Method Article

Synthese, karakterisering en toepassing van superparamagnetische ijzeroxide nanosondes voor detectie van extrapulmonale tuberculose

DOI:

10.3791/58227

⸱

February 16th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Taipei Medical University-Shuang Ho Hospital, 2Department of Research and Department of Dentistry, Taipei Medical University / Shuang-Ho Hospital, 3Department of Pathology, Taipei Medical University, 4Department of Urology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 5McLean Imaging Center, McLean Hospital/Harvard Medical School, 6Department of Physical Medicine and Rehabilitation, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 7Department of Medicine, Mackay Medical College, 8Department of Biological Science and Technology, National Chiao Tung University, 9Graduate Institute of Clinical Medicine, Taipei Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de serologische diagnostische tests voor Mycobacterium tuberculoseantigenen te verbeteren, ontwikkelden we superparamagnetische ijzeroxide nanoprobes om extrapulmonale tuberculose op te sporen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een moleculaire imaging sonde bestaande uit superparamagnetische ijzeroxide (SPIO) nanodeeltjes en Mycobacterium tuberculose oppervlak antilichaam (MtbsAb) werd gesynthetiseerd om de beeldgevoeligheid voor extrapulmonale tuberculose (ETB) te verbeteren. Een SPIO nanoprobe werd gesynthetiseerd en geconjugeerd met MtbsAb. De gezuiverde SPIO-MtbsAb nanoprobe werd gekenmerkt met BEHULP VAN TEM en NMR. Om het targetingvermogen van de sonde te bepalen, werden SPIO-MtbsAb nanosondes geïncubeerd met Mtb voor in vitro imaging tests en geïnjecteerd in Mtb-ingeënte muizen voor in vivo onderzoek met magnetische resonantie (MR). De contrastverbeteringsreductie op magnetic resonance imaging (MRI) van Mtb- en THP1-cellen toonde evenredig aan de SPIO-MtbsAb nanosondeconcentratie. Na 30 min van intraveneuze SPIO-MtbsAb nanoprobe injectie in Mtb-geïnfecteerde muizen, werd de signaalintensiteit van de granulomatous site verbeterd met 14-voudige in de T2-gewogen MR-beelden in vergelijking met die bij muizen die PBS-injectie kregen. De MtbsAb nanoprobes kunnen worden gebruikt als een nieuwe modaliteit voor ETB detectie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wereldwijd vertegenwoordigt extrapulmonale tuberculose (ETB) een aanzienlijk deel van de tuberculosegevallen (tbc). Niettemin wordt de ETB-diagnose vaak gemist of vertraagd vanwege de verraderlijke klinische presentatie en slechte prestaties op diagnostische tests; valse resultaten omvatten sputum uitstrijkjes negatief voor zuur-snelle bacillen, gebrek aan granulomatous weefsel op histopathologie, of het niet kweken van Mycobacterium tuberculose (Mtb). In vergelijking met typische gevallen komt ETB minder vaak voor en gaat het om weinig bevrijding van de Mtb bacilli. Bovendien is het meestal gelokaliseerd op moeilijk toegankelijke locaties, zoals lymfeklieren, pleura en osteoarticulaire gebieden1. Invasieve procedures voor het verkrijgen van adequate klinische specimens, waardoor bacteriologische bevestiging riskant en moeilijk is, zijn dus essentieel2,3,4.

Commercieel beschikbare antilichaamdetectietests voor ETB zijn onbetrouwbaar voor klinische detectie vanwege hun brede gevoeligheidsbereik (0,00-1,00) en specificiteit (0,59-1,00) voor alle extrapulmonale locaties gecombineerd5. Enzymgebonden immunospot (ELISPOT) testen voor interferon-γ, kweekfiltraateiwit (GVB) en vroege secretoire antigene target (ESAT) zijn gebruikt voor het diagnosticeren van latente en actieve tbc. De resultaten variëren echter tussen de verschillende ziekteplaatsen voor de diagnose van ETB6,7,8. Bovendien leverden de PPD van de huid (gezuiverd eiwitderivaat) en QuantiFERON-TB vaak valse negatieve resultaten9. QuantiFERON-TB-2G is een heel bloed immuun reactiviteit test, die geen monster van het getroffen orgaan vereist en dit kan een alternatief diagnostisch instrument6,10,11. Andere diagnostische methoden die doorgaans worden gebruikt voor meningitis bij tbc, zoals polymerasekettingreactie, zijn nog steeds te ongevoelig om klinische diagnose 12,13met vertrouwen uit tesluiten. Deze conventionele tests tonen onvoldoende diagnostische informatie om de extrapulmonale infectie site te ontdekken. Zo zijn nieuwe diagnostische modaliteiten klinisch vereist.

