Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van antilichaam gebaseerde Drugs gevolgen voor lymfkliertest beenmerg en peritoneale Macrophage activering

7.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56689

⸱

26 december 2017

 , 
1British Columbia Children's Hospital Research Institute, University of British Columbia

In dit artikel

Samenvatting

Antilichaam gebaseerde drugs hebben een revolutie teweeggebracht in behandeling voor inflammatoire ziekten. Naast directe gevolgen hebben voor concrete doelstellingen, kunnen antilichamen macrofagen tot anti-inflammatoire activeren. Dit protocol beschrijft hoe anti-inflammatoire macrofaag activering kan worden beoordeeld in vitro met behulp van de muis het beenmerg macrofagen en in vivo, met behulp van peritoneale macrofagen.

Samenvatting

Macrofagen zijn fagocytische ingeboren immune cellen, die initiëren immuunresponsen ziekteverwekkers en bijdragen tot de genezing en weefsel teruggave. Macrofagen zijn even belangrijk in het uitschakelen van inflammatoire reacties. We hebben aangetoond dat macrofagen gestimuleerd met intraveneuze immunoglobuline (IVIg) grote hoeveelheden van de anti-inflammatoire cytokine, interleukine 10 (IL-10), en lage niveaus van pro-ontsteking cytokinen in reactie op bacteriële lipopolysacchariden produceren kunnen ( LPS). IVIg is dat een polyvalente antilichaam, voornamelijk immunoglobulin Gs (IgGs), gebundeld uit het plasma van meer dan 1.000 bloeddonoren. Het wordt gebruikt ter aanvulling van antistoffen bij patiënten met een immuun tekortkomingen of onderdrukken van de immuunrespons bij patiënten met auto-immune of inflammatoire voorwaarden. Infliximab, een therapeutische anti-tumor necrose factor alpha (TNFα) antilichaam, heeft ook aangetoond dat het activeren van de macrofagen voor de productie van IL-10 in reactie op inflammatoire stimuli. IVIg en andere antilichaam gebaseerde biologics kan worden getest om te bepalen hun effecten op de macrofaag activering. Dit document wordt beschreven methoden voor afleiding, stimulatie en beoordelingvan lymfkliertest beenmerg macrofagen geactiveerd door antilichamen in vitro en lymfkliertest peritoneale macrofagen geactiveerd met antilichamen in vivo. Tot slot tonen wij het gebruik van het westelijke bevlekken om te bepalen van de bijdrage van specifieke cel signalering emissieroutes naar de anti-inflammatoire macrofaag activiteit. Deze protocollen kunnen worden gebruikt met genetisch gemodificeerde muizen, om te bepalen van het effect van een specifieke expressie gebrachte eiwitten op anti-inflammatoire macrofaag activering. Deze technieken kunnen ook worden gebruikt om te beoordelen of specifieke biologics optreden kan door macrofagen omzetten in een IL-10-producerende anti-inflammatoire activeringsstatus die inflammatoire reacties- in vivo vermindert. Dit kan informatie verschaffen over de rol van macrofaag activering in de werkzaamheid van biologics tijdens ziekte modellen in muizen, en bieden inzicht in een potentiële nieuwe werkingsmechanisme bij mensen. Omgekeerd, dit kan waarschuwen tegen het gebruik van specifieke antilichamen gebaseerde biologics voor de behandeling van besmettelijke ziekten, vooral als de macrofagen spelen een belangrijke rol in de verdediging van de gastheer tegen die infecties.

