Isometrische Contractility meting van de muis mesenterische slagader met behulp van draad Myography

Samenvatting

De draad myograph techniek wordt gebruikt om vasculaire vlotte spier functies en de scherm nieuwe drugs te onderzoeken. Wij rapporteren een gedetailleerd protocol voor het meten van de isometrische contractility van de muis mesenterische slagader en voor het screenen van de nieuwe skeletspierrelaxantia van vasculaire glad spierweefsel.

Samenvatting

De techniek van de myograph draad wordt gebruikt ter beoordeling van de contractility van vasculaire gladde spieren in reactie op de depolarisatie, GPCR agonisten/remmers en drugs. Het wordt wijd gebruikt in vele studies op de fysiologische functies van vasculaire gladde spieren, de pathogenese van vasculaire ziekten zoals hypertensie, en de ontwikkeling van gladde spieren comfortabel drugs. De muis is een veelgebruikt model dier met een grote pool van ziekte modellen en genetisch gemodificeerde stammen. Introduceerden we deze methode voor het meten van de isometrische contractie van de mesenterische slagader muis in detail. Een 1.4-mm segment van muis mesenterische weerstand slagader was geïsoleerd en gemonteerd op een myograph kamer door twee stalen draden via haar lumen. Na evenwichtsinstelling en normalisatie stappen, was het schip segment Potentiation door een oplossing van de hoog-K⁺ tweemaal vóór de bepaling van de contractie. Als een voorbeeld van de toepassing van deze methode in Geneesmiddelenontwikkeling, we het comfortabel effect van een nieuwe natuurlijke stof, neoliensinine, geïsoleerde van een Chinees kruid, embryo's van als het zaad van de lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) gemeten op muis lymfklieren slagaders. De segmenten van de schip gemonteerd op de kamer van de myograph werden gestimuleerd met een high-K⁺ -oplossing. Wanneer de kracht spanning een stabiele duurzame fase bereikt, werden cumulatieve dosissen van neoliensinine toegevoegd aan de kamer. We vonden dat neoliensinine een dosis-afhankelijke comfortabel effect gehad op gladde spiercontractie, zo suggereert dat het draagt potentiële activiteit tegen hypertensie. Bovendien, zoals het schip segment kan ten minste 4 uur na montage overleven en onderhouden van contractility geïnduceerd door de high-K⁺ -oplossing voor vele malen, wij stellen voor dat kan de draad myograph systeem worden gebruikt voor het tijdrovende proces van drug screening.

Inleiding

Het klein schip myograph systeem hier gebruikt was voor het meten van de isometrische contractie van kleine weerstand vaartuigen met een interne diameter variërend van 100 tot 400 µm. geïsoleerde kleine vaartuigen (ongeveer 2 mm lang) zijn ingevoegd door twee 40-µm diameter draden en waren toen gemonteerd op de micrometer-side en transducer-side kaken opeenvolgend. Deze techniek van de myograph was eerst voorgesteld in 1972¹ en vervolgens ontwikkeld voornamelijk door Mulvany en zijn collega's^2,3,4,5,6. Het is nu een volwassen techniek met stabiele uitrusting, gemakkelijk prestaties en een standaard normalisatie procedure^7,8,9. We gebruikt deze methode met een aantal wijzigingen voor metingen in de mesenterische slagader van de muis.

Vasculaire glad spierweefsel lijnen de muren van bijna alle bloedvaten. Hun fundamentele functie is het genereren van krachten door contractie in reactie op verschillende stimuli. De normale contractility van vasculaire glad spierweefsel is essentieel voor de verordening van de bloeddruk en voeding aanvullen¹⁰. Abnormale regulering van bloeddruk resultaten in een verscheidenheid van ziekten zoals hypertensie, hartfalen en ischemie. Verschillende studies hebben gesuggereerd dat abnormale bloeddruk altijd gekoppeld aan disfunctionele vasculaire gladde spieren contractility^{7,11,12,13 is}. De methode myograph kunt onderzoek van isometrische contractility van muis vaartuigen geïnduceerd door verschillende stimuli met inbegrip van vasoconstrictors, remmers en drugs. Succesvolle metingen van contractie zal helpen ons te begrijpen van de mechanismen voor onderhoud van de bloeddruk en de pathogenese van vasculaire glad spierweefsel-geassocieerde ziekten en verkennen van nieuwe therapeutische benaderingen.