Moleculaire beeldvorming is gericht op het ontwerpen van nieuwe tools die specifieke moleculaire doelen van ziekteprocessen in vivo14,15direct kunnen screenen. Superparamagnetische ijzeroxide (SPIO), een T2-gewogen NMR contrastmiddel, kan de specificiteit en gevoeligheid van magnetische resonantie (MR) beeldvorming (MRI)16,17aanzienlijk verbeteren. Deze nieuwe functionele beeldvormingmodaliteit kan weefselveranderingen op moleculair niveau nauwkeurig schetsen door middel van ligandreceptorinteracties. In deze studie werd een nieuwe moleculaire beeldsonde, bestaande uit SPIO nanodeeltjes, gesynthetiseerd om te conjuging met Mtb oppervlakteantilichaam (MtbsAb) voor ETB diagnose. SPIO nanoprobes zijn minimaal invasief voor weefsels en lichamen in onderzoek18,19. Bovendien kunnen deze nanosondes nauwkeurige MR-beelden aantonen bij lage concentraties vanwege hun paramagnetische eigenschappen. Bovendien lijken SPIO-nanosondes de minste allergische reacties uit te lokken omdat de aanwezigheid van ijzerionen deel uitmaakt van de normale fysiologie. Hier werden de gevoeligheid en specificiteit van de SPIO-MtbsAb nanoprobes gericht op ETB geëvalueerd in zowel cel- als diermodellen. De resultaten toonden aan dat de nanosondes toepasbaar waren als ultragevoelige beeldvormingsmiddelen voor etb-diagnose.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle protocolmet betrekking tot dierexperiment volgt de standaard werkprocedures voor de veeteelt in het laboratorium in overeenstemming met de National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Edition, 2011) en is goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik.

1. SPIO nanodeeltjessynthese

  1. Bereid met dextran-gecoate ijzeroxide magnetische nanodeeltjes door krachtig roeren van een mengsel van dextran T-40 (5 mL; 50% w/w) en waterige FeCl3×6H2O (0,45 g; 2,77 mmol) en FeCl2×4H2O (0,32 g; 2,52 mmol) oplossingen bij kamertemperatuur.
  2. Voeg nh4OH (10 mL; 7,5% v/v) snel toe.
  3. Roer de zwarte vering verder 1 uur; centrifugeer vervolgens bij 17.300 x g voor 10 min en verwijder vervolgens de aggregaten.
  4. Scheid de uiteindelijke SPIO-producten van unbound dextran T-40 door gelfiltratiechromatografie20.
  5. Laad het reactiemengsel (totaal volume = 5 mL) in een kolom van 2,5 cm × 33 cm en elute met een bufferoplossing met 0,1 M Na acetaat en 0,15 M NaCl bij pH 7.0.
  6. Verzamel de gezuiverde met dextran gecoate magnetische nanodeeltjes met een ijzeroxide in het lege volume en test de kolom ellaat voor ijzer en dextran op 330 en 490 nm met behulp van zoutzuur en de fenol/zwavelzuurmethoden20, respectievelijk.