Inleiding

Macrofagen zijn ingeboren immune cellen, die meerdere rollen in de immuunrespons op infectie of verwonding spelen. Macrofagen zijn verantwoordelijk voor het initiëren van een immuunrespons op infectie of weefsel schade, stoppen de ontstekingsreactie, en bevordering van de helende reactie1. Voorbeelden van de best bestudeerde macrofaag activering statussen zijn: 1) macrofagen, behandeld met interferon gamma (IFNγ) en bacteriële lipopolysaccharide (LPS), M (IFNγ + LPS), aangewezen die bijdragen tot de inflammatoire respons; 2) macrofagen gestimuleerd met Interleukine (IL-4), 4 M(IL-4), die geassocieerd met de helende reactie worden; 3) macrofagen gestimuleerd met immuuncomplexen (IC) en LP's, M (IC + LPS), die de mogelijkheid hebben om het uitschakelen van de ontstekingsreactie2,3. M (IC + LPS) onderscheiden van M(IL-4) wond genezing van macrofagen, en doen niet uiten het arginase enzym (Arg-1) of de FIZZ14. De beste teller voor deze anti-inflammatoire macrofagen is hun cytokine productie5. Macrofagen hebben meerdere rollen bij het handhaven van de gezondheid, maar ook bijdragen tot inflammatoire ziekten en kanker3. Hierdoor zijn de macrofagen een belangrijk therapeutisch doel voor de behandeling van een breed scala van ziekten. Het is belangrijk om te onderzoeken van de effecten van antilichamen op hun activeringsstatus te ontwikkelen macrofaag gebaseerde behandelingen voor ziekte.

Dit document richt zich op het gebruik van lymfkliertest beenmerg afgeleid macrofagen (BMDMs) en peritoneale macrofagen voor het testen van het effect van antilichaam drugs op inflammatoire reacties in vitro en in vivo. Onlangs, zijn er meerdere studies waaruit blijkt van de effecten van antilichamen macrofaag activering6,7,en8. Macrofagen mede geactiveerd met immuuncomplexen, die antilichamen complexvorm met een antigeen, en LP's, een normaal inflammatoire prikkel, produceren zeer hoge niveaus van anti-inflammatoire cytokine, IL-10, en zeer lage niveaus van de pro-inflammatoire cytokine, interleukine 12 (IL-12)9. In toevoeging, infliximab, een monoclonal antilichaam tegen TNFα, te werken, ten dele door de anti-inflammatoire macrofagen via haar fragment crystallizable (Fc) regio7inducerende is gebleken. We hebben gemeld dat IVIg + LPS veroorzaken anti-inflammatoire macrofaag-activering dat is vergelijkbaar met M (IC + LPS), waarin mede gestimuleerde macrofagen produceren grote hoeveelheden van IL-10 en lage bedragen van de pro-inflammatoire cytokine subeenheid interleukine 12 of 23 p40) Il-12/23p40), Interleukine-6 (IL-6) en TNF8. IVIg is een drug die bestaat uit polyclonal antilichamen, voornamelijk IgG, die uit het bloed van meer dan 1.000 donoren10heeft zijn gebundeld. Het wordt gebruikt voor de behandeling van een breed scala aan immunologische ziekten, zoals idiopathische trombocytopenische purpura en chronische demyeliniserende polyneuropathie, maar zijn werkingsmechanisme is niet volledig begrepen11. De effecten van antilichaam gebaseerd drugs op macrophage activering kunnen worden geschat aan de hand van de beschreven methoden hierin.

De effecten van specifieke biologics op macrophage activering kunnen worden getest in BMDMs en peritoneale macrofagen. Met deze macrofaag-bronnen kunt beoordeling van primaire cellen. Voorbereidende tests van antilichamen op gekweekte primaire cellen vergt minder tijd en monetaire investeringen dan andere modellen tijdrovend en duur ziekte. Door het injecteren van een geneesmiddel in een gezonde muis in vivo, en isoleren van de cellen en analyseren ze ex vivo, kan men bepalen als studies om te beoordelen of de behandeling met biologics is van invloed op macrophage activering in ziekte modellen zijn gerechtvaardigd.

