Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Voorbijgaande expressie in rode biet van een biofarmaceutische kandidaat vaccin voor Type 1 Diabetes

7.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59298

⸱

19 maart 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, University of Verona

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de productie van een kandidaat van de orale vaccin tegen Type 1 diabetes in een eetbare plant.

Samenvatting

Plant moleculaire landbouw is het gebruik van planten voor de productie van moleculen van belang. In dit perspectief moet kunnen planten gebruikt worden als bioreactoren voor de productie en de daaropvolgende zuivering van het eindproduct en de directe mondelinge levering van heterologe eiwitten bij het gebruik van eetbare plantensoorten. In dit werk presenteren wij de ontwikkeling van een kandidaat-orale vaccin tegen Type 1 Diabetes (T1D) in de eetbare plant-systemen die gebruikmaken van gedeconstrueerd plant virus gebaseerde recombinant DNA-technologie, geleverd met vacuüm infiltratie. Onze resultaten tonen aan dat een rode biet een geschikte gastheer voor de voorbijgaande expressie van een mens afgeleide autoantigen gekoppeld aan T1D is, beschouwd als een veelbelovende kandidaat als een T1D vaccin. Bladeren produceren de autoantigen werden grondig gekenmerkt voor hun verzet tegen de maag spijsvertering, de aanwezigheid van residuele bacteriële lading en hun secundaire metabole profiel, met een overzicht van het productie proces voor de potentiële gebruik van planten voor de directe mondelinge aflevering van een heteroloog eiwit. Onze analyse toonde bijna volledige afbraak van het gevriesdroogd kandidaat-orale vaccin na een gesimuleerde maag spijsvertering, suggereert dat een strategie van de inkapseling bij de vervaardiging van de GAD plantgerelateerde vaccin vereist is.

Inleiding

Sinds de plant moleculaire biologie revolutie in de jaren 1980, kunnen plant gebaseerde systemen voor de productie van biofarmaceutica worden beschouwd als een alternatief voor traditionele systemen gebaseerd op microbiële en zoogdieren cellen1. Planten display verscheidene voordelen over traditionele platformen, met schaalbaarheid, kosteneffectiviteit en veiligheid wordt de meest relevante2. De recombinante product kan worden gezuiverd van getransformeerde plant weefsel en vervolgens beheerd, ofwel parenteraal of mondeling en, bovendien, getransformeerde eetbare plant direct voor mondelinge levering kan worden gebruikt. Orale toediening bevordert tegelijkertijd mucosal en systemische immuniteit, en het elimineert de noodzaak voor naalden en gespecialiseerde medisch personeel. Bovendien elimineert mondelinge levering de complexe downstream processing, die normaal goed is voor 80% van de totale productiekosten van een recombinant eiwit3. Al deze voordelen kunnen worden vertaald in besparingen in leveringen, productie en arbeid reduceert de kosten van elke dosis, waardoor de drug betaalbaar voor de meeste van de wereldbevolking.

Verschillende strategieën, zowel voor stabiele transformatie en voorbijgaande expressie, werden ontwikkeld voor de productie van recombinante eiwitten in planten. Onder hen biedt een hoog rendement gedeconstrueerd plant virus gebaseerde expressie systeem (bijvoorbeeld magnICON) superieure prestaties leidt hoge opbrengsten van recombinante eiwitten over relatief korte tijdschalen4. Vele voorbeelden van voorbijgaande expressie met behulp van de plant virus gebaseerde expressie systeem in Nicotiana benthamiana planten worden gerapporteerd, wordt de goudstandaard productie host. Deze plant model wordt echter niet beschouwd als een eetbare soorten als gevolg van de alkaloïden en andere giftige metabolieten die zijn verzameld in zijn bladeren.