2. SPIO-MtbsAb synthese

  1. Synthetiseren SPIO-geconjugeerde EDBE met behulp van eerder gerapporteerde methoden21,22.
  2. Synthetiseren SPIO-EDBE-succinische anhydride (SA).
    1. Roer een alkalische oplossing (5 M NaOH; 10 mL)) van SPIO-EDBE en SA (1 g; 10 μmol) bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
    2. Dialyze de oplossing met 20 veranderingen van 2 L gedestilleerd water met behulp van moleculaire poreuze membraan buizen (12.000-14.000 MW cutoff). 6 uur voor elke verandering.
  3. Voeg ten slotte 100 μL SPIO-EDBE-SA (4 mg/mL Fe) toe aan 400 μL van 4,5 mg/mL MtbsAb om SPIO-MtbsAb te synthetiseren met behulp van 1-hydroxybenzotriazole en (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosfonium hexafluorosfosfaat als katalysatoren en roer de oplossing bij kamertemperatuur voor 24 uur.
  4. Tot slot, scheiden van de oplossingen van de ongebonden antilichaam door middel van gel filtratie chromatografie.
  5. Laad het reactiemengsel (5 mL) op 2,5 cm × 33 cm kolom en uitsteken met behulp van een PBS-buffer. Bevestig Ab-nanodeeltjes complex (dat wil zeggen, nanoprobe) met behulp van een bicinchonine zuur eiwittest kit23.

3. Deeltjesmorologie observatie en ontspanningslaag meting

  1. Onderzoek de gemiddelde deeltjesgrootte, morfologie en grootteverdeling met behulp van transmissieelektronenmicroscoop bij een spanning van 100 kV.
    1. Drop-cast de composiet dispersie op een 200-mesh koperen raster en lucht drogen bij kamertemperatuur alvorens het te laden op de microscoop.
  2. Meet de ontspanningstijdwaarden (T1 en T2) van de nanosondes met behulp van de NMR-relaxometer op 20 MHz en 37,0 °C ± 0,1 °C.
    1. Kalibreer de relaxometer voor elke meting.
    2. Neem de r1 en r2 waarden van de acht gegevens punten gegenereerd door inversie-herstel en de Carr-Purcell-Meiboom-Gill puls sequentie, respectievelijk, om te bepalen r1 en r2 relaxivities20.

4. Celbeeldvorming

  1. Cultiveren van menselijke monocyten THP-1 in RPMI 1640 met 10% foetaal runderserum, 50 μg/mL gentamycinesulfaat, 100 eenheden/mL penicilline G natrium, 100 μg streptomycinesulfaat en 0,25 μg/mL fungizone in een 5% CO2 incubator bij 37 °C.
  2. Incubeer SPIO-MtbsAb nanoprobes (2 mM) met 106 kolonievormende eenheden (CFU) van Mycobacterium bovis BCG pregeïncubated met 1 × 107 geactiveerde monocyten in microcentrifugebuizen (1 mL) in een 5% CO2 incubator bij 37 °C gedurende 1 h.
  3. Centrifugeer buizen bij 200 x g en gooi de supernatant weg. Pellets in het medium (200 μL) opnieuw oplossen.
  4. Scan de monsters met behulp van een snelle gradiënt echo puls sequentie (Herhaling tijd (TR) = 500; Echotijd(TE) = 20; Flip hoek = 10°) door middel van 3.0-T MRI om de specificiteit en gevoeligheid van de nanosonde te bepalen21,22.

5. BCG (Bacillus Calmette–Guérin) inenting

  1. Reconstrueren de lyophilized vaccin of bacteriële voorraad in medium Sauton's en vervolgens verdunnen van de voorraad met zoutlijn tot goed verspreid zoals eerder beschreven24.
  2. Inenting een levende verzwakte stam van M. bovis BCG, verkregen uit ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (Connaught stam; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) bij een volume van 0,1 mL/muis (d.w.z. 107 CFU) intradermally in de linker of rechter rugvormige scapulaire huid van muizen, zoals eerder beschreven23. Injecteer zout in muizen als negatieve controle. Controleer dieren dagelijks na BCG-inenting.
  3. Offer dieren 1 maand na bacteriën inenting met behulp van kooldioxide euthanasie. Oogst het weefsel van de intradermale inentingsplaats. Fix het weefsel in 10% formaline en insluiten in paraffine voor seriële secties op 5-10 μm. Vlek weefsel secties met de hematoxyline / eosine en Ziehl-Neelsen vlekken voor zuur-snelle bacteriën24 en met Berlijn blauw voor ijzer25.