Met weinig studies die het effect van biologische therapieën op macrophage activering in vitro en in vivo direct testen, bieden onze technieken een voordeel ten opzichte van alternatieve technieken. Huidige technieken betrekken testen biologische drug effecten op gemengde cel populaties in vitro, zoals het effect van infliximab in een gemengde lymfocyt reactie (MLR) of IVIg op menselijke macrofagen in perifere bloed mononucleaire cellen, waar het effect niet kan worden toegeschreven aan een bepaalde cel type7,12. Met behulp van BMDMs en peritoneale macrofagen is gunstig over het gebruik van cellijnen, zoals RAW264.7 cellen, die niet de pro-inflammatoire cytokine produceren, IL-12, in reactie op LPS8,13. Testen van het effect van een antilichaam gebaseerde drug op macrophage reacties ex vivo heeft voordelen omdat cytokine reacties kunnen rechtstreeks worden toegeschreven aan macrofagen, in plaats van macrophage reacties afgeleid door het meten van serum cytokine niveaus14 . BMDMs en peritoneale macrofagen kunnen worden afgeleid en geïsoleerd van genetisch gemodificeerde muizen om te bepalen van de specifieke rol van een proteïne in anti-inflammatoire macrofaag activering. Bijvoorbeeld, hebben we gebruikt Il10 gebrekkige(- / -) BMDMs om aan te tonen dat IVIg-geïnduceerde vermindering van pro-inflammatoire cytokine productie gedeeltelijk afhankelijk van IL-10,8 is. Van een drug werkingsmechanisme kan worden onderzocht gebruikend het westelijke bevlekken, waar de rol van specifieke proteïnen en signalering gebeurtenissen kan worden bepaald. Kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) kunnen worden uitgevoerd op BMDMs of peritoneale macrofagen weer te geven van de patronen van de genexpressie die uit een antilichaam activering voortvloeien. Modellen van de ziekte in muizen kunnen informatie geven over de mogelijke werkzaamheid van antilichaam gebaseerde biologische therapieën in modellen voor ziekten zoals inflammatory bowel disease, reumatoïde artritis en kanker15,16, 17. de hier beschreven technieken zal echter informatie verschaffen over het werkingsmechanisme van deze biologics door te bepalen of ze anti-inflammatoire macrofaag activiteit veroorzaken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de University of British Columbia.