In dit werk, beschrijven we de vergelijking tussen twee eetbare plant systemen, rode biet (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) en spinazie (oleracea Spinacea cv Industria), voor de expressie van twee kandidaat-vormen van de isovorm 65 kDa van glutaminezuur decarboxylase (GAD65), uitgevoerd door de plant virus gebaseerde vectoren5. GAD65 is een grote autoantigen geassocieerd met Type 1 Diabetes (T1D) en het wordt momenteel onderzocht in klinische testen te voorkomen of vertragen T1D door inducerende tolerantie6. De productie van GAD65 in planten is uitgebreid onderzocht bij model plantensoorten als Nicotiana tabacum en N. benthamiana4,5,6,7. Hier beschrijven we het gebruik van eetbare planten voor de productie van de molecule in weefsels die kunnen worden bedoeld voor een mondelinge bericht direct te bezorgen. Vanuit een technisch oogpunt, we onderzocht en geselecteerd van het systeem voor agroinfiltration van de plant en de eetbare plant-platform voor de productie van GAD65 met een evaluatie van verschillende parameters: de recombinant eiwit expressie niveaus, de resterende microbiële lading in plant weefsels bedoeld voor mondelinge levering, de weerstand van GAD65 naar de maag spijsvertering, en de biologische equivalentie van de getransformeerde planten met de wild-type.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. de rode bieten en spinazie teelt

  1. Rode biet groeien (B. vulgaris cv Moulin Rouge) en spinazie (S. oleracea cv Industria) planten in een zaal van de groei, met 150 µE van lichtintensiteit, 65% relatieve vochtigheid, 12 h licht/donker cyclus bij 23/21 ° C, respectievelijk.
  2. Na de ontkieming van zaad, bevrucht de planten twee keer per week met een oplossing van 1 g/L van een commercieel beschikbare kunstmest (Tabel van materialen). Gebruik de vijf weken oude spinazie en zes weken oude rode biet planten voor agroinfiltration.