Vele Chinese kruiden hebben op grote schaal gebruikt voor de klinische behandeling van vasculaire ziekten; hun effectieve ingrediënten blijven echter meestal onbekend. Isolatie en identificatie van de effectieve componenten is dus zeer belangrijk voor de ontwikkeling van nieuwe medicijnen. Multi draad myograph-technologie biedt een eenvoudige benadering voor het screenen van actieve bestanddelen in kruiden. We hebben verschillende studies met behulp van het systeem van de myograph klein schip te onderzoeken muis mesenterische slagader contractie gemeld en natuurlijke verbindingen geïdentificeerd met anti-hypertensie activiteit^12,13,14. Hier beschrijven we de gedetailleerd protocol voor de myograph-methode en beoordelen het comfortabel effect van neoliensinine geïsoleerd van embryo's van zaad van de lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) ¹⁴.

Protocol

Dierlijke manipulaties werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Model Animal Research Center van Nanjing universiteit.

1. oplossing voorbereiding

1. Bereid HEPES-Tyrode-oplossing (H-T) met behulp van 137.0 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-glucose en 10 mM HEPES, pH 7,3-7.4.
2. Bereid HEPES-Tyrode oplossing zonder calcium (Ca^{2 +}-H-T gratis) met behulp van 140.6 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-glucose en 10 mM HEPES, pH 7,3-7.4.
3. Bereid HEPES-Tyrode oplossing met behulp van 124 mM KCl (hoge K⁺) met behulp van 15.7 mM NaCl, 124.0 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂∙6H₂O of D-glucose, en 10 mM HEPES, pH van 5,6 mM 7.3-7.4.

2. experiment voorbereiding

1. Verwarm de H-T en High-K⁺ -oplossingen met behulp van een waterbad 37 ° C.
2. Schakel het myograph systeem, data acquisitie hardware en computer.
3. Zorgvuldig Vul alle myograph kamers met 5 mL van H-D oplossing.
4. Vul twee petrischaaltjes met 20 mL 4 ° C H-T en Ca^{2 +}-gratis H-T oplossingen, respectievelijk, en op te slaan op het ijs.
5. Vul een 10-cm gecoat petrischaal met 20 mL H-T oplossing, en onderhouden bij kamertemperatuur.

3. muis mesenterische slagader dissectie

1. Een 8-12-week-oude C57BL/6J vrouwelijke of mannelijke muis door cervicale dislocatie euthanaseren. Pins de muis naar beneden met haar buik naar boven.
2. Bevochtig de buik met 70% ethanol. Knip de huid met een schaar langs de ventral midline van de lies, en vervolgens Maak insnijdingen vanaf het begin van de eerste snede naar beneden naar de benen aan beide zijden. Trek de huid terug aan beide zijden; Maak soortgelijke insnijdingen te openen het buikvlies.
3. Met behulp van schaar, snij de slokdarm, de dikke darm en andere bindweefsels volledig isoleren het maag-darmkanaal met het voeden van therapieën uit het lichaam.
4. Met een tang, de geïsoleerde segment naar de schotel met het koude H-T bereid in stap 2.4 en voorzichtig spoelen het weefsel in H-T oplossing meermaals te wassen uit het bloed te verplaatsen.
5. Breng het geïsoleerde segment in de gecoate petrischaal bereid in stap 2.5 en uitvoeren van de mesenterische slagader dissectie bij kamertemperatuur.
6. Gladstrijken van de maag, jejunum, ileum en caecum in een richting van de klok, en de maag en het caecum pin aan de linker- en rechter kant, respectievelijk.
7. Rekken van de mesenterische therapieën bed en monteren van de darm met pinnen om de ontleed mesenterische slagaders bloot te stellen.
   Opmerking: Onder deze omstandigheden, de slagaders zijn op de top van de aderen.
8. Zet de lichtbron van de transmissie van een stereoscopische Microscoop, en ontleden slagaders onder de Microscoop. Zorg ervoor dat het hele weefsel in de oplossing is ondergedompeld.
9. Het vetweefsel rond de slagaders klem met pincet en isoleren van de slagaders door het afsnijden van alle het bindweefsel met een dissectie schaar. Vermijd verwonden van de slagaders.