1. het beenmerg Macrophage afleiding en activering met antilichamen

  1. Met behulp van CO2 verstikking euthanasie uitvoeren.
    1. Plaats de muis in inductie kamer. Euthanaseren muis met 5% Isofluraan anesthesie, voor 60-90 s, totdat ze stilstaan en ademhaling diep en traag is.
    2. Uitschakelen van Isofluraan anesthesie en beheren van 6-8 L/min voor CO2 tot muis is gestopt met ademen. Verlaten muis met CO2 op voor ten minste nog eens 5 min. verifiëren dat er niet langer een hartslag of ademhaling is. Het uitvoeren van een cervicale dislocatie om ervoor te zorgen dood.
      Opmerking: 8-12 weken oude muizen bieden de hoogst mogelijke opbrengst van macrofagen.
  2. Spray muis poten met 70% ethanol en pin met armen en benen gestrekt in de liggende positie over een schuim-bord. Met een schaar en pincet te houden van de huid, maken een ondiepe snee (0,2 cm) verwijderen van de huid en de vacht van het oppervlak van elk van de achterpoten.
    Opmerking: Deze procedure en alle weefselkweek manipulaties uitvoeren in een steriele kap.
  3. Trim spier zijn verbeend en dijbeen om zichtbaar te maken. Verwijder de zijn verbeend en dijbeen, door het snijden van de botten en spieren net onder het heupgewricht en boven de enkels. Trim zo veel spieren uit mogelijk.
  4. Spray botten met 70% ethanol en wacht 1 minuut om te verdampen en plaats ze in 6 goed plaat van flush medium been (Iscove van gewijzigd Dulbecco van medium (IMDM), 10% foetale runderserum (FBS)).
  5. Snijd de uiteinden van de botten door het snijden van 0,1 cm van bot uit de enkel en de bovenkant van het dijbeen, zodat het bot holte wordt blootgesteld. Ervoor zorgen dat het beenmerg zichtbaar is en een 26 gauge naald kan worden geplaatst in de holte van het bot.
  6. Snijd de botten en spieren te scheiden van de zijn verbeend en dijbeen van de gewrichten van de knie. Invoegen van een naald van de 26 gauge gekoppeld aan een 10 mL spuit in de holte. Spoel de beenmerg in een conische buis van 50 mL met 5 mL bot flush middellange. Spoel twee zijn verbeend en twee dijbeen, van één muis, in elke tube van 50 mL.
  7. Pipetteer op en neer de verschillende tijden of vortex beenmerg op een langzame snelheid tot zachtjes dispergeren klontjes. Snaren van beenmerg moeten worden opgesplitst in kleine (minder dan 0,5 mm) vlekjes van beenmerg. Vul de conische buis tot 50 mL met bot flush middellange. Pipetteer inhoud van de conische buis in een 75 cm2 Weefselkweek behandeld kolf en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 1 h.
    Opmerking: Volwassen macrofagen en mesenchymale cellen zullen worden aanhangend aan op de maatkolf en worden afgevoerd, terwijl de gewenste hematopoietische progenitorcellen in suspensie blijven.
  8. Het medium met hematopoietische progenitorcellen Pipetteer in een conische tube van 50 mL. Centrifugeer de buis bij 300 x g bij kamertemperatuur voor 5 min. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 mL macrofaag kolonie stimuleren kweekmedium factor (MCSF) (IMDM, 10% FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL penicilline/streptomycine en 150 μM monothioglycerol (MTG)).
  9. Cellen tellen met behulp van een hemocytometer-18. Voeg medium resuspendeer de cellen tot een concentratie van 0,5 x 106 cellen/mL, 1.5 x 107 cellen/kolf in 30 mL medium, en Pipetteer zachtjes op en neer. Pipetteer 30 mL van de schorsing in een nieuwe 75 cm2 Weefselkweek behandeld bevat.