2. Pre-steady expressie via de gedeconstrueerde plant virus gebaseerde technologie

  1. Bouw van plant expressievectoren
    1. Invoering van de vectoren - de 5' module (pICH20111), de 3' modules (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut en pICH7410.eGFP), bereid als hierboven beschreven1,2,7, en de integrase module (pICH14011)- met behulp van standaard technieken bij Agrobacterium tumefaciens GV3101 stam. Groeien op LB medium met 50 μg/mL rifampicine en geschikte vector-specifieke antibiotica (50 μg/mL carbenicillin voor pICH20111, pICH14011 en pICH7410.eGFP), 50 μg/mL kanamycine voor pICH31070 voor 2 dagen bij 28 ° C.
    2. Het scherm van de kolonies door met behulp van de volgende specifieke primers voor elke vector PCR van de kolonie: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' en 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' voor zowel de 3' modules pICH31070.GAD65mut en pICH31070.∆87G65mut, met een onthardende temperatuur van 55 ° C en de tijd van een rek van 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' en 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' voor de derde 3' module pICH7410.eGFP, met een onthardende temperatuur van 53 ° C en de tijd van een rek van 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' en 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' voor de 5' module, met een onthardende temperatuur van 53 ° C en een rek tijd van 20 s en 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' en 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' voor de integrase-module met een onthardende temperatuur van 57 ° C en een rek tijd van 45 s.
    3. Verrichten van de PCR-reactie in een totaal volume van 20 μL met behulp van de volgende cyclus van de specifieke reactie: 5 min eerste denaturatie bij 95 ° C, 35 cycli van 30 bij 95 ° C, 30 s s bij de onthardende temperatuur en de rek stap bij 72 ° C (onthardende temperatuur en rek tijd een Re specifiek voor elk paar primer) en een definitieve rek stap van 7 minuten bij 72 ° C.
  2. Spuit-agroinfiltration
    1. Enten van de drie transformants van A. tumefaciens in 50 mL LB middellange met 50 μg/mL rifampicine en de volgende geschikte vector-specifieke antibiotica: 50 μg/mL carbenicillin voor A. tumefaciens getransformeerd met pICH20111, pICH14011 of pICH7410.eGFP, of 50 μg/mL kanamycine voor A. tumefaciens getransformeerd met pICH31070. Groeien door 's nachts schudden bij 28 ° C.
    2. Pellet overnachting bacteriële culturen door centrifugeren bij 4.500 x g gedurende 20 min en resuspendeer hen in 100 mL (of twee volumes van de initiële bacteriecultuur) van infiltratie buffer met 10 mM 4-morpholineethanesulfonic zuur (MES; pH 5.5) en 10 mM MgSO4, zonder te overwegen de OD600. Incubeer de schorsingen op kamertemperatuur (RT) gedurende 3 uur.
    3. Meng gelijke hoeveelheid bacteriële suspensies met een van de drie modules, GAD65mut, ∆87GAD65mut of eGFP 3' module, met 5' module en integrase. Gebruik de schorsing mix voor spuit infiltratie van rode bieten en spinazie bladeren.
    4. Plaats 5 mL van de suspensie in een injectiespuit zonder de naald. Druk op het puntje van de spuit tegen de onderkant van het blad voor zowel de spinazie en de rode biet planten, en ondertussen een zachte tegendruk van toepassing op de andere kant van het blad.
    5. De eerste drie volledig uitgevouwen bladeren vanaf de apex voor elke plant te infiltreren. Label de bladeren van de agroinfiltrated met een papier-tag op de steel van het blad. De planten in een kamer van de groei onder standaardomstandigheden retourneren
      Opmerking: Om redenen van gezondheid en veiligheid, draag een veiligheidsbril en handschoenen tijdens infiltratie.
    6. Verzamelen agroinfiltrated laat van 4 tot 14 dagen na infectie (dpi) en bevriezen ze in vloeibare stikstof. Winkel plant weefsel bij-80 ° C.
  3. Vacuüm agroinfiltration
    1. Afzonderlijk de drie A. tumefaciens transformants in 50 mL LB opslagmedium met 50 μg/mL rifampicine en geschikte vector-specifieke antibiotica groeien door 's nachts schudden bij 28 ° C.
    2. Pellet overnachting bacteriële culturen door centrifugeren bij 4.500 x g gedurende 20 min. resuspendeer de pellet in 1 L voor infiltratie buffer een OD-600 voor 0.35 en Incubeer de schorsingen op RT gedurende 3 uur.
    3. 0,01% (v/v) van het wasmiddel (Polysorbaat 20) aan elk schorsing toevoegen. Meng gelijke hoeveelheid bacteriële suspensies met een van de drie modules, GAD65mut, ∆87GAD65mut of eGFP 3' module, met 5' module en integrase.
    4. Invoegen van een plant (zes weken oude rode biet plant, zie paragraaf 1) in de houder. Omkeren van de houder en plaats op de top van een bekerglas van de infiltratie-bad (2 L) te dompelen de bladeren in de schorsing van de infiltratie.
      Opmerking: Zorg ervoor dat alle bladeren volledig worden ondergedompeld in de bacteriële suspensie. Het beter met de toevoeging van extra infiltratie schorsing te verhogen indien nodig.
    5. De infiltratie bad met de verzonken plant overbrengen in de zaal van de infiltratie, en sluit het. Zet de vacuümpomp en open de klep van de vacuüm inname op de kamer van de infiltratie.
    6. Zodra de druk in de infiltratie kamer heeft beperkt tot 90 mbar, houden het vacuüm voor 3 min. Release het vacuüm voor 45 s. Zodra de infiltratie kamer is teruggekeerd naar de atmosferische druk, de zaal open en verwijderen van de geïnfiltreerde plant uit het bacteriële bad.
    7. De planten in een kamer van de groei onder standaardomstandigheden retourneren
    8. Agroinfiltrated bladeren op de maximale expressie dpi, afhankelijk van de recombinante eiwitten, verzamelen en bevriezen ze in vloeibare stikstof. Winkel plant weefsel bij-80 ° C.

