Methodenartikel

Long fixatie onder constante druk voor de evaluatie van emfyseem bij muizen

DOI:

10.3791/58197

⸱

26 september 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Pharmaceutical Planning Group, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier gepresenteerd is een nuttig protocol voor Long fixatie die een stabiele aandoening creëert voor histologische evaluatie van Long specimens uit een muismodel van emfyseem. Het belangrijkste voordeel van dit model is dat het veel longen met dezelfde constante druk kan oplossen zonder longcollaps of deflatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Emfyseem is een belangrijk kenmerk van chronische obstructieve longziekte (COPD). Studies met een emfysemateuze muismodel vereisen een optimale Long fixatie om betrouwbare histologische specimens van de longen te produceren. Vanwege de aard van de structurele samenstelling van de longen, die grotendeels uit lucht en weefsel bestaat, bestaat het risico dat het tijdens het fixatie proces instuilt of leegmaakt. Er bestaan verschillende Long fixatie methodes, die elk zijn eigen voor-en nadelen hebben. De Long fixatie methode die hier wordt gepresenteerd, maakt gebruik van constante druk om optimale weefsel evaluatie mogelijk te maken voor studies met een emfysemateuze muis Long-model. Het belangrijkste voordeel is dat het in één keer veel longen met dezelfde aandoening kan oplossen. Long specimens worden verkregen uit chronische sigarettenrook blootgestelde muizen. Long fixatie wordt uitgevoerd met behulp van gespecialiseerde apparatuur die de productie van constante druk mogelijk maakt. Deze constante druk handhaaft de longen in een redelijk opgeblazen toestand. Zo genereert deze methode een histologisch monster van de longen dat geschikt is om door sigarettenrook veroorzaakte milde emfyseem te evalueren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

COPD is een van de leidende wereldwijde oorzaken van overlijden1. Sigarettenrook is de belangrijkste oorzaak van COPD, maar de mechanismen van pathogenese blijven niet volledig gedefinieerd. COPD toont twee hoofdkenmerken, waaronder progressieve beperking van de luchtstroom en een abnormale ontstekingsreactie van de longen. Emfysemateuze stoornis treedt vaak op in de longen van COPD-patiënten2. De pathologische bevindingen van emfyseem worden gekenmerkt door alveolaire wand vernietiging3. Er zijn verschillende diersoorten gebruikt voor het genereren van COPD-modellen in vivo (d.w.z. honden, cavia's, apen en knaagdieren)4. Echter, de muis is uitgegroeid tot de meest gebruikte in de bouw van COPD modellen. Dit heeft vele voordelen, met inbegrip van de lage kosten, het vermogen om genetisch gemodificeerd, uitgebreide genoominformatie beschikbaarheid, beschikbaarheid van antilichamen, en het vermogen om een verscheidenheid van muis stammen gebruiken5. Momenteel is er geen muismodel dat de volledige kenmerken van menselijke COPD kan nabootsen; individuele onderzoekers moeten dus kiezen welk model het meest geschikt is voor het specifieke COPD-onderzoek6. De emfysemateuze muismodel is een van de vele COPD Muismodellen die momenteel beschikbaar zijn. Aanvullende modellen omvatten de exacerbatie muismodel, systemische co-morbidities model, en COPD susceptibiliteit model7.

Het emfysemateuze muismodel kan worden gegenereerd door verschillende soorten exogene agentia, waaronder chemische agentia en blootstelling aan sigarettenrook4. Chemische blootstelling (bv. aan elastase) produceert een ernstig type emfyseem, terwijl sigarettenrook resulteert in milde emfyseem8,9. Sigarettenrook wordt verondersteld de belangrijkste oorzaak te zijn voor de pathogenese van COPD; Daarom is de keuze van sigarettenrook als middel om een COPD-muismodel te creëren redelijk10. Veel studies hebben sigarettenrook gebruikt om emfyseem in de muis te maken. Zo heeft Nikula et al. met succes een emysemateuze muismodel gemaakt van B6C3F1 vrouwelijke muizen door ze bloot te stellen aan sigarettenrook gedurende 7 of 13 maanden11. We hebben ook een emysemateuze muismodel ingesteld via senescentie marker proteïne/SMP-30 KO muizen12. Het is cruciaal om een Long fixatie methode uit te voeren die dit milde emfyseem-model door blootstelling aan sigarettenrook goed kan visualiseren.