  10. Op dag 4 en dag 7 na de oorspronkelijke cultuur in stap 1.9, Controleer of de cellen aanhanger en lichtjes vertakte met behulp van een omgekeerde helder veld voor fasecontrastmicroscoop. Gooi het medium met de cellen die niet-aanhanger. Spoel de cellen met IMDM één keer en Voeg 30 mL MCSF-kweekmedium.
  11. Wanneer de cellen zijn volwassen per dag 10 (> 95% positief voor F4/80 en Mac-1), Controleer nogmaals of de cellen zijn aanhanger en lichtjes.
  12. Plaat van cellen voor stimulaties, het kweekmedium verwijderen uit de kolf en voeg 8 mL enzym gratis, EDTA-based cel dissociatie buffer (Tabel van materialen). Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C, 5% CO2.
  13. Schraap cellen zachtjes, met een kleine hoeveelheid druk, met behulp van een steriele cel schraper. Controleer in de Microscoop die cellen hebben losgemaakt van het oppervlak van de kolf. Pipetteer gedissocieerde cellen in een conische tube van 50 mL. Spoel de kolf 3 keer met 5 mL van IMDM en bundelen van de spoeling-oplossing met de cellen die zijn geoogst. Centrifugeer cellen bij 300 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  14. Resuspendeer de pellet cel in 3 mL MCSF kweekmedium per conische tube van 50 mL. Levensvatbare cellen tellen met behulp van een hemocytometer-18. Resuspendeer de cellen bij een concentratie van 1 x 106 cellen/mL en plaat 100 μl van celsuspensie (1 x 105 cellen/well) per putje van een 96-Wells Weefselkweek behandeld, platte bodemplaat.
    Opmerking: Beenderen van één muisklik zal genereren genoeg cellen voor 100 putten. Indien gewenst, kan 1 mL van cellen in een 6-well plaat (Weefselkweek behandeld, platte bodem) worden verguld. Een groter aantal cellen (1 x 106 cellen) kan nuttig zijn voor westelijke vlek analyses.
  15. Zodra aanhangend, stimuleren tweevoudige of drievoudige putjes elk met 10 ng/mL van LPS in IMDM, 30 mg/mL IVIg, of IVIg + LPS. Doses van LPS of IVIg kunnen worden getitreerd om te optimaliseren van reacties. Tweevoudige of drievoudige wells als ongestimuleerde besturingselementen verlaten. Incubeer hen gedurende 24 h (37 ° C, 5% CO2).
    Opmerking: Opnieuw vergulde cellen dient zich te houden aan weefselkweek putjes binnen 1 uur.
  16. Cel supernatant van elk putje in individuele 1,7 mL microcentrifuge buizen verzamelen en verwijderen van elke zwevende deeltjes door spinnen bij 10.000 x g gedurende 5 min.
  17. Verwijder het supernatant cel en vermijden de pellet te verstoren. Plaats de geklaarde cel supernatant in een steriele microcentrifuge buis.
    Opmerking: Cel supernatant kunnen worden vehiculumcontrolegroep cytokines, IL-10 en cytokine subeenheid, IL-12 / 23p 40, door enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) onmiddellijk, of die zijn opgeslagen op de lange termijn-80 ° C. Volg ELISA protocol van verkrijgbare kit (Tabel van materialen). Andere pro-inflammatoire cytokines kunnen worden bepaald, zoals IL-6 en TNF, zoals ze zijn ook verminderd door co behandeling met IVIg + LPS stimulatie t.o.v. stimulatie met LPS alleen. Na stimulatie, kunnen Adherente cellen worden voorbereid voor technieken zoals het westelijke bevlekken of kwantitatieve polymerase kettingreactie (Q-PCR) 19,20.