3. recombinant eiwit expressie analyse

  1. Totale oplosbaar eiwit (TSP) extractie
    1. Slijpen van de spuit of vacuüm geïnfiltreerd rode bieten en spinazie bladeren, verzameld in stappen 2.2.6 en 2.3.8, tot fijn poeder in vloeibare stikstof met mortier en een stamper. Breng het poeder in 15 mL plastic buizen en op te slaan van het materiaal bij-80 ° C.
    2. Voeg 900 µL van extractie buffer (50 mM natriumfosfaat pH 8.0, 20 mM Natriummetabisulfiet) tot 300 mg blad poeder.
      Opmerking: De geselecteerde verhouding tussen plant weefsel gewicht (mg) buffervolume (µL) is 1:3.
    3. Meng het mengsel door de vortexing voor 1 min en centrifugeer bij 30.000 x g gedurende 40 min bij 4 ° C.
    4. De bovendrijvende vloeistof in een schone buis verzamelen en opslaan bij-80 ° C.
  2. Plant eGFP visualisatie en kwantificering
    1. Laden 100 µL van elke TSP-extract verkrijgbaar bij eGFP bladeren, in drie technische replicaten, uiten op een 96-wells-plaat.
    2. Leg de 96-wells-plaat in een fluorescentie-lezer en begin van de meting. Gebruik de 485/535 nm filter nodig voor de detectie van eGFP fluorescentie instellen.
    3. Voor de absolute kwantificering, in de dezelfde plaat bereiden een kalibratiekromme laden verschillende hoeveelheden (62,5, 125, 500, 750 en 1000 ng) van een gezuiverde eGFP.
  3. Bicinchoninic zuur (BCA) assay voor Theelepel kwantificering
    1. Meng 50 delen van reagens A (Tabel of Materials) met 1 deel van reagens B (Tabel van materialen). Voldoende hoeveelheid verse BCA werkoplossing voorbereiden op de monsters te worden bepaald en de normen van de kalibratie.
      Opmerking: Het volume van de BCA werkoplossing vereist voor elk monster is 1.9 mL. Voor de standaardprocedure met 9 normen (inclusief een spatie), is 17.1 mL van de werkoplossing BCA vereist.
    2. Pipetteer 0,1 mL van elk standaard (inclusief een spatie) en Theelepel extracten in een gelabelde buis.
      Opmerking: Als kalibratie standaarden, bereiden een verse set van bovien serumalbumine (BSA) normen in de 10-1000 μg/mL bereik, bij voorkeur met hetzelfde verdunningsmiddel als monsters, zoals water. De blanco bestaat uit 0,1 mL van het oplosmiddel gebruikt voor ijkstandaard en bereiding van de monsters.
    3. Voeg 1.9 mL van de werkoplossing BCA en meng. Bedek de buizen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
    4. Koel de buizen aan RT. maatregel de absorptie bij 562 nm van alle monsters binnen 10 min.
      Opmerking: Zelfs bij RT, de ontwikkeling van kleur blijft. Geen significante tekortkomingen zullen worden ingevoerd indien de absorptie metingen van alle buizen zijn gedaan binnen 10 min.
    5. Aftrekken van de 562 nm extinctie waarde van de blanco uit de lezingen van de normen en de TSP-extracten.
    6. Plot de blanco-gecorrigeerde 562 nm lezen voor elke standaard op de concentratie ervan. Bepaal de eiwitconcentratie voor elke TSP-extract.
  4. Coomassie gel kleuring zoals eerder is beschreven in Gecchele et al.8uit te voeren.
  5. Westelijke vlekkenanalyse
    1. De westelijke vlekkenanalyse zoals eerder beschreven in Gecchele et al.8uit te voeren.
    2. Na de elektroforetische scheiding van proteïnen, kunt u dat overbrengt naar een membraan van de nitrocellulose met standaardtechnieken. Bereid de blokkerende oplossing door het mengen van 4% melk in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7.4. Het blokkeren van het membraan met 10 mL van de blokkerende oplossing bij RT gedurende 1 uur.
    3. Het primaire antilichaam van konijn op 1:10,000 voor de anti-GAD65/67 en anti-LHCB2 en op 1:20,000 voor de anti-eGFP in 5 mL van blokkerende oplossing met 0,1% wasmiddel voor te bereiden. Incubeer het membraan met de oplossingen van de bereid primair antilichaam 's nachts bij 4 ° C of gedurende 4 uur bij RT met constante agitatie.
    4. Het primaire antilichaam negeren en wassen van het membraan 3 keer voor elke 5 min met blokkerende oplossing die 0,1% wasmiddel.
    5. Bereiden de horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerde antilichaam van de anti-konijn op 1:10,000 in het blokkeren van de oplossing met 0,1% wasmiddel. Incubeer het membraan gedurende 1,5 uur op RT met constante agitatie.
    6. Het secundaire antilichaam negeren en het membraan 5 keer voor 5 min met PBS-T (PBS aangevuld met 0,1% afwasmiddel) wassen.
    7. Incubeer het membraan met een oplossing van de verkrijgbare luminol na instructies van de fabrikant. Het signaal dat met behulp van een chemiluminescentie imaging systeem te detecteren.