Er zijn verschillende methoden voor Long fixatie vastgesteld13. Er is echter geen gouden standaardmethode voor longweefsel fixatie voor het evalueren van emfyseem14. Verschillende studies van dit Lab hebben aangetoond dat het hier gepresenteerde fixatiesysteem nuttig is door een stabiele conditie te creëren voor het evalueren van emfyseem12,15,16,17,18. Het belangrijkste voordeel van het huidige systeem is dat het veel longen met dezelfde aandoening in één keer kan repareren zonder longcollaps of deflatie. Het huidige Long fixatiesysteem gebruikt een aantal speciale apparatuur waarmee Long specimens gedurende een bepaalde periode kunnen worden opgeblazen bij een geschikte constante druk. Deze speciale uitrusting bestaat uit drie delen, waaronder een onderste container, bovenste container en pomp. Long specimens worden in de onderste container geplaatst die is verbonden met bevestigingsmiddelen onder druk, wat resulteert in een 25 cmH2O drukverschil in het niveau van de agentia tussen de bovenste en onderste containers19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volgende methodes zijn goedgekeurd door de Dierenzorg-en gebruiks comités van Juntendo University School of Medicine. De richtlijnen voor een goed verloop van dierproeven, de wetenschapsraad van Japan, 1 juni 2006 werden opgevolgd. Er zijn drie belangrijke stappen in deze methode: 1) muis dissectie, 2) Long exsanguination, en 3) fixatie van Long weefsels bijgestaan door gespecialiseerde apparatuur. Meestal worden Long specimens verwerkt tot inbed ting na 48 h fixatie12,15,16,17,18.

1. sectie van de muis

  1. Meet het lichaamsgewicht van de muis en bepaal vervolgens de hoeveelheid pentobarbital die u wilt toedienen.
  2. Injecteer pentobarbital intraperitoneaal met een dosering van 70 mg/kg lichaamsgewicht en bevestig anesthesie door de afwezigheid van reactie op Teen pinch.
  3. Injecteer de naald in een hoek van 45 ° tot deze door de huid en spieren dringt. Trek de zuiger en bevestig een lucht vacuüm, Injecteer vervolgens de pentobarbital.
  4. Bevestig anesthesie door de afwezigheid van reflex beweging.
    Opmerking: het gebruik van verdoofd Mouse in tegenstelling tot een geëgaliseerd muis wordt aanbevolen voor volledig Long exsanguination.
  5. Snijd de muis huid en buikspieren op de mediale lijn, gericht op de kopborststuk gebied.
  6. Snijd lateraal om een bredere werkruimte te bieden.

2. Long van

  1. Stel de membraan laag bloot en prik het met een tang.
  2. Open de thoracale ruimte en snijd het borstbeen gebied, waardoor de longen en het hart duidelijk kunnen worden gezien.
  3. Snijd het hart in linker atrium en rechter ventrikel.
  4. Plaats een canule (24 G) in het rechter ventrikel gebied en breng deze naar de kopse zone totdat deze de longslagader bereikt, zoals weergegeven in Figuur 1.
  5. Zet de pomp aan en laat de 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) circuleren (ongeveer 200 mL/h) totdat alle longweefsel verandert in een witte kleur.

3. fixatie van longweefsel

  1. Verwijder de luchtpijp, longen en het hart.
  2. Vrij alle drie organen door het snijden van de omringende bindweefsels.
  3. Bind de rechter hoofd bronchus met een hechtdraad en snijd alle lobben van de rechter long.
  4. (Optioneel): de lobben van de rechter long bestaan uit vier delen. Snijd deze delen van de rechter hoofd bronchus en verdeel de onderdelen voor verwerking als bevroren weefselmonsters.
  5. Steek het hart en de lobben van de linker long in de bevestigingsmiddelen, gelegen in een 10 mL spuit.
    Let op: bevestigingsmiddelen zijn gevaarlijk. Draag de juiste beschermende uitrusting (bijv. lange rubberen handschoenen) en werk in een goed geventileerde ruimte.
  6. Maak een vacuümtoestand met een 10 mL spuit om de longen op te blazen, zoals weergegeven in Figuur 2.
  7. Plaats een canule (20 G) in de luchtpijp en bind een knoop.
  8. Blaas de longen op met bevestigingsmiddelen om te controleren op lekken, met behulp van een 1 mL spuit.
  9. Overbrengen naar drukapparatuur voor de Long fixatie, zoals afgebeeld in Figuur 3.
  10. Na het bevestigen van de perioden, verwijder het Long monster koppel de luchtpijp af met een knoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals eerder beschreven, kunnen de gespecialiseerde apparatuur, die een uitgebreide constante druk genereert, worden onderverdeeld in drie delen (Figuur 3A). Het onderste deel is het punt waarop het Long monster moet worden ingevoegd (Figuur 4A). De longen worden via een canule (20 G) op de punt van formaline flow aangesloten met behulp van een drieweg stop Haan (Figuur 4B). Er word...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier gepresenteerde fixatie procedure voor knaagdieren longen is niet nieuw; Dit systeem heeft echter verschillende voordelen. Ten eerste, het kan veel longen (maximaal 20) met dezelfde aandoening in één keer te repareren. De vereniging van Toxicologic pathologie stelt dat de druk voor zwaartekracht instillatie variëren van 22 – 25 cmH2O22. Met name, verschillende studies hebben uitgevoerd Long fixatie bij een druk van 25 CMH2O13,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende belangen om te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd deels gesteund door JSPS KAKENHI Grantnummer 26461199 (T. Sato) en het Instituut voor milieu-en genderspecifieke geneeskunde, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato). De Funder had geen rol in het ontwerp van de huidige methodes en bij het schrijven van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% formaline (formaline neutral buffer oplossing)Wako060-01667
Gebogen pincetHammacherHSC187-11
Canule, maat 20GTerumoSR-FS2032
Canule, maat 22GTerumoSR-OT2225CCanule om long te exsanguineren
PincetHammacherHSC184-10
KimdoekNippon Paper Crecia (Kimberly Clark)61000
KimwipeNippon Paper Crecia (Kimberly Clark)62011
Onderste container (acrylglas materiaal)Tokyo ScienceOp maat gemaaktDrukapparatuur component
RollerpompNissin Scientific CorpNRP-75Pompmachine om long te exsanguineren
Rollerpomp RP-2000Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd)160200Drukapparatuurpomp
Siliconen slang Ø 9 mmSansyo94-0479Drukapparatuur component
Somnopentyl (64,8 mg/mL)Kyoritsu SeiyakuSOM02-YA1312Pentobarbital Natrium
Chirurgisch schaarHammacherHSB014-11
Hechtdraad, maat 0NescosutureGA01SW
Spuit, 1 mLTerumoSS-01T
Spuit, 1 ml met naaldTerumoSS-01T2613S
Spuit, 10 mLTerumoSS-10ESZ
Drieweg stopkraanTerumoTS-TR1K01
Bovenste container (acrylglas materiaal)Tokyo ScienceOp maat gemaaktDrukapparatuur component