2. uitdagend muizen In Vivo met IVIg en peritoneale macrofagen oogsten

  1. Weeg elke muis.
Bereken het volume van IVIg (voorraad concentratie van 100 mg/mL) die nodig is om een definitieve dosis van 2,5 g/kg lichaamsgewicht voor elke muis.
Opmerking: bijvoorbeeld, voor een muis van 20 g, 500 µL van IVIg is vereist.
  • Trek de benodigde hoeveelheid IVIg in een steriele 1 mL spuit uitgerust met een steriele 26 gauge naald. Beheren voor controle muizen die geen IVIg ontvangt, een equivalente dosis volume steriel fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.4 in plaats van IVIg.
  • Nekvel de muis met één hand door haar huid aan de achterkant van de nek met uw duim en wijsvinger te grijpen en zijn staart en achterpoten met uw overige vingers te houden. Zijn lichaam naar de grond kan vallen.
  • Plaats de naald onder een hoek van 30-40° ten opzichte van de muis van de buik, in de lagere juiste kwadrant, schuine rand omhoog en invoegen van 1,5 cm van de naald. Injecteer de IVIg of PBS intraperitoneally. Wacht 1 h.
  • Euthanaseren van muizen met 5% Isofluraan verdoving gevolgd door 6-8 L/min CO2 verstikking (Zie stappen 1.1.1 - 1.1.2), of volgens de ethische richtlijnen van de instelling.
  • PIN de muis een schuim-Board, met benen gespreid. Spray de delen met 70% ethanol.
    Opmerking: Voer de procedure in een steriele kap.
  • Maak een ondiepe snee in de huid (0,2 cm) met een schaar langs de middellijn van de muis, om te voorkomen dat snijden de peritoneale holte. Trek de buikhuid af van de muis buik met pincet, zodat de voering van de intact peritoneale muur zichtbaar is.
  • Vul een 5 mL-spuit met 5 mL steriele PBS (pH 7.4). Invoegen van een 25 of 27 meten naald bij de bovenkant van de holte van de linker- of rechterkant naar het midden van de muis met de schuine kant van de naald omhoog.
    Opmerking: Plaats de naald zorgvuldig in de muis, zodat u niet PBS in de organen, maar veeleer in de peritoneale ruimte inspuit doen.
  • Duw de vloeistof in de peritoneale holte. Trek de naald uit de holte en massage het buikvlies voor 10 s te verjagen van de cellen. Naald invoegen aan de bovenkant van de spouw en organen te voorkomen. Verzamelen en plaats de lavage vloeistof hersteld in een conische tube van 15 mL op ijs.
    Opmerking: Voor elke 5 mL vloeistof ingespoten, ongeveer 3,75 mL zal worden hersteld.
  • Herhaal injectie en herstel (stappen 2.8-2.9) 3 meer tijden (totale geïnjecteerde volume van 20 mL), terug te vorderen van 15 mL lavage vloeistof in totaal. Lavage ophalen door elke muis in een aparte 15 mL conische buis.
    Opmerking: Na de laatste injectie wellicht gemakkelijker om de vloeistof uit de zijkanten van het veel links en rechts van de muis, waar vocht heeft opgelopen. De organen zal minder interferentie met de naald op deze positie veroorzaken.
  • Cellen naar beneden draaien bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cellen in 500 μL van plating medium (IMDM, 10% FBS, en 100 U/mL penicilline/streptomycine) per muis gespoeld. Graaf levensvatbare macrofagen met behulp van een hemocytometer-18.
    Opmerking: De macrofagen worden iets groter dan de andere peritoneale cellen. Typische opbrengst is 5 x 105 - 1 x 106 macrofagen/muis met een wild type C57BL/6 muis.
    Optioneel: Als een groot aantal rode bloedcellen aanwezig in de cel pellet zijn, een lysis stap uitvoeren om ze te verwijderen, met behulp van de 1 x rode bloedcellen lysis-buffermengsel volgens de instructies van de fabrikant.
  • Resuspendeer de cellen in het medium bij 1 x 106 macrofagen/mL plating en plaat 100 μl per putje in een 96-Wells platte bodemplaat Weefselkweek behandeld.
    Opmerking: Het kan noodzakelijk zijn aan zwembad zijn cellen uit meer dan één muis voor een experiment als met drievoudige putten of titrating stimulerende middelen. Bijvoorbeeld, als een muis had 5 x 105 macrofagen, zou 500 μL van plating medium nodig zijn. Zou dat er genoeg cellen voor 5 putten, of 1 experiment in tweevoud, met één dosis van de LP's.
  • Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2 dat macrofagen tot aanhanger. De Adherente cellen zijn de peritoneale macrofagen. Cel supernatant en niet-aanhanger cellen verwijderen. Spoel de putjes tweemaal met 200 μl IMDM (vooraf opgewarmd tot 37 ° C), wacht 10 s en langzaam het kantelen van de plaat. Het medium van de beplating te vervangen. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 30 minuten voorafgaand aan de stimulatie.
  • Stimuleren van de macrofagen met 10 ng/mL van LPS in IMDM, of laat ongestimuleerde, als een besturingselement. Incubeer gedurende 24 h, verzamelen en verduidelijken van de cel supernatant (Zie stappen 1.16-1.17) door ELISA p.a. IL-10 cytokine. Volg ELISA protocol van verkrijgbare kit (Tabel van materialen).
    Opmerking: Na stimulatie, Adherente cellen kunnen worden voorbereid voor technieken zoals westelijke vlek of PCR.

    • 3. uitdagend muizen in Vivo met IVIg + LP's en peritoneale macrofagen oogsten

    1. Weeg elke muis. Bereken het volume van IVIg (voorraad concentratie van 100 mg/mL) die nodig is om een definitieve dosis van 2,5 g/kg lichaamsgewicht. Berekent het bedrag van LPS (100 μg/mL voorraad concentratie in de IMDM) die nodig is om een definitieve dosis van 0.2 μg/g lichaamsgewicht.
      Opmerking: bijvoorbeeld, voor een muis van 20 g, 500 µL van IVIg stockoplossing en 40 μL van een 100 μg/mL oplossing van LPS is vereist.
    2. Teken het normbedrag van IVIg en LP's in een steriele 1 mL spuit uitgerust met een steriele 26 gauge naald. Voor controle muizen die geen IVIg ontvangt, vervangen door een gelijkwaardige hoeveelheid IVIg met steriel PBS pH 7.4.
    3. Nekvel de muis met één hand door haar huid aan de achterkant van de nek met uw duim en wijsvinger te grijpen en zijn staart en achterpoten met uw overige vingers te houden. Zijn lichaam naar de grond kan vallen.
    4. Plaats de naald onder een hoek van 30-40° ten opzichte van de muis van de buik, in de lagere juiste kwadrant, schuine rand, en invoegen van 1,5 cm. Injecteer het IVIg LPS, of PBS + LPS, intraperitoneally als in stap 2.4.
    5. Oogst na 1h, peritoneale macrofagen door het uitvoeren van de stappen 2.5-2.10.
    6. Cellen naar beneden draaien bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. 1 mL van de herstelde lavage vloeistof verwijderen en gebruiken voor IL-10 en IL-12 / 23p 40 analyses door ELISA volgens de instructies van de fabrikant of bevriezen bij-80 ° C voor toekomstige analyses.
      Opmerking: Om ervoor te zorgen nauwkeurige vergelijking tussen behandelingen lavage vloeistof cytokine p.a., 5 mL flushs van de peritoneale holte 4 keer voor uitvoeren een eindvolume van 15 mL Niet alle vloeistof zal worden teruggevorderd van elke flush.
    7. Zoals in stap 2.11, resuspendeer en levensvatbare macrofagen tellen.
      Opmerking: De macrofagen worden iets groter dan de andere peritoneale cellen.
    Typische opbrengst is 5 x 105 - 1 x 106 macrofagen/muis met een wild type C57BL/6 muis.
    Optioneel: Als een groot aantal rode bloedcellen aanwezig in de cel pellet zijn, een lysis stap uitvoeren volgens de instructies van de fabrikant om ze te verwijderen, zoals in stap 2.11.
  • Zoals in stap 2.12, resuspendeer de cellen in het medium plating.
    Opmerking: Het kan moet zwembad cellen van meer dan één muis voor een experiment. Bijvoorbeeld, als een muis had 5 x 105 macrofagen, zou 500 μL van plating medium nodig zijn.
  • Zoals in 2.13, Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C 5% CO2 dat macrofagen tot aanhanger.
  • Verzamelen en verduidelijken van geconditioneerde medium, volgens 1.14-1.15, een steenworp afstand van alle peritoneale cellen.
    Opmerking: Monsters kunnen worden onmiddellijk gebruikt of bevroren en opgeslagen bij-80 ° C voor cytokine analyse door ELISA.
  • Voer stap 2.11, maar Incubeer de cellen gedurende 24 uur ongestimuleerde. Verzamelen en verduidelijken van de cel supernatant, volgens stappen 1.16-1.17, door ELISA p.a. cytokine.
    Opmerking: Cellen kunnen worden voorbereid voor technieken zoals westelijke vlek of PCR, zoals in de stappen 1.16-1.17 en 2.14.

    • Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Resultaten

    Lymfkliertest bot beenmerg afgeleid macrofagen kunnen worden gekweekt van hematopoietische cel precursoren in beenmerg aangeblazen. Het beenmerg aangeblazen gebundeld van dijbeen en zijn verbeend van één C57BL/6 muis meestal opbrengst 107 beenmerg afgeleid macrofagen, waardoor ze een handige bron van macrofagen voor experimenten. BMDMs kan worden gebruikt om te testen antilichaam gebaseerd drug reacties wanneer uitgedaagd met een inflammatoire stimulans in vitro.