6. In vivo MRI

  1. Injecteer ketamine (80 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (12 mg/kg lichaamsgewicht) onderhuids in muizen voor dieranesthesie.
  2. Injecteer SPIO-TbsAb sondes (2 nmol/200 μL) in staartaderen van muizen. MR beeld muizen voor en onmiddellijk na sonde injectie en vervolgens elke 5 min voor 30 min te verwerven T2-gewogen snelle spin-echo beelden (TR = 3000; TE = 90; gezichtsveld = 8).
  3. Kwantitatief analyseren alle MR beelden met behulp van signaalintensiteit (SI), een meting van gedefinieerde regio's van belang in vergelijkbare locaties van een Mtb granuloma centrum en de rugspier grenzend aan een granulomatous gebied.
  4. Bereken relatieve signaalverbeteringen met behulp van de SI-meting vóór (SIpre; controle) en 0-3 uur na (SIpost) injectie van de contrastmiddelen met behulp van de formule

    [(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100

    waar SIpre is de SI van de laesie op de vooraf verbeterde scan en SIpost is de SI van de laesie op de post-enhanced scan21,22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SPIO-MtbsAb nanosonde synthese en karakterisering
SPIO nanodeeltjes zijn ontworpen om samen te voegen met MtbsAb. De dextran gestabiliseerd op het oppervlak van SPIO nanodeeltjes werd gekruist door epichloorhydrine. SPIO nanodeeltjes werden vervolgens opgenomen met EDBE om primaire amine functionele groepen te activeren aan de dextran uiteinden. SA werd vervolgens geconjugeerd om SPIO-EDBE-SA te vormen. SPIO-MtbsAb nanoprobes vormden zich in de laatste stap door de vervoeging van MtbsAb met SPIO-EDBE-...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Net als bij relevante studies toonden onze bevindingen met betrekking tot SPIO-MtbsAb nanoprobes een significante specificiteit aan voor Mtb27,28. De onderhuidse Mtb granuloma werd gevonden 1 maand na tb injectie in de muis modellen. De typische tbc granulomatous histologie bevindingen opgenomen lymfocyten infiltratie, aanwezigheid van epithelioïde macrofagen, en neovascularisatie. Zuursnelle bacillen werden verspreid in de tb laesies, die de mtbsAb immunohistoch...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen van de auteurs heeft enige eigen interesse in de materialen onderzocht in deze studie.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun van het Ministerie van Economie Taiwan (subsidies NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) om dit onderzoek uit te voeren. Dit manuscript is bewerkt door Wallace Academic Editing.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorofosfaatSigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazoolSigma-Aldrich
dextran(T-40)GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrine, 2,2'-(ethyleendioxid)bis(ethylamine)Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydraatFluka
ferrochloride tetrahydraatFluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCGPasteur MérieuxConnaught strain; ImmuCyst Aventis
MRIGE medical Systems3.0-T, Signa
NH4OHFluka
NMR relaxometerBrukerNMS-120 Minispec
Sephacryl S-300GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM moleculair poreus membraanbuis, 12.000 -14.000 MW cut offSpectrum Laboratories Inc
TB oppervlakte antilichaam - Polyklonaal Antilichaam tegen MtbAcris Antibodies GmbHBP2027
transmissie elektronenmicroscoopJEOLJEM-2000 EX II

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
  2. Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, Baltimore. 25-55 (1984).
  3. Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
  4. Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
  5. Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
  6. Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
  7. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
  8. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
  9. Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
  10. Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
  11. Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
  12. Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617(1990).
  13. Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
  14. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. , Suppl 1-7 (2003).
  15. Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219, 316-333 (2001).
  16. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
  17. Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
  18. Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. , 106-115 (2009).
  19. Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
  20. Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
  21. Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
  22. Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
  23. Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
  24. Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459(2003).
  25. Woods, A. E., Ellis, R. Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. , Churchill Livingstone. 6-11 (1994).
  26. Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
  27. Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
  28. Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
  29. Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
  30. von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Superparamagnetic Iron Oxide NanoparticlesExtrapulmonary Tuberculosis DetectionMagnetic Resonance ImagingTransmission Electron MicroscopyNuclear Magnetic ResonanceGel Filtration ChromatographyDextran Coated Iron OxideMycobacterium tuberculosis Surface AntibodyT2 Weighted MRISignal Intensity Enhancement

Related Articles