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease 2017 report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Pauwels, R. A., Rabe, K. F. Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Lancet. 364 (9434), 613-620 (2004).
  3. Spurzem, J. R., Rennard, S. I. Pathogenesis of COPD. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 26 (2), 142-153 (2005).
  4. Vlahos, R., Bozinovski, S., Gualano, R. C., Ernst, M., Anderson, G. P. Modelling COPD in mice. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 12-17 (2006).
  5. Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clinical Science (Lond). 126 (4), 253-265 (2014).
  6. Stevenson, C. S., Belvisi, M. G. Preclinical animal models of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Expert Review of Respiratory Medicine. 2 (5), 631-643 (2008).
  7. Stevenson, C. S., Birrell, M. A. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance. Pharmacology and Therapeutics. 130 (2), 93-105 (2011).
  8. Vandivier, R. W., Ghosh, M. Understanding the Relevance of the Mouse Cigarette Smoke Model of COPD: Peering through the Smoke. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 3-4 (2017).
  9. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (1), L1-L15 (2008).
  10. Rennard, S. I., Togo, S., Holz, O. Cigarette smoke inhibits alveolar repair: a mechanism for the development of emphysema. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 703-708 (2006).
  11. Nikula, K. J., et al. A mouse model of cigarette smoke-induced emphysema. Chest. 117, 246S-247S (2000).
  12. Sato, T., et al. Senescence marker protein-30 protects mice lungs from oxidative stress, aging, and smoking. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (5), 530-537 (2006).
  13. Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), L843-L851 (2010).
  14. Hsia, C. C., et al. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
  15. Kasagi, S., et al. Tomato juice prevents senescence-accelerated mouse P1 strain from developing emphysema induced by chronic exposure to tobacco smoke. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (2), L396-L404 (2006).
  16. Koike, K., et al. Complete lack of vitamin C intake generates pulmonary emphysema in senescence marker protein-30 knockout mice. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (6), L784-L792 (2010).
  17. Koike, K., et al. Vitamin C prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in mice and provides pulmonary restoration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 347-357 (2014).
  18. Suzuki, Y., et al. Hydrogen-rich pure water prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in SMP30 knockout mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 492 (1), 74-81 (2017).
  19. Saad, M., Ruwanpura, S. M. Tissue Processing for Stereological Analyses of Lung Structure in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Methods in Molecular Biology. 1725, 155-162 (2018).
  20. Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. The American Review of Respiratory Disease. 95 (5), 765-773 (1967).
  21. Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. The American Review of Respiratory Disease. 131 (5), 764-769 (1985).
  22. Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
  23. Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (4), L341-L350 (2014).
  24. Wright, J. L. Relationship of pulmonary arterial pressure and airflow obstruction to emphysema. Journal of Applied Physiology. 74 (3), 1320-1324 (1993).
  25. Wright, J. L., Churg, A. Cigarette smoke causes physiologic and morphologic changes of emphysema in the guinea pig. The American Review of Respiratory Disease. 142 (6 Pt 1), 1422-1428 (1990).
  26. Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
  27. Wright, J. L., et al. Airway remodeling in the smoke exposed guinea pig model. Inhalation Toxicology. 19 (11), 915-923 (2007).
  28. Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964(2015).
  29. Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. A method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  30. Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. Automated measurement of pulmonary emphysema and small airway remodeling in cigarette smoke-exposed mice. Journal of Visualized Experiments. (95), 52236(2015).
  31. Nakanishi, Y., et al. Clarithromycin prevents smoke-induced emphysema in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (4), 271-278 (2009).
  32. Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. Journal of Immunology. 178 (12), 8090-8096 (2007).
  33. Sato, M., et al. Optimal fixation for total preanalytic phase evaluation in pathology laboratories: a comprehensive study including immunohistochemistry, DNA, and mRNA assays. Pathology International. 64 (5), 209-216 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Evaluatie van emfyseemmuizenlongmodelblootstelling aan sigarettenrookperfusiepompformalinefixatiehistologisch preparaatvergroting van de luchtruimtesSMP30 knock out

Gerelateerde artikelen