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Discussie

    Macrophage activering Staten spelen een belangrijke rol in beide weefsel homeostase en ziekte22. Macrofagen hebben verschillende evenals het overlappende activering Staten, afhankelijk van de signalen in hun communicatie-3. Ze hebben verschillende rollen in alle stadia van de inflammatoire respons: verdediging tegen ziekteverwekkers, wond genezing en weefsel teruggave, en hebben ook een duidelijke anti-inflammatoire activeringsstatus dat belangrijk is voor het uitzetten van...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Openbaarmakingen

    De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

    Dankbetuigingen

    L.K. is de ontvanger van de University of British Columbia 4 jaar fellowship (4YF) graduate studententijd award. L.M.S. is de ontvanger van een Canadese Vereniging van de gastro-enterologie / ziekte van Crohn en Colitis Canada / CIHR nieuwe onderzoeker salaris Award en is een biomedische van de Michael Smith Stichting voor gezondheidsonderzoek. Dit werk werd gesteund door een projectsubsidie van Canadese bloed Services, in samenwerking met de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (verlenen # CIHR2016-LS).

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Materialen

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)Life technologies12440053
    Fetal Bovine Serum (FBS)Life technologies12483-020
    Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF)Stemcell technologies78059
    Penicillin-streptomycinLife technologies15140148
    Monothioglycerol (MTG)Sigma88640
    1X red blood cell lysis buffereBioscience
    Cell dissociation bufferLife technologies13150016Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA
    Lipopolysaccharide (LPS)Sigma aldrichL 4516From E. coli 0127:B8
    IVIg (Gammunex)GrifolsReceived from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine
    IVIg (Gammagard liquid)Baxter Healthcare CorporationReceived from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine
    IVIg (Octagam)OctapharmaReceived from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine
    Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4Life technologies10010023
    mouse IL-10 ELISABD biosciences555252
    mouse IL-12/23p40 ELISABD biosciences555165
    anti-Erk1/2 antibodyCell signalling technology9101
    anti-pp38 antibodyCell signalling technology9211
    anti-GAPDH antibodyFitzgerald industries10R-G109A
    26 g needleBD biosciences305110
    1 mL syringeBD biosciences309659
    10 mL syringeBD biosciences309604
    15 mL conical tubeBD biosciences352096
    50 mL conical tubeBD biosciences352070
    microcentrifuge tube (1.7 mL)DiamedSPE155-N
    75 cm2 tissue culture treated flaskBD biosciences353136
    Cell scraperBD biosciences353085
    ForceptsVWR82027-386fine tip, dissecting 
    ScissorsVWR82027-582Delicate, 4 1/2"
    Brightfield microscopeMoticAE31Inverted phase contrast
    Scale Mettler PE 3000

    Referenties

    1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
    2. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
    3. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
    4. Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
    5. Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
    6. Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
    7. Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
    8. Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
    9. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
    10. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
    11. Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777(2013).
    12. Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
    13. Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
    14. Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
    15. Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
    16. Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
    17. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
    18. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
    19. Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160(2014).
    20. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
    21. Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
    22. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
    23. Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
    24. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
    25. Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
    26. Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
    27. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
    28. Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
    29. Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
    30. Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
    31. Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Herprints en machtigingen

    Tags

    Beenmergmacrofagenperitoneale macrofagenintraveneus immunoglobulineIL 10 productieWestern blottingcelstimulatiecytokinenanalysemuismodellen
    Beoordeling van antilichaam gebaseerde Drugs gevolgen voor lymfkliertest beenmerg en peritoneale Macrophage activering
    Neem contact met ons op
    Aanbevelen aan de bibliotheek

    Privacy

    Gebruiksvoorwaarden

    Beleidsoverzicht

    Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.