4. plant materiaalverwerking

  1. Oogst de vacuüm agroinfiltrated uiten van ∆87GAD65mut rode biet verlaat op het hoogtepunt van de expressie (11 dpi) en bevriezen ze in vloeibare stikstof.
  2. Lyophilize de bevroren bladeren gedurende 72 uur bij-50 ° C en 0,04 mbar. Bewaar ze bij-80 ° C.
  3. De bladeren tot fijn poeder vermalen en sla het op RT in een verzegelde container met silica gel filter uit te sluiten van het vocht.

5. de maag spijsvertering simulatie en cel integriteit analyse

  1. Maag spijsvertering simulatie
    1. Weeg 100 mg van gemalen gevriesdroogde rode biet bladeren en resuspendeer het in 6 mL PBS (pH 7.4).
    2. Breng de pH van de steekproef op 2 met 6 M HCl.
    3. Voeg 4 mg/mL pepsine van varkens maagslijmvlies in 10 mM HCl een definitieve pepsine concentratie van 1 mg/mL of een verhouding van 1:20 tot totale oplosbare eiwitten te verkrijgen. Schud het monster bij 37 ° C gedurende 120 minuten.
    4. Aanpassen van de monsters naar pH 8 met 1 M NaOH aan de inactivering van de pepsine.
    5. Centrifugeer 750 µL aliquots van elk monster bij 20.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verzamelen afzonderlijk het supernatant en resuspendeer de pellet in één supernatant volume van het laden van de buffer (1,5 M Tris-HCl, pH 6.8, 3% SDS, 15% glycerol en 4% 2-mercaptoethanol).
      Opmerking: Om redenen van gezondheid en veiligheid, Draag handschoenen en werken onder de zuurkast voor de bereiding van de monsters.
    6. Zowel het supernatant en de geresuspendeerde pellet analyseren met westelijke vlek analyse8.
  2. Cel integriteit analyse
    1. Bereiden van twee monsters van 100 mg van gemalen gevriesdroogde rode biet bladeren en resuspendeer zowel in 6 mL PBS (pH 7.4).
    2. Breng de pH van alleen een sample 2 met 6 M HCl. schudden beide monsters bij 37 ° C gedurende 120 minuten.
    3. Centrifugeer 750 µL aliquots van elk monster bij 20.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verzamel afzonderlijk het supernatant en resuspendeer de pellet in één supernatant volume van het laden van de buffer.
    4. Zowel het supernatant en de geresuspendeerde pellet analyseren met westelijke vlekkenanalyse.

6. Bioburden test

  1. Weeg 100 mg van gevriesdroogde rode biet bladeren. Resuspendeer de poeder in 8 mL steriel PBS (pH 7.4) en vortex voor 1 min.
  2. Bereiden de LB-medium zonder antibiotica of met (i) 50 µg Mo/mL rifampicine, (ii) 50 µg/mL elke van rifampicine en carbenicillin, (iii) 50 µg/mL elke rifampicine en kanamycine of (iv) 50 µg/mL elke rifampicine, carbenicillin en kanamycine.
  3. Plaat 1 mL van elk gevriesdroogd blad homogenaat in één van de 5 selectieve LB-media.
  4. Alle platen Incubeer gedurende 3 dagen bij 28 ° C.
  5. Tellen de Agrobacterium koloniën verbouwd op elke plaat.
  6. Berekenen en de resterende bacteriële lading definiëren als het aantal kolonie vormende eenheden (kve) per mL van het gelyofiliseerde blad homogenaat (CFU/mL).

