Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hele genoom Sequencing van Candida glabrata voor detectie van Markers van antischimmel drugweerstand

12.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56714

⸱

28 december 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Infectious Diseases and Microbiology-Public Health, Westmead Hospital, 2Centre for Infectious Diseases and Microbiology Laboratory Services, ICPMR, 3Marie Bashir Institute for Infectious Diseases and Biosecurity, The University of Sydney, 4Department of Microbiology and Infectious Diseases, Canberra Hospital and Health Services, Australian National University Medical School, 5Infection Management Services, Australian National University Medical School, 6Department of Microbiology and Infectious Diseases, St. Vincent's Hospital, 7Department of Infectious Diseases, Peter MacCallum Cancer Centre

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie uitgevoerd hele genoom sequencing p.a. van mutaties in genen antischimmel medicamenteuse resistentie bij Candida glabratatoekennen. C. glabrata isolaten resistent tegen echinocandins, azoles en 5-flucytosine, werden sequenced ter illustratie van de methodologie. De profielen van de gevoeligheid van de isolaten gecorreleerd met aanwezigheid of afwezigheid van bepaalde mutatie patronen in de genen.

Samenvatting

Candida glabrata kan snel het verwerven van mutaties die leiden resistentie tegen geneesmiddelen, met name voor azoles en echinocandins tot. Identificatie van de genetische mutaties is essentieel, aangezien weerstand gedetecteerd in vitro vaak kunnen worden gecorreleerd met klinische mislukking. We hebben onderzocht de haalbaarheid van het gebruik van hele genoom sequencing (WGS) voor genoom-brede analyse van antischimmel medicamenteuse resistentie bij C. glabrata. Het doel was torecognize randvoorwaarden en belemmeringen bij de uitvoering WGS en meten van de effectiviteit ervan. Dit document schetst de belangrijkste kwaliteitscontrole controlepunten en de essentiële componenten van WGS methodologie worden ingevoerd voor het onderzoeken van genetische tellers geassocieerd met verminderde gevoeligheid aan schimmelwerende agentia. Zij schat ook de nauwkeurigheid van de data-analyse en turn-around-tijd van testen.

Fenotypische gevoeligheid van 12 klinische en één ATCC stam van C. glabrata werd bepaald door antischimmel gevoeligheid testen. Deze opgenomen drie isoleren paren, van drie patiënten, die stijging van de drug minimale inhiberende concentraties ontwikkeld. In twee paren, de tweede isoleren van elke weerstand paar ontwikkeld tot echinocandins. Het tweede isolaat van het derde paar ontwikkeld weerstand tegen 5-flucytosine. De resterende bestaat uit gevoelig en azole resistente isolaten. Enkele nucleotidepolymorfisme (SNPs) in genen gekoppeld aan echinocandin, azole en 5-flucytosine weerstand werden bevestigd in resistente isolaten via WGS met behulp van de volgende generatie sequencing.  Non-synoniem SNPs in antischimmel resistentie genen zoals FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 en FCY2 werden geïdentificeerd. Globaal, een gemiddelde van 98% van de WGS leest van C. glabrata isolaten toegewezen aan het genoom van de verwijzing met ongeveer 75-fold Lees diepte dekking. De doorlooptijd en de kosten vergelijkbaar waren met Sanger sequencing.

Kortom, was WGS van C. glabrata haalbaar in klinisch significante genmutaties die betrokken zijn bij weerstand tegen verschillende antischimmel drug klassen zonder de noodzaak voor meerdere PCR/DNA sequencing reacties onthullen. Dit is een positieve stap richting van WGS vermogen in het klinisch laboratorium voor simultane detectie van antischimmel weerstand toekenning vervangingen.