4. arteriële montage

1. Overdracht en de mesenterische slagader boom onder te dompelen in de koude Ca^{2 +}-vrije H-T oplossing (bereid in stap 2.4) door de overtollige slagaders klemmen met een tang.
2. Een 1.4-mm-deel van de slagader proximale aan de darmwand van een mesenterische arcade afgesneden, en twee pincet kunt openen van beide zijden van dit segment van de slagader zorgvuldig.
3. Bereiden van twee segmenten van roestvrij staaldraad 2.5 cm in lengte, en plaats ze in de dezelfde schotel.
4. Zachtjes klem één uiteinde van de slagader met behulp van Tang, en zorgvuldig steek twee draden in het lumen van de slagader één voor één met hulp van een ander pincet. Ervoor dat de draden rechtdoor blijven en raak niet het endotheel.
5. Met behulp van twee pincet, de twee stalen draden tegelijk buiten het schroefdraad vaartuig klem en zorgvuldig het schip van de petrischaal overbrengen naar een kamer van de myograph eerder gevuld met H-T oplossing (stap 2.3).
6. Schroef de kaken uit elkaar om ruimte voor montage te maken. Klem van beide zijden van één van de twee ingevoegde draden met behulp van twee pincet en plaats van het vaartuig in de kloof van de kaak (figuur 1A).
7. Wrap van beide zijden van de geklemd draad rond schroeven van de kaak aangesloten op de micrometer (figuur 1B).
8. Bevestigen de linker schroef door te draaien met de klok mee. Strek de draad die rechtse pincet gebruiken, dan oplossen van de rechtse schroef door te draaien met de klok mee (Figuur 1 c). Zorg ervoor dat het schip altijd binnen de kloof van de kaak is, maar raak niet aan de kaak om schade voorkomen.
9. Sluit de twee kaken met behulp van de micrometer (Figuur 1 d). Zorg ervoor dat de twee kaken dicht genoeg zijn, maar dat ze niet raken elkaar en dat de losse draad op de bovenkant van de vaste draad.
10. Met behulp van de rechter Tang, zorgvuldig vouwen van de olieaftapslang draad op de hoek van de bek aangesloten om te dwingen transducer en wikkel het rond de rechterkant schroef (figuur 1E) met de klok mee. Vervolgens de schroef vast te stellen. Herhaal deze stap aan de linkerzijde van de draad en monteren van de schroef aan de linkerkant (figuur 1F).
11. Verplaats de kaken iets uit elkaar door het zorgvuldig draaien de micrometer (figuur 1G). Te voorkomen dat zich uitstrekt van het vaartuig. Pincet gebruiken om de draad aan de zijkant micrometer naar het horizontale vlak van de draad aan de kant van de omvormer. Zorgvuldig draai de micrometer zo dat de kloof tussen de twee kaken is alleen geschikt voor de twee draden.
12. Herhaal stap 4.2 – 4.11 monteren van de slagaders naar de andere kamers. Sluit alle de kamers aan de apparatuur, betrekking hebben op de kamers, de zuurstoftoevoer van 100% en een temperatuursonde koppelen en start verwarming tot 37 ° C. Open de charting software en druk op de knop Start op het Diagram venster om te beginnen met opnemen.
13. Equilibreer gedurende ongeveer 20 minuten.

5. normalisatie

Opmerking: Oog op de standaardisering van de experimentele omstandigheden en verkrijgen van betrouwbare fysiologische respons van vaartuigen, een normalisatie-procedure is noodzakelijk¹⁵. Volgens de relatie tussen de actieve kracht en interne omtrek van het vaartuig heeft de wire myograph systeem een standaard normalisatie-programma voor de beoordeling van de interne omtrek (IC) van de gemonteerde vaartuig^5,-^{8, 9}. Output kort, kracht, dat wil zeggen, rust muur spanning (mN/mm), als de Y-waarde te berekenen van IC (µm), lees de micrometer en invoergegevens naar de waarde als de X-waarde en de transducer. Het programma zal een ingerichte curve van (X, Y) terug en berekenen van de IC overeenkomt met een Transmurale druk van 100 mmHg (IC₁₀₀). Het schip is ingesteld op de genormaliseerde interne omtrek (IC₁) wanneer de actieve responsiviteit maximale is.

1. Krachten ingesteld op nul voor alle kanalen op het apparaat en equilibreer gedurende een ander 1-2 min.
2. Selecteer instellingen voor normalisatie van de "DMT menuen de parameters als volgt instellen:
   Oculair kalibratie (mm/div): 0,36; Target druk (kPa): 13.3; IC-₁/IC₁₀₀: 0.9; Online gemiddeld tijd (seconden): 2; Vertraging van de tijd (seconden): 60. Klik op de knop OK om het venster van de DMT normalisatie-instellingen te sluiten.
3. Selecteer het kanaal van belang in het menu van de DMT een DMT normalisatie venster voor het desbetreffende kanaal te openen. De constante waarden invoeren in het venster als volgt: weefsel eindpunten a1: 0,1; Weefsel eindpunten a2: 4; Diameter van de draad (µm): 40. Het venster bevat de berekende scheepslengte als 1,40 mm.
4. Lees de micrometer van de juiste weefsel kamer. Voer de waarde in het vak lezen van Micrometer en op Punt toevoegen knop. Deze waarde is de aanvankelijke waarde van X (X0). Na een 60 s vertragingstijd toont het venster de kracht en de effectieve druk (ERTP) die overeenkomt met deze waarde micrometer. Tegelijkertijd wordt het vak lezen van Micrometer actief.
5. Het vaartuig wordt genormaliseerd door te draaien aan de micrometer in een tegenwijzerzin rekken. De micrometer-waarde invoeren in het vak lezen van Micrometer en op Punt toevoegen knop. Wachten op een vertraging van 60 s weer.
6. Herhaal stap 5.5, blijven rekken van het vaartuig en micrometer waarden toevoegen totdat het venster wordt weergegeven de waarde van "Micrometer X₁", dat de instelling van de berekende micrometer vereist is te rekken van het schip naar de IC-₁.
7. Stel de micrometer aan X₁ waarde.
   Opmerking: De genormaliseerde spanning is meestal 1-2 mN.