7. metaboliet extractie

  1. Extractie van de primaire metaboliet
    1. Weeg 30 mg-80 ° C opgeslagen, vacuüm ∆87GAD65mut-uiting van agroinfiltrated rode biet blad poeder in een plastic buis van 2 mL.
    2. Voeg 750 µL van koude 70/30 (v/v) methanol/chloroform en vortex voor 30 s. Incubate bij-20 ° C gedurende 2 uur.
      Opmerking: Alle oplosmiddelen en additieven moet LC-MS rang.
    3. Voeg 600 µL van koud water en centrifugeer bij 17,900 x g bij 4 ° C gedurende 10 min. verzamelen en overdracht van de bovenste hydroalcoholic fase in een nieuwe 2 mL-buis. De lagere chloroformic fase en de interfase negeren.
    4. Zet de monsters in een vacuüm concentrator voor 3 h te verdampen de oplosmiddelen.
    5. Los van de pellet verkregen stap 7.1.4 in 300 µL van 50/50 (v/v) acetonitril/water en bewerk ultrasone trillingen ten de monsters gedurende 3 minuten.
    6. De oplossingen passeren 0.2 micrometer membraanfilters en zet ze in een transparante vaste 300 µL invoegen glazen buizen.
  2. Secundaire metaboliet extractie
    1. Weeg 300 mg-80 ° C opgeslagen, vacuüm ∆87GAD65mut-uiting van agroinfiltrated rode biet blad poeder in een plastic tube van 15 mL.
    2. Voeg 3 mL methanol, vortex voor 30 s, en bewerk de ultrasone trillingen ten op 40 kHz voor 15 min.
      Opmerking: Alle oplosmiddelen en additieven moet LC-MS rang.
    3. Centrifugeer de monsters bij 4.500 x g bij 4 ° C voor 10 min en breng het supernatant in nieuwe 15 mL buizen.
    4. Verdunde 100 µL extract 1:3 (v/v) met water en laat de oplossing door een membraanfilter van 0.2 micrometer.
    5. Zet de oplossing in een transparante vaste 300 µL invoegen glazen buis.
  3. Polar lipide extractie
    1. Weeg 200 mg-80 ° C opgeslagen, vacuüm ∆87GAD65mut-uiting van agroinfiltrated rode biet blad poeder in een plastic tube van 15 mL.
    2. Voeg 200 µL van water en vervolgens 2 mL methanol, en dan houd op ijs gedurende 1 uur.
      Opmerking: Alle oplosmiddelen en additieven moet LC-MS rang.
    3. Vortex voor 30 s en bewerk ultrasone trillingen ten op 40 kHz voor 15 min.
    4. Centrifugeer de monsters bij 4.500 x g bij 4 ° C voor 25 min. verzamelen en de overdracht de chloroformfase in 2 mL buizen. De bovenste hydroalcoholic fase en de interfase negeren.
    5. Zet de monsters in een vacuüm concentrator voor 3 h te verdampen van het oplosmiddel.
    6. Los de pellet verkregen stap 7.3.5 met 600 µL van methanol.
    7. Verdunde 100 µL extract 1:5 (v/v) met methanol en laat de oplossing door een membraanfilter van 0,2-μm.
    8. Zet de oplossing in een transparante vaste 300 µL invoegen glazen buis.

