Diepe dermale injectie als de een Model van Candida albicans infectie van de huid voor histologisch Analyses

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol waarmee histologische en moleculaire analyse van monsters van de huid na Candida albicans intradermale injectie. Dit protocol behoudt zijn de structurele integriteit van de huid en zorgt voor de lokalisatie van weefsel-ingezeten of nieuw aangeworven immune cellen, alsmede de verspreiding van de ziekteverwekker.

Samenvatting

De huid is een zeer uitgebreide orgaan van het lichaam en, als gevolg van deze grote oppervlakte, het is voortdurend blootgesteld aan micro-organismen. Huid schade kan gemakkelijk leiden tot infecties in de dermis die kan, op hun beurt in de verspreiding van ziekteverwekkers in de bloedbaan resulteren. Inzicht in hoe het immuunsysteem vecht infecties in de zeer vroeg stadium en hoe de host kunt elimineren de ziekteverwekkers is een belangrijke stap om de basis voor toekomstige therapeutische interventies. Hier beschrijven we een model van Candida albicans infectie die de processen die zich tijdens een infectie voordoen, met inbegrip van wanneer het pathogene agens is verstreken, de epitheliale barrière, evenals de immune reactie ontlokte door de C. albicans vroeg kunt visualiseren invasie. We gebruikten deze infectie model histologische analyses die aantonen dat de immuuncellen die infiltreren in de huid, evenals de aanwezigheid en de lokalisatie van het pathogene agens uitvoeren. Monsters genomen nadat de infectie kan worden verwerkt voor RNA extractie.

Inleiding

Het menselijk lichaam is bedekt met een extreem hoog aantal micro-organismen. De oppervlakte van de huid is de habitat van bijna een miljoen bacteriën per vierkante centimeter¹. Dit nummer, echter overeen niet met het volledige scala aan micro-organismen die de huid koloniseert. Naast bacteriën, is het menselijk lichaam gekoloniseerd door vele schimmel soorten, met inbegrip van C. albicans, die in staat zijn om te overleven op de mucosa en de huid niveau²is.

In de afgelopen jaren is het percentage van de mensen gediagnosticeerd met schimmelinfecties enorm toegenomen. Dat komt vooral door het hogere aantal immuungecompromitteerde personen, dat wil zeggen, HIV-positieve patiënten en patiënten die zijn gegaan door chemotherapie of Immunosuppressieve medicijnen na transplantatie³. In een surveillance studie, uitgevoerd in de Verenigde Staten, toonde Wisplinghoff et al. dat 9,5% van de nosocomiale bloedbaan infecties werden veroorzaakt door Candida soorten⁴. Als gevolg van het toegenomen voorkomen van schimmelinfecties, en met name vanwege het verhoogde percentage van Candida -soorten infecties van de bloedbaan geconstateerde, is begrijpen hoe deze ziekteverwekker ontsnapt aan de controle van het immuunsysteem zeer belangrijk.

C. albicans is een dimorphic schimmel die in verschillende morfologische vormen zoals gist, blastospores, pseudohyphae en schimmeldraden afhankelijk van de omgevingsomstandigheden^{5 groeit}. In zijn hyphal vorm, C. albicans toont van zijn hoogste capaciteit van invasiviteit en heeft de mogelijkheid om te penetreren het epitheel⁶.

C. albicans infecties zijn bestudeerd met behulp van verschillende experimentele benaderingen. Het meest voorkomende model van infectie is de intraveneuze injectie van C. albicans gist⁷. Echter houdt dit model niet rekening alle processen die gebeuren voordat de schimmel beheert te verspreiden in de bloedbaan. Een ander model maakt gebruik van de mogelijkheid van C. albicans invasie van het epithelium. Deze methode, ook bekend als het schuurpapier model⁸, werd ontwikkeld door Gaspari et al. in 1998⁹, en bestaat uit het gebruik van schuurpapier aan de huid, waardoor het stratum corneum alvorens C. albicansabrade. Deze procedure kan de schimmel te doordringen van het epitheel, waardoor de analyse van de invasieve capaciteiten van deze pathogenen. Tot slot, andere modellen van infecties voor de gastro-intestinale¹⁰ en¹¹ van de luchtwegen zijn gebruikt in verschillende studies.

De vorming van een wond (zoals in het schuurpapier model) zorgt ervoor dat de activering van verschillende opleidingstrajecten, met inbegrip van immuun cel aanwerving en activering, teneinde het helende proces¹². Dit kan veranderen of maskeren de immuunrespons specifiek ontlokte tegen de ziekteverwekker, waardoor verstorende resultaten.

Hier beschrijven we een methode van huidinfectie die eerste wond vorming vermijdt en de inductie van een basale inflammatoire omgeving. Als u wilt behouden de intact epitheliale structuur, injecteren we direct C. albicans in zijn hyphal vorm in de diepe derma. Hoewel een enkele injectie milde ontsteking uitlokken kan, het bedrag van de ontsteking is beperkt en beperkt in vergelijking tot de vorming van een open wond in de zand papieren model. De aanpak die we hier beschrijven maakt het mogelijk de studie van de immuunrespons voor schimmelinfectie en verspreiding terwijl het vermijden van de buitensporige en reeds bestaande inflammatoire omgeving veroorzaakt door mechanische schade.

Protocol

Alles wat de procedures waren goedgekeurd onder de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en geëxploiteerd onder toezicht van de Vakgroep dierlijke bronnen op kinderen's ziekenhuis (boog) in Boston Children's Hospital of goedgekeurd door de Italiaanse Ministerie van volksgezondheid en verricht op grond van de institutionele Animal Care Comité bij de Universiteit van Milaan-Bicocca.

1. C. albicans voorbereiding

1. Cultuur C. albicans, stam CAF3-1¹³, in buizen met rijke medium (gist extract pepton dextrose (YEPD), 1% (m/v) gistextract, 2% (g/v) van Bacto pepton, 2% (g/v) glucose) aangevuld met uridine (50 mg/L) bij 25 ° C. Onder deze omstandigheden groeit C. albicans als een gist.
   Opmerking: Andere stammen van C. albicans kunnen worden gebruikt, zoals de klinische isoleren C. albicans stam SC5314¹³. Aangezien wij onlangs is gebleken dat de colitis proces wordt veroorzaakt door het activeren van het aangeboren immuunsysteem¹⁴, theoretisch elke C. albicans stam die optimale zowel componenten van de celwand en structuur, alsmede de kunnen afkomstig zijn van de projecties van het hyphal, kan worden gebruikt.
2. Bewaken van de cultuur door het tellen van de cellulaire concentratie met behulp van een cel teller analyzer.
3. Oogst de cultuur als een concentratie van ongeveer 8 x 10⁶ cellen/mL wordt bereikt. Ook een spectrofotometer gebruiken voor het meten van de OD₆₀₀.
   Opmerking: Meestal een waarde van OD₆₀₀ = 1 komt overeen met een concentratie van de gist van 3 x 10⁷ cellen/mL, maar titratie wordt aanbevolen.
4. Resuspendeer de cultuur in YEPD-uridine medium, gebruik HEPES (50 mM, pH 7.5) als een buffer-agent en de cultuur bij 37 ° C voor het opwekken van schimmeldraden formatie uit te broeden. Controleer hyphal formatie onder een microscoop op 100 X vergroting. Hyphal formatie is zichtbaar 5 h na kweken bij 37 ° C; echter gebruiken de cellen 16 h na incubatie bij 37 ° C wanneer het hyphal percentage bijna 95% van de totale cultuur bereikt.
5. Als u wilt verder verrijken de voorbereiding in hyphal concentratie, centrifuge aliquots van de cultuur bij 3300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in steriele PBS bij een concentratie van 1 x 10⁸ schimmeldraden/mL.

2. diepe dermale injectie

1. 24 h prior de infectie-procedure, anesthetize van de muizen met een intraperitoneale injectie van ketamine (80-100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg), en dan scheren de flank van de muizen met behulp van een elektrische clipper.
   Opmerking: Na elke procedure waarbij anesthesie, plaatst de muizen onder een lamp verwarming totdat zij efficiënt hebben teruggekregen.
2. Rusten de muizen gedurende 24 uur om te voorkomen dat een ontsteking als gevolg van het proces van het scheren.
3. 24 uur na de ingreep scheren, anesthetize de muizen met een intraperitoneale injectie van ketamine (80-100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg).
4. Controleer de poot reflex om ervoor te zorgen dat de muizen diep zijn verdoofd. De paw reflex beoordelen door knijpen stevig de poot. Als de verdoving wordt bereikt, wordt het dier pijn niet voelen en niet beweegt.
5. C. albicans schimmeldraden in de diepe derma met een 0.3 mL insuline-injectiespuit met een naald van de 30 G x 8 mm in een eindvolume van 50 µL/injectie, overeenkomt met 5 x 10⁶ schimmeldraden/injectie te injecteren.
   1. Trek de huid van de geschoren flank strak gebruikend twee vingers om het volume rechtstreeks in de diepe derma injecteren. Plaats de naald met een hoek van 10-15° met de schuine kant van de naald naar boven.
   2. Met deze hoek, zullen het pathogene agens worden ingespoten met een diepte van ongeveer 300-500 µm. Om ervoor te zorgen dat de injectie is goed uitgevoerd, Controleer dat het geïnjecteerde volume vormt een hobbel dat is geabsorbeerd een paar minuten na de injectie.
      Opmerking: De bult gevormd na de injectie van ongeveer 1 cm²zal worden. Dit is het gebied dat op het punt van de aangewezen tijd voor moleculaire of histologische analyse zal worden verwijderd.
   3. Punten van minder dan 24 uur (aanbevolen) markeren voor tijd het gebied van infectie met een viltstift, aangezien de bult gevormd met de injectie voor een paar minuten aanhoudt, waarna het wordt geabsorbeerd. Voor de punten van de tijd van 24 uur of meer is deze stap niet vereist, aangezien een maagzweer of een cyste zal duidelijk zichtbaar zijn.

3. voorbeeld van de collectie en voorbereiding histologische kleuring

1. De muizen volgens institutionele procedures euthanaseren.
2. Met behulp van chirurgische pincet, trek de huid op de grens van de geïnjecteerde site, eerder is gemarkeerd met de marker pen. Met behulp van chirurgische scharen, accijnzen de geïnfecteerde site door het snijden van de huid na de duidelijke lijn.
   Opmerking: Wees voorzichtig te scheiden van de huid van het buikvlies via ronde tip schaar.
3. Dompel de huid in een wegwerp basis mal gevuld met optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde, met de interne kant van de huid boven. Bevriezen het monster in vloeibare stikstof totdat de verbinding wit wordt. Niet laat de vloeibare stikstof dekking van het monster, voordat het volledig is bevroren, aangezien dit het monster beschadigen zou.
   Opmerking: Let op! Draag tijdens stap 3.3, een gelaatsscherm voor bescherming tegen vloeibare stikstof.
4. Indien de monsters niet onmiddellijk worden gebruikt voor het prepareren van objectglaasjes, bewaar ze snel bij-80 ° C.
   Opmerking: Monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor onbepaalde tijd.

4. voorbereiding van de dia 's

1. Snij het monster doormidden voor te bereiden op de segmenten histologie vanaf het midden van het monster.
2. 5-µm dikke sneden met een cryostaat gesneden.
   Opmerking: Voor monsters van de huid, de temperatuur van de cryostaat mag niet hoger zijn dan-25 ° C. Een hogere temperatuur zou veroorzaken, een gedeeltelijk smelten van de H-OCT en daarom niet in de juiste positie de monsters zou worden gehandhaafd ten tijdens de procedure snijden.
3. Positief geladen Microscoop dia's gebruiken voor het verzamelen van de segmenten.
4. Als de verzamelde segmenten niet kort na de bereiding worden gebruikt, bewaar ze bij-20 ° C. Op dit punt, kunnen segmenten worden achtergelaten bij-20 ° C voor onbepaalde tijd.

5. de haematoxyline en eosine-kleuring

1. Vlek van de dia's door onderdompeling in Gill Haematoxyline voor 4 min. Wash de dia's in stromend kraantjeswater voor 5 min.
2. Vlek van de dia's door onderdompeling in eosine Y oplossing voor 1 min. Wash de dia's in stromend kraantjeswater voor 5 min. spoelen de dia's met behulp van gedestilleerd water voordat u doorgaat het protocol.
3. Uitdrogen door onderdompeling in serieel toenemende concentraties van ethanol oplossingen (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Onderdompelen van de dia's voor 15 s in elke oplossing van ethanol.
4. Hiermee schakelt u de dia's gedurende ten minste 2 minuten door onderdompeling in een histologisch clearing-agent.
5. Monteer de dia's met behulp van montage medium en omslag enten.
6. Verwerven van beelden van de dia's met een Microscoop dia scanner bij een 40 X vergroting.