6. slagader contractie opname

Opmerking: Alle oplossingen, met inbegrip van H-T en High-K⁺ -oplossing gebruikt bij deze sectie, werden opgesteld in stap 2.1.

1. Na normalisatie, equilibreer het vaartuig in de zaal gedurende 15-20 minuten.
   Opmerking: Dit is geen behoefte om te veranderen van de oplossing in deze stap.
2. Daag het vaartuig met High-K⁺ oplossing tweemaal.
   1. Om de uitdaging van het vaartuig, door H-D oplossing te vervangen door 5 mL High-K⁺ -oplossing voor het opwekken van de contractie gedurende 10 minuten, gevolgd door wassen met 5 mL van de oplossing van de H-D 3 - 4 keer.
      Opmerking: Typische samentrekking heeft een maximale kracht over 3 mN en een constante duurzame kracht rond 2.5 mN¹². Als de aanhoudende kracht met de tijd vermindert, de eerste uitdaging een maximale kracht onder 2.5 mN genereert of de tweede uitdaging een veel lagere kracht dan de eerste dosis genereert, wordt het schip verwijderd en zal niet gebruikt worden voor verder onderzoek.
3. Daag het vaartuig met 5 mL High-K⁺ -oplossing voor het opwekken van contractie. Na 5 min, voeg toe 0,5 µL van de stockoplossing (10 mM in DMSO) neoliensinine¹⁴ in de kamer om te ontspannen van het vaartuig op een eindconcentratie van 1 µM neoliensinine.
4. Wanneer de kracht is stabiel (dit duurt meestal enkele minuten), een andere 0,5 µL van de stockoplossing van neoliensinine in de kamer te verhogen de concentratie tot 2 µM. Voeg 1 µL van de stockoplossing telkens tot verhoging van de concentratie op 4, 6, 8 en 10 µM voor het genereren van t toevoegen Hij dosis-responscurve.
   Opmerking: De voorraad en de werkende concentraties verschillen tot drugs.

Resultaten

Wij de isometrische contractility van muis mesenterische slagader met behulp van een multi-draad myograph systeem gemeten en beoordeeld het comfortabel effect van neoliensinine gezuiverd van embryo's van zaad van de lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) ¹⁴. de slagader van de mesenterische weerstand muis was geïsoleerd, gezuiverd van bindweefsel en snijd in 1.4-mm segmenten. De slagader segment is ingevoegd door twee stalen draden in Ca^{2 +}-vrije H-T ...

Discussie

Hypertensie is een wijdverspreide volksgezondheid uitdaging vanwege de ernstige complicaties, met inbegrip van cardiovasculaire en nier-ziekten¹⁶. Begrijpen van de pathogenese van hypertensie en verkennen meer anti-hypertensieve drugs is geworden een dringende taak op dit gebied. Bloeddruk wordt gegenereerd en onderhouden door de perifere weerstand van het verkeer. Volgens Poiseuille van de wet, de relatief kleine slagaders genereren een groot deel van de bloedsomloop weerstand en dienen als de do...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Multi wire myograph system	DMT	610-M
Roestvrij staaldraad	DMT	400447
Geuder dissectieschaar	DMT	400431
Dumont pincet	DMT	300413
PowerLab/8SP	ADInstruments	ML785
Software	ADInstruments	LabChart 5
NaCl	SigmaAldrich	S5886
KCl	SigmaAldrich	P5405
CaCl2	SigmaAldrich	C4901
MgCl2·6H2O	SigmaAldrich	M2393
D-Glucose	SigmaAldrich	G6152
HEPES	Sangon Biotech	A100511-0250
NaOH	SigmaAldrich	S8045
DMSO	SigmaAldrich	D2650