Inleiding

Candida glabrata is een steeds vaker voorkomende ziekteverwekker met belang als een soort dat virusachtig weerstand aan het azoles alsmede recenter, aan de echinocandins1,2,3. In tegenstelling tot de diploïde C. albicans, kan het haploïde genoom van C. glabrata laat het verwerven van mutaties en multi drugweerstand gemakkelijker te ontwikkelen. Co weerstand aan beide klassen drug is ook gemeld4. Vandaar, vroege evaluatie van antischimmel gevoeligheid en detectie van resistentie in C. glabrata is cruciaal voor de juiste, gerichte therapie zo goed zoals in de context van antischimmel rentmeesterschap te beperken van bestuurders van antimicrobiële resistentie1 , 5 , 6. vaststelling van een efficiënte workflow te snel detecteren de aanwezigheid van confirmatieve mutaties gekoppeld aan weerstand biomarkers in resistente isolaten zal ook helpen om te verbeteren voorschrijven besluiten en klinische resultaten.

Schimmeldodende gevoeligheid wordt meestal beoordeeld door het meten van minimale remmende concentratie (MIC) die is gedefinieerd als de laagste concentratie van de drug die in een aanzienlijke daling van de groei van micro-organismen in vergelijking met die van een drugsvrije groei resulteert controle. De klinische en laboratorium Standards Institute (CLSI), Europees Comité op antimicrobiële gevoeligheid testen (EUCAST) hebben gestandaardiseerd gevoeligheid testmethoden om MIC bepaling meer accurate en consistente7, 8. Het nut van antischimmel MIC blijft echter beperkt vooral voor de echinocandins, in het bijzonder met betrekking tot de interlaboratorium vergelijkingen waar verschillende methodologieën en voorwaarden zijn gebruikte9. Er is ook onzeker correlatie van microfoons met reactie op de behandeling van de echinocandin en onvermogen om zich te onderscheiden van WT (of gevoelig) isolaten van die herbergen FKS mutaties (echinocandin-resistente stammen)10,11. Ondanks de beschikbaarheid van confirmatieve single-gen PCRs en Sanger sequencing van antischimmel-resistentie-markers, realisatie van resultaten is vaak vertraagd wegens gebrek aan simultane detectie van meerdere resistentie-merkers-5,12. Vandaar, gelijktijdige detectie van mutaties weerstand-overdracht op verschillende locaties in het genoom, ingeschakeld door hele genoom sequencing gebaseerde analyse, biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de huidige aanpak.

Hele genoom sequencing (WGS) is met succes uitgevoerd voor het bijhouden van de toezending van de ziekte tijdens uitbraken, alsmede een aanpak voor genoom-brede risico beoordeling en drug weerstand testen in bacteriën en virussen13. Recente vooruitgang in de technologie van nucleïnezuur sequencing hebben geboekt de hele genoom sequencing (WGS) van ziekteverwekkers in een klinisch bruikbare turn-around-tijd zowel technisch en economisch haalbare. DNA sequencing biedt belangrijke voordelen ten opzichte van andere methoden van pathogen identificatie en karakterisering van werkzaamheden in loondienst in microbiologie laboratoria14,15,16. Ten eerste biedt het een universele oplossing met hoge capaciteit, snelheid en kwaliteit. Sequentie kan worden toegepast op elk van micro-organismen en kan schaalvoordelen op lokaal of regionaal laboratoria. Ten tweede, het produceert de gegevens 'toekomstbestendig' vatbaar voor vergelijkingen op nationaal en internationaal niveau. Tot slot, het potentiële nut van WGS in de geneeskunde is uitgebreid door de snelle groei van openbare databanken met referentie genomen, die kunnen worden gekoppeld aan de equivalente databanken die aanvullende metagegevens voor klinische en epidemiologische17 bevatten ,18.

Recente studies hebben aangetoond dat het nut van WGS voor identificatie van antischimmel-resistentie-markers van klinische isolaten van Candida spp. 10 , 19 , 20. Dit is vooral te wijten aan de beschikbaarheid van hoge-doorvoer benchtop sequencers, gevestigde bioinformatics pijpleidingen en afnemende kosten van sequencing21,22. Het voordeel van schimmel WGS over Sanger rangschikken is dat WGS sequentiebepaling van meerdere genomen op een enkele vlucht toestaat. Bovendien kan WGS van Candida genomen nieuwe mutaties in drug targets te identificeren, genetische evolutie en opkomst van klinisch relevante sequentie-types20,22,23bijhouden. Bovenal in gevallen van intrinsieke multidrug resistentie kan WGS helpen bij de vroegtijdige opsporing van resistentie-toekenning mutaties voorafgaand aan behandeling selectie22,24.

Hier, onderzochten we de haalbaarheid van screening WGS ingeschakelde voor mutaties geassocieerd met resistentie tot verschillende klassen van antischimmel agenten. Presenteren we een methode voor de uitvoering van WGS van eindgebruikers en diagnostische mycologie laboratorium perspectieven. Wij opgenomen in deze analyse drie paren gekweekt uit drie aparte klinische gevallen in welke in vitro weerstand tegen de echinocandins en 5-flucytosine ontwikkeld na verloop van tijd na antifungale behandeling isoleren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Er was geen ethische goedkeuring vereist voor deze studie.

1. subcultuur en entmateriaal voorbereiding Candida glabrata

  1. Selecteer een paneel van C.glabrata isolaten worden bestudeerd, waaronder ten minste één C. glabrata American Type Culture collectie (ATCC) met bekende gevoeligheid patroon ook moeten.
  2. Subcultuur een isolaat door het aanraken van een enkele kolonie met behulp van een steriele wegwerp plastic lus en strepen op een Sabouraud van dextrose agar (SDA) plaat8.
  3. Incubeer de SDA plaat voor 24-48 h bij 35 ° C voor reincultuur van isolaat met goede groei.

2. Samenstellingvan antischimmel gevoeligheid

  1. Gebruik een steriele wegwerp plastic lus te halen van 4-5 kolonies van ongeveer 1 mm doorsnede uit een vers subcultured C. glabrata isoleren op SDA plaat. Resuspendeer in 3 mL steriel gedistilleerd water. Meng goed door zachte pipetteren met het oog op een uniforme schorsing.
  2. De celdichtheid aan 0.5 McFarland die gelijk is aan 1 x 10,6 tot en met 5 x 106 cellen/mL met behulp van een densitometer 8aanpassen.
  3. Gevoeligheid te testen met behulp van commerciële assay (zie tabel van materialen en reagentia) op alle C. glabrata isoleert volgens de instructies van de fabrikant. Interpreteren van de gevoeligheid van isolaten gebaseerd op resulterende microfoons van antischimmel geneesmiddelen volgens de richtlijnen van de CLSI en voor te bereiden verslag (tabel 1)8.

3. genomic DNA-extractie voor het rangschikken

  1. Resuspendeer een entoog van kolonies van een vers geteelde SDA plaat in 300 µL van 50 mM EDTA in een 1,5 mL-buis.
  2. Voeg 40 µL van zymolyase (10 mg/mL) de schorsing, en zachtjes Pipetteer 5 keer tot schorsing uniform is.
  3. Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 1-2 uur te verteren de celwand. Koel bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  4. Centrifugeer de schorsing bij 14.000 × g gedurende 2 minuten en verwijder daarna voorzichtig de bovendrijvende substantie.
  5. Uittreksel genomic DNA DNA extractie kit richtlijnen (zie tabel van materialen).
  6. Resuspendeer geëxtraheerd DNA pellet in 50 µL van 10 mM Tris Buffer (7,5-8,5 pH) in plaats van de buffer van de elutie geleverd in de kit.
  7. Controleer de zuiverheid van DNA door meting van de extinctie (Saint) op 260/280 nm25.

4. genomic DNA kwantificering

  1. Bereiden van een 1 x Tris EDTA (TE) buffer waarin de assay kit op basis van richtsnoeren van de fabrikant voor de fluorescentie-assay (zie tabel van materialen).
  2. Verdun het DNA-monster door toevoeging van 2 µL aan 98 µL 1 x TE assay buffer (eindvolume van 100 µL, verdunning factor 1:50) in een wegwerpbord 96 goed. Deze verdunning stap kan worden uitgevoerd ofwel handmatig met behulp van een meerkanaalspipet of door geautomatiseerde vloeistof verwerken werkstation.
  3. Het bereik van de normen voor te bereiden door verdunning van de lambda DNA (100 µg/mL) waarin de fluorescentie assay kit (tabel 2) en omvatten voor meting samen met monsters.
  4. Voeg 100 µL van de fluorescente kleurstof aan 100 µL verdund DNA-monsters en -normen voor de reactie. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
  5. Het meten van de fluorescentie van alle monsters op basis van richtsnoeren van de fabrikant.
  6. Uitzetten van de standaard curve met behulp van de fluorescentie-lezingen en bereken de oorspronkelijke concentratie van de DNA-monsters.
  7. Bepaal de hoeveelheid DNA en 10 mM Tris buffer (pH 8) moet worden toegevoegd aan het aanpassen van de DNA-concentratie op 0,2 ng/µL.
  8. Het uitvoeren van de DNA-verdunningen met behulp van geautomatiseerde vloeistof verwerken werkstation. Deze stap kan ook worden bereikt door handmatige pipetteren.

5. DNA bibliotheek voorbereiding

Opmerking: Bibliotheek voorbereiding en rangschikkend werden uitgevoerd na fabrikant protocollen en richtlijnen van de vennootschap (Figuur 1A) (zie tabel van materialen).

  1. Tagmentation en PCR versterking
    1. Label een nieuwe 96-Wells hard-shell dunne wand plaat.
    2. Voeg 5 µL van gekwantificeerde input DNA op 0,2 ng/µL (1 ng in totaal) op elke steekproef goed uit de plaat.
    3. 10 µL van tagmentation buffer en 5 µL van versterking buffer toevoegen aan elke goed met DNA en zachtjes Pipetteer te mengen. Het zegel van de plaat met een zelfklevende plaat zegel.
    4. Plaats de plaat in een thermische cycler en voer het volgende programma van PCR: 55 ° C gedurende 5 minuten, en houd bij 10 ° C. Wanneer het monster 10 ° C bereikt, onmiddellijk gaan neutraliseren.
    5. 5 µL van neutralisatie buffer toevoegen aan de plaat te neutraliseren van de reactie van amplicon en zachtjes Pipetteer mix. Afdichting van de plaat en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    6. Voeg toe 15 µL van het PCR mastermix om de monsters te indexeren.
    7. Gebruik een doos van index primer buizen beschikbaar voor een installatie van 96-wells-plaat formaat zodat elk monster een unieke combinatie van indexen op basis van indexsjabloon (tabel 3 wordt).
    8. De index primer buisjes in het rek plaat index (Figuur 1B) met behulp van de in de sjabloon op tabel 3 aangegeven volgorde rangschikken en de positie van de indexen op de sjabloon opnemen.
    9. Plaats de tagmentation plaat met toegevoegde PCR mastermix op het rek plaat index met de buizen van de index in volgorde.
    10. Index primer 1 buizen op verticale indeling en index primer 2 buizen in horizontale regeling op het rek index plaatsen Met behulp van een meerkanaalspipet, voeg 5 µL index inleidingen aan elk monster.
    11. Oude caps van index buizen vervangen door nieuwe caps om te voorkomen dat kruisverontreiniging tussen indexen.
    12. Afdichting van de plaat met behulp van duidelijke 96-wells-plaat sealers en uitvoeren van de tweede PCR als volgt: 95 ° C gedurende 30 s, 12 cycli van 95 ° C voor 10 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 5 minuten.
  2. PCR Schoonmaakbeurt
    1. Transfer van het PCR-product voor PCR-Schoonmaakbeurt, van de tagmentation plaat op een diep-well bord (zie tabel van materialen).
    2. Vortex de commerciële magnetische kralen-oplossing (zie tabel van materialen) op basis van de aanwijzingen van de fabrikant en 30 µL van parels naar elke PCR product uit diepe-well plaat toe te voegen.
    3. Schud de plaat op een microplate shaker bij 1800 t/min gedurende 2 minuten en zonder schudden gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
    4. Plaats de plaat op een magnetische staan gedurende 2 minuten totdat het supernatans heeft uitgeschakeld.
    5. Verwijder het supernatant zorgvuldig met de plaat nog steeds op de magnetische stand.
    6. Voeg 200 µL van vers bereide 80% ethanol met de plaat op de magnetische stand.
    7. Incubeer de plaat op de magnetische stand voor 30 s en zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant zonder verstoring van de kralen.
    8. Herhaal nogmaals stap van het wassen en laat de kralen te drogen voor 15 min. verwijderen overtollige ethanol, indien van toepassing.
    9. Verwijderen de plaat uit de magnetische stand en voeg 52.5 µL van resuspensie buffer aan de kralen.
    10. Schud de plaat op een microplate shaker bij 1800 t/min gedurende 2 minuten en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten zonder schudden.
    11. Plaats van de plaat op de magnetische stand en laat de bovendrijvende substantie om te wissen.
    12. Met behulp van een meerkanaalspipet, zorgvuldig overbrengen 50 µL van het supernatans van de cleanup-plaat een nieuwe hard-shell plaat.
  3. Bibliotheek normalisatie
    1. Ontdooi bibliotheek normalisatie reagentia volgens richtlijnen van de fabrikant (zie tabel van materialen).
    2. Breng 20 µL van het supernatant van de cleanup plaat aan een nieuwe plaat van de diep-well.
    3. Voeg 45 µL van magnetische kraal schorsing en verzegel de plaat met een plaat sealer.
    4. Schud de plaat op een microplate shaker bij 1800 rpm voor 30 min. Deze incubatietijd is essentieel en mag niet worden overschreden.
    5. Plaats de plaat op een magnetische staan gedurende 2 minuten en bevestigen dat het supernatant (Figuur 1B) heeft goedgekeurd.
    6. Verwijderen en verwijder het supernatant in een passende gevaarlijk afval container met de plaat nog steeds op de magnetische stand.
    7. Verwijderen de plaat uit de magnetische standaard en wassen van de kralen met 45 µL was buffer.
    8. Schud de plaat met was buffer op een microplate shaker bij 1800 t/min gedurende 5 minuten.
    9. Plaats plaat op magnetische stand voor 2 min en negeren supernatant wanneer duidelijk blijkt.
    10. Verwijderen de plaat uit de magnetische standaard en herhaal het wassen met wash buffer weer.
    11. Verwijder de plaat uit de magnetische stand en Voeg 30 µL van 0,1 N NaOH.
    12. De plaat met 0,1 N NaOH schudden in een roteerapparaat microplate bij 1800 t/min gedurende 5 minuten en plaats de plaat op de magnetische stand gedurende 2 minuten, of totdat de vloeistof helder is.
    13. Voeg 30 µL van elutie buffer toe aan elk putje van een nieuwe 96-Wells hard-shell dunne wand definitieve genormaliseerde bibliotheek plaat.
    14. Breng 30 µL van supernatant van normalisatie plaat aan definitieve genormaliseerde bibliotheek plaat te maken eindvolume 60 µL. De bibliotheken zijn nu klaar om te worden gesequentieerd.
  4. Bepaling van DNA bibliotheek concentratie door qPCR
    1. Ontdooi de mastermix, primers en normen waarin de qPCR kit volgens richtlijnen van de fabrikant (zie tabel van materialen).
    2. Combineer de PCR reagens mastermix en primer geleverd in de kit van de qPCR volgens de instructies van de fabrikant en aliquots kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C.
    3. Om te bepalen van de concentratie van de bibliotheek DNA, maken een verdunning van 1/8000 van de DNA-bibliotheken met behulp van 10 mM Tris buffer (pH 8) door het uitvoeren van een 1:100 verdunning (1,5 µL DNA bibliotheek aan 148.5 µL Tris buffer) gevolgd door een verdunning van 1:80 (2 µL van 1:100 aan 158 µL Tris buffer).
    4. Schud de plaat verdunning op 700 rpm voor minstens 1 min en vervolgens Centrifugeer bij 14000 × g voor 1 min.
    5. Bereid 20 µL van uiteindelijke PCR reactie door het mengen van 4 µL van verdunde DNA bibliotheek of DNA normen en 16 µL van mastermix.
    6. Uitvoeren van PCR volgende fabrikant instellingen in thermocycler: 95 ° C gedurende 5 min, 35 cycli van 95 ° C gedurende 30 s en 60 ° C voor 45 s, en definitieve 65 ° C tot 95 ° C gedurende smelt kromme analyse.
    7. De Ct-waarden van de DNA voorbeeldbibliotheken en de normen van de qPCR thermocycler verkrijgen.
    8. Een standaard curve genereren van de waarde van de Ct van de normen (Figuur 2). Het bovenste en onderste QC-bereik definiëren door ± 3 cycli van het gemiddelde. Bijvoorbeeld, als het gemiddelde Ct waarde 13 cycli is dan het QC-bereik tussen 16 en 10 cycli.
    9. De bibliotheek van de individuele en de gemiddelde concentraties (ALC) van de standaard curve en Ct waarden bepalen.
    10. Bepalen hoeveelheid totale gepoolde bibliotheken (PAL) moet worden gebruikt op basis van de berekening hieronder voor het laatste rangschikken, gezien het feit dat doel bibliotheek concentratie tussen 1,4 - 1.8 pM.
      Opmerking: Gemiddelde concentratie van de bibliotheek verkregen qPCR = ALC; Total gepoolde bibliotheken (PAL) = ALC / 2; Gedenatureerd PAL (DAL) = PAL * 0.666
      Afhankelijk van het volume van DAL die is gemengd met buffer, is de concentratie van de bibliotheek worden toegevoegd aan de stroom-cel. Bijvoorbeeld, als 65 µL van de bibliotheek wordt toegevoegd aan 835 µL van buffer, vervolgens van deze verdunning (Dil 1) 195 wordt toegevoegd aan een totaal volume van 1300 µL: (65/900) * dnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = eindconcentratie (dient tussen 1,4 - 1.8 pM)

6. bibliotheek bundelen en de initiatiefnemende Sequencing in Benchtop Sequencer

  1. Ontdooi reagens cartridge volgens de richtlijnen van de fabrikant. Neem een nieuwe cel van de stroom van het pakket van 4 ° C-opslag en breng aan kamertemperatuur atleast 30 minuten voorafgaand aan het rangschikken. Nemen buffer cartridge en prechill volgorde buffer vóór gebruik (zie tabel van materialen).
  2. Bereid een bibliotheek voor besturingselementen door het mengen van 5 µL van bibliotheek (1 nM) en 5 µL van 0,2 N NaOH. Vortex kort en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te denatureren van de bibliotheek voor besturingselementen in enkele strengen.
  3. Voeg 5 µL van 200 mM Tris-HCl, pH 7 en vortex. Voeg 235 µL prechilled volgorde buffer en meng voorzichtig. Het totale volume is 250 µL met controle bibliotheek eindconcentratie om 20 uur.
  4. Zwembad DNA bibliotheken door de overdracht van 5 µL van elke sample-bibliotheek te worden van de laatste genormaliseerde bibliotheek plaat sequenced in een enkele laag-bind 1,5 mL-buis.
  5. Voeg 30 µL van gebundelde bibliotheek en 30 µL van 0,2 N NaOH te denatureren bibliotheken in een andere laag bind buis.
  6. Vortex de lage-bind tube en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te denatureren bibliotheken in enkele strengen.
  7. Voeg 30 µL van 200 mM Tris-HCl, pH 7 aan buis met gedenatureerde bibliotheken te neutraliseren reactie.
  8. Voeg 65 µL van geneutraliseerde gedenatureerde bibliotheken schorsing en 835 µL van vooraf gekoeld volgorde buffer en vortex te goed mengen.
  9. In de buis van een definitieve lage bind combineren het volgende: 195 µL van geneutraliseerde gedenatureerde Bibliotheken, 1,30 µL van bibliotheek voor besturingselementen en 1103.70 µL van sequencing buffer. Meng goed.
  10. De definitieve bibliotheek mix (1300 µL) in de aangewezen plek op reagens cartridge laden.
  11. Set-up de volgorde uitvoeren door het invoeren van gegevens van het project en steekproef in de Sequencer aangewezen website richtlijnen volgt.
  12. Starten rangschikken volgens richtlijnen. Laad stroom cel, reagens tonercartridge met bibliotheken en buffer cartridge in benchtop sequencer.
  13. Record chargenummers van alle reagens kits en cartridges gebruikt in de volgorde.

7. gegevens downloaden van Sequencing Website

  1. Download FASTQ bestanden volgens de instructies van de fabrikant van op de website.
  2. Voor een goede kwaliteit te controleren worden uitgevoerd dat het percentage Q30 ≥ 75% en cluster dichtheid is tussen 170-280 K/mm2 met optimaal bij 200-210 K/mm2 (tabel 4).

8. sequencing Data-analyse

  1. FASTQ bestanden in gesequenceerd monsters importeren in data analyse geïntegreerd softwarepakket (zie tabel van materialen).
  2. Maak een werkstroom sequencing in software door het toevoegen van functies uit lijst namelijk trimmen, toewijzen aan referentie (Selecteer referentie genoom), lokale herschikking en variant analyse (Figuur 3A) met behulp van instellingen vermeld in tabel 5.
  3. Werkstroom uitvoeren door het selecteren van een monster of een partij van FASTQ voorbeeldbestanden en uitvoerbestanden opslaan in mappen aangewezen monster.
  4. Genereer een rapport voor volgorde dekking diepte en de toegewezen regio's lijst van structurele varianten in genoom (Figuur 3B).
  5. Lijst van structurele varianten gebruiken om te zoeken naar niet-synoniem één nucleotidepolymorfisme (SNPs) in genen overdracht van resistentie en virulentie.
  6. Verslag opstellen door een opsomming van SNP locatie gen en aantal resistente of gevoelig isolaten (tabel 6).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dertien C. glabrata bestaande uit C. glabrata ATCC 90030 en 12 isolaten van het klinische mycologie referentielaboratorium (isoleert CMRL1 naar CMRL12), Westmead ziekenhuis, Sydney werden bestudeerd (tabel 1). Deze omvatten drie paren van isolaten CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 en CMRL-5/CMRL-6 vóór en na antifungale therapie met geen epidemiologische verbanden ertussen verkregen 24 (tabel 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie bepaald haalbaarheid, geschatte tijdlijnen en nauwkeurigheid van de detectie van resistentie in C. glabrataWGS geleide. De draai rond tijd (TAT) voor de voorbereiding van de bibliotheek en sequentiebepaling was vier dagen van en rapportage over resultaten van de geanalyseerde one-two dagen. Dit vergelijkt met ten minste een vergelijkbaar bedrag TAT voor gevoeligheid testen van cultuur platen en Sanger sequencing met aanzienlijk hoger aantal monsters. Ongeveer 30-90 C. glabrata genomen kunnen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen en geen belangenconflict openbaar te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door het centrum voor infectieziekten en microbiologie, volksgezondheid. De auteurs hebben niet ontvangen geen andere financiering voor deze studie. De auteurs bedanken Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann en Ranjeeta Menon voor hun deskundig advies en hulp bij het hele genoom sequencing experiment.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DensiCHECK PlusBioMérieux IncK083536Densitometer gebruikt voor McFarland-metingen
Sensititre YeastOneTREK Diagnostic Systems, Thermo ScientificYO10Commerciële gevoeligheidstestplaat met standaard antischimmelmiddelen.
Fisherbrand wegwerp inoculatiesluizen en naaldenFisher Scientific, Thermo Fisher Scientific22-363-605Weggeef plastic lussen kunnen direct uit de verpakking worden gebruikt. Geen ontsteking vereist.
Eppendorf Safe-Lock microcentrifugebuisjesSigma Aldrich, MerckT2795   Volume 2,0 ml, natuurlijk
 
ZYMOLYASE 20T van Arthrobacter luteusMP Biomedicals, LLC8320921Gebruikt voor celwand lysis van schimmelisolaat voor
DNA-extractie
Wizard Genomisch DNA-zuiveringskit Promega A1120Doet 100 DNA-extracties
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher ScientificP7589 Picogreen reagens wordt aangeduid als fluorescente kleurstof in het protocol.
Bevat Lambda DNA-standaard en picogreen reagens voor het assay.
Nextera XT DNA-voorbereidingskit voor monstersIlluminaFC-131-1096Bevat Box 1 en Box 2  reagentia voor 96 monsters
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		Indexset A
Indexset B
Indexset C
Indexset D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2 IlluminaFC-404-2004300 cycli, Meer dan 250 monsters per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 KitIlluminaFC-404-2003300 cycli, Meer dan 130 monsters per kit
PhiX Control KitIlluminaFC-110-3001Om indices van Indexkit in volgorde te rangschikken
TruSeq Index Plate Fixture KitFC-130-1005 2 Fixtures
KAPA Library Quantification Kit
voor Next-Generation Sequencing		KAPA BiosystemsKK4824Bevat vooraf gemaakte standaarden, primers en MasterMix
Janus NGS Express Liquid handling system PerkinElmerYJS4NGSGebruikt voor DNA-dilutie tijdens sequencing
 0,8 ml OpslagplaatThermo ScientificAB0765BMIDI Plaat voor DNA-bibliotheek opruiming en
normalisatie
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881 Magneetkralen in oplossing voor bibliotheek zuivering
Magnetische Stand-96Thermo Fisher ScientificAM10027Gebruikt voor magneetkralen gebaseerde DNA-zuivering
OrbiShaker MP Benchmark ScientificBT150296-well plate shaker met 4 platforms
Hard Shell PCR PlaatBioRadHSP9601Dunne wand, 96 Well
LightCycler 480 Instrument II Roche 5015278001Past op 96 well plate
Microseal 'B' PCR Plaat Verzegeldende Film, kleefstof, optisch BioRad MSB1001Duidelijke 96-well plate sealers
CLC Genomics WorkbenchQiagenCLCBioSoftware voor data-analyse, Versie 8
NextSeq500 instrumentIllumina Illumina Benchtop Sequencer gebruikt voor next generation sequencing
```

Referenties

  1. Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
  2. Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
  3. Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
  4. Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
  5. Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
  6. Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
  7. Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
  8. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , USA. Fourth Informational Supplement (M27-S4) (2012).
  9. Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
  10. Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718(2012).
  11. Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
  12. Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
  13. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
  14. Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
  15. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
  16. Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824(2012).
  17. Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
  18. Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314(2015).
  19. Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
  20. Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
  21. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
  22. Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
  23. Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
  24. Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
  25. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  26. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
  27. Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268(2009).
  28. Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
  29. Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
  30. Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
  31. Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110(2015).
  32. de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
  33. de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
  34. Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

AntischimmelresistentieSNP detectieNext Generation SequencingDNA bibliotheekpreparatieminimale remmende concentratieFKS1 genFKS2 genCgPDR1 gen
Hele genoom Sequencing van Candida glabrata voor detectie van Markers van antischimmel drugweerstand
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.