6. periodieke Acid-Schiff (BK) kleuring

1. Herstellen van de dia's met ≥99.5% aceton bij kamertemperatuur voor 1 min. Wash de dia's in stromend kraantjeswater voor 1 min.
2. Vlek dia's in 3 wijzigingen van gedestilleerd water door onderdompeling in periodieke zure oplossing (1 g/dL) gedurende 5 minuten wassen met de dia's.
3. Vlek van de dia's door onderdompeling in Schiff van reagens voor 15 min. Wash de dia's in stromend kraantjeswater voor 5 min.
4. Vlekken van de dia's door onderdompeling in Gill Haematoxyline 5 min. wassen de dia's in stromend kraantjeswater voor 30 s.
5. Het uitdrogen van de dia's door onderdompeling in 3 wijzigingen van 100% ethanol. Onderdompelen van de dia's voor 15 s telkens.
6. Hiermee schakelt u de dia's gedurende ten minste 2 minuten door onderdompeling in een histologisch clearing-agent.
7. Monteer de dia's met behulp van montage medium en omslag enten.
8. Verwerven van beelden van de dia's met een Microscoop dia scanner.

7. voorbeeld van de collectie en voorbereiding van RNA extractie

1. De muizen volgens institutionele procedures euthanaseren. Verwijder de huid monsters zoals in stap 3.2.
2. Dompel de monsters in een tube module-cap 2 mL met 1 mL reagens voor zure guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie.
   Opmerking: Het protocol hier kan worden onderbroken en de monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C.
3. Snij het monster in stukken van ongeveer 0,2 cm² met behulp van chirurgische pincet.
   Opmerking: Let op! De meeste van de reagentia voor RNA isolatie zijn giftig en mutagene. Stap 7.3 en 7.4 moet gebeuren onder een zuurkast.
4. Het monster Smash met een kraal molen met een snelheid van 20 oscillaties/s voor 20 min. alternatief, een mechanische potter kan worden gebruikt.
5. Controleer de effectieve homogenisering van de monsters door op zoek naar de aanwezigheid van intact stukken van huid. Herhaal deze stap als de monsters zijn niet volledig gehomogeniseerd.
6. Centrifugeer de monsters bij 16.000 x g gedurende 1 min. houden het supernatant voor RNA extractie en gooi de pellet. Deze stap wordt uitgevoerd om te elimineren haar en vuil dat de extractie-kolommen kan blokkeren.
7. Doorgaan met RNA extractie met behulp van RNA zuivering kolommen¹⁴.
8. Het gebruik van een spectrofotometer RNA reiniging en concentratie te beoordelen. Als RNA extracten niet onmiddellijk voor cDNA voorbereiding gebruikt worden, slaan de monsters bij-80 ° C.

Resultaten

Door de injectie van het pathogene agens rechtstreeks in de diepe derma blijft de structurele morfologie van het weefsel intact (figuur 1A).

De handhaving van de structurele integriteit van de huid kan de detectie van immune cellen en hun lokalisatie op de site van infectie. De hogere vergroting weergegeven in figuur 1B onthult dat het abces bestaat voornamelijk uit pol...

Discussie

Hier beschreven we een methode van C. albicans infectie te bestuderen van het inflammatoire proces dat wordt gestart bij de ingang van de schimmel in de diepe derma.

Hoewel huid abces formatie een relatief zeldzame gebeurtenis op C. albicans infectie^{15 is}, kan injectie van de schimmel direct in de diepe derma niet alleen de studie van fungale gestuurde abces vorming, maar ook de analyse van specifieke immune cellen die deel uitmaken van bevatten schimm...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound	histo-line laboratories	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic	histo-line laboratories	09-209-05
Ethanol absolute	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, mounting medium	bio-optica
Acetone	sigma-aldrich	179124
PAS staining system	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxisch, corrosief en mutageen. Gebruik alle benodigde voorzorgsmaatregelen
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
liquid nitrogen			Draag oogbescherming
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle	BD	324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable	histo-line laboratories	2781
Positively charged bio microscope slides	bio-optica	09-2000
Cover slips 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998