PMA)2,3. Het is onlangs erkend dat andere celtypes extracellulaire vallen, met inb....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

dit protocol volgt experimenten goedgekeurd: (1) mensen door de ethische commissie van Monash medisch centrum, en (2) dieren door de ethische commissie van de Universiteit van Melbourne.

1. Bronchoalveolar Lavage (BAL) macrofagen

  1. gebruik BAL te verkrijgen van longkanker macrofagen in: (1) mens onderwerpen door bronchoscopie 6, en (2) muizen met behulp van intra-tracheale aspiratie 13 .
    Opmerking: Overname van de macrofagen in het algemeen veroorzaakt een activering van deze cellen. Macrofagen zijn verkregen van patiënten die behoefte hebben aan een bronchoscopie te onderzo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

METs kunnen worden gevisualiseerd van BAL monsters, in longweefsel en dikker Long secties met 3D-beelden. Een voorbeeld van METs gevisualiseerd in een monster van de BAL is weergegeven in Figuur 1. De morfologie van de METs hangt af van hun fase van rijping. De eerste detecteerbare functie op microscopie is het verkeer van de kern tot aan de rand van de cel. Dit wordt gevolgd door extracellulaire chromatine met andere mede uitgedrukt bemiddelaars, zoals H3Cit.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methode die is beschreven in deze review is gebaseerd op die gebruikt voor het definiëren van de aanwezigheid van netten14. Macrofagen zijn veruit de dominante celtype in BAL monsters en deze methode van collectie is bijzonder geschikt voor de studie van METs. Als de rode bloedcellen in de BAL aanwezig zijn, moeten deze cellen worden lysed met behulp van ammoniumchloride. De BAL procedure zal in het algemeen het activeren van de macrofagen en daarom naar verwachting zullen er METs aanwezig in u.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen informatieverschaffing met betrekking tot dit werk.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Monash University, the National Health en Medical Research Council en de Monash Lung en slaap Instituut. De auteurs bedank de medewerkers van klinische immunologie aan Monash gezondheid, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass en Camden Lo van Monash Micro Imaging (MMI) voor hulp met de confocal microscopie, imaging, en de auteurs erkennen de MMI-faciliteiten van de Monash University. De auteurs erkennen de faciliteiten, en de wetenschappelijke en technische bijstand van de Monash histologie Platform.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)AbcamAB510310 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12Novus BiologicalNB110-572141:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9Novus BiologicalAB1199061:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2AbcamAB164787 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4AbcamAB12808610.1 ug/ml
Sheep anti-human NELifeSpan BioscienceLS-B424425 ug/ml
NameCompanyCatalog NumberComments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9AbcamAF90910 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)AbcamAB510310 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80In-house (hybridoma)In house20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NESapphire BioscienceLS-B424425 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4AbcamAB12808610.1 ug/ml
Super-frost plus slidesMenzelS41104A
Dapi-prolong goldMolecular probesP36931
Triton-X 100Sigma-Aldrich85111
Ammonium chlorideSigma-AldrichE9434
NameCompanyCatalog NumberComments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/Life technologiesA-21441
Chicken anti-rabbit AF 594Life technologiesA-21442
Chicken anti-goat AF 594Life technologiesa-21468
Chicken anti-mouse AF488Life technologiesA-21200
Donkey anti-sheep AF 594Life technologiesA-11018
Chicken anti-mouse AF 647Life technologiesA-21463
Donkey anti-sheep AF 594Life technologiesA-11016
Isotype control
Rabbit IgGIn house
Rabbit IgGIn house
Mouse IgG1BD Bioscience550878
Rabbit IgGIn house
Mouse IgG2aBioLegend400201
Sheep IgGIn house
NameCompanyCatalog NumberComments
Software Programs
ImarisBitplane
Image JNIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscopeNikon
FV1200 Confocal scanning microscopeOlympus
NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
NameCompanyCatalog NumberComments
Media
RPMISigma-Aldrichr8758
Fetal calf serumSigma-AldrichF0926
L-glutamineSigma-AldrichG7513
NameCompanyCatalog NumberComments
Other reagents
Sudan blackSigma-Aldrich199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixativeSigma-Aldrich27387
XyleneSigma-Aldrich214736
KetamineSigma-AldrichK2753
Natural formalinSigma-Aldrich42904
ParaffinSigma-Aldrich327204
AgaroseSigma-AldrichA2576
Solvent 3BHi-Chem2026
Coverslips 12 mlSigma-AldrichS1815
Coverslips 60 x 24 mlSigma-AldrichC6875
NameCompanyCatalog NumberComments
Mice
c57 black 6Monash animal research platform (MARP)
BALB/cMARP

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
    3. <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Macrophage Extracellular TrapsConfocal MicroscopyExtracellular ChromatinCitrullinated HistonesGranule ProteasesPeptidyl Arginase DeiminaseBronchoalveolar LavageParaformaldehyde FixativeDAPI StainingImage Analysis Software

Related Articles