8. vloeistofchromatografie massaspectrometrie analyse en verwerking van gegevens

  1. Opzetten van de LC-MS-systeem, zoals aanbevolen door de leverancier.
    Opmerking: De LC-sectie bestaat uit een combinatie met HPLC uitgerust met een voorkolom C18 (75 x 2.1 mm, deeltje grootte 5 µm) tegenover een C18-kolom (150 x 2.1 mm, deeltje grootte 3 µm) voor de analyse van secundaire metabolieten en polar lipiden autosampler , overwegende dat met een HILIC voorkolom (7,5 x 2.1 mm, 3 µm) tegenover een HILIC kolom (150 x 2.1 mm, deeltje grootte 2.7 µm). De MS is een ion trap massaspectrometer voorzien van ofwel een electrospray ionisatie (ESI) of een atmosferische druk chemische ionisatie (APCI) bronnen.
  2. De geschikte oplosmiddelen voorbereiden op de hellingen van HPLC. Voor de analyse van de belangrijkste metaboliet, 20 mM ammonium formate te gebruiken als oplosmiddel A; 95% acetonitril, 5% water plus 10 mM ammonium formate als oplosmiddel B. Gebruik secundaire metaboliet p.a., water plus 0.05% mierenzuur (A) en acetonitril plus 0.05% mierenzuur (B). Gebruik voor de analyse van de polar lipide, water plus 0.05% mierenzuur (A) en 100% acetonitril (B).
    Opmerking: De oplosmiddelen en van additieven moet LC-MS rang.
  3. Gebruik de verlopen gemeld in tabel 1 voor metaboliet elutie. De stroom snelheid 0,2 mL/min. injecteren 10 µL van elk monster voor zowel secundaire metabolieten en polar lipiden, overwegende dat verzameling injecteren 5 µL voor primaire metabolieten.
  4. Bereid een steekproef van de kwaliteitscontrole (QC) door het mengen van gelijke porties van verschillende monsters om een representatieve mengsel van elke experimentele voorwaarde. De QC-monsters analyseren tijdens het experiment om te controleren van de efficiëntie van het instrument. Specifiek, een analyse van het monster QC invoegen na elke 10 monster-partij.
  5. Randomize de monsters ter vermijding van instrument-gedreven effecten.
  6. Na 9 analyses, het invoegen van een kolom schoonmaak methode en een lege analyse onmiddellijk na.
    Opmerking: Voer een traag verloop tussen de twee oplosmiddelen met een isocratic elutie op hoog percentage van het sterkste oplosmiddel. De blanco bestaat uit een injectie van een methanol, chemisch zuiver: water (50/50, v/v) ter verbetering van de retentie tijd reproduceerbaarheid in de volgende analyse.
  7. Instellen van het instrument te verwerven massaspectra in alternatieve positieve en negatieve ionisatie modi met behulp van de parameters vermeld in tabel 2.
    Opmerking: Andere parameters afhankelijk van de specifieke platform.
  8. De volgende gegevensverwerking uitvoeren zoals uiteengezet in Dal Santo et al.9.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit werk, wordt de workflow voor de ontwikkeling van een orale vaccin in eetbare plantaardige weefsels gepresenteerd. De focus van dit werk is de uitdrukking van een doel-proteïne in een eetbare host plantensoorten en de karakterisatie van het potentiële orale vaccin.

De eerste stap bij de beoordeling van de geschiktheid van de plant expressie virus gebaseerde technologie voor de productie van recombinante eiwitten in eetbare...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie toonden we voorlopige analyse voor het ontwerp van een kandidaat-orale vaccin voor auto-immuunziekte diabetes. De proteïne van de doelgroep voor dit experiment was een gemuteerde vorm van het menselijke 65 kDa glutamaat Decarboxylase, welke productie en functionaliteit zijn dan gemakkelijk waarneembare en meetbare12. De expressie in de weefsels van verschillende eetbare plant was gemedieerd door de vectoren5, die een hoog niveau van de productie van recombina...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door het gezamenlijke Project "Het gebruik van planten voor de productie van een auto-immuunziekte diabetes eetbare vaccin (eDIVA)" (Project-ID: 891854) door de Universiteit van Verona, in het kader van de oproep 2014 gefinancierd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2-μm Minisart RC4 membraanfiltersSartorius-Stedim17764
2–mercaptoethanolSigmaM3148Toxisch; 4 % om laadbuffer met glycerol, SDS en Tris-HCl te maken
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)SigmaM8250pH 5.5
96-wellsplaatSarstedt833924
AzijnzuurSigma27221Corrosief
Acetonitrile LC-MS kwaliteitSigma34967
AcetosyringoneSigmaD134406Toxisch – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriologisch KwaliteitApplichemA094915 g/L om LB medium (pH 7.5 met NaOH) met Gistextract, NaCl en Tryptone te maken
AmmoniumformiaatSigma70221
Anti-eGFP antilichaamABCamab290
Anti-GAD 65/67 antilichaamSigmaG5163
Anti-LHCB2 antilichaamAgriseraAS01 003
Brilliant Blue R-250SigmaB7920
C18 KolomGrace   -Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Kolom
C18 Guard KolomGrace   -Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Kolom
CalMag GrowerPeter Excel15-5-15Meststof
Carbenicilline dinatriumDuchefa BiochemieC0109Toxisch
Chemiluminescentie beeldvormingssysteemBioRad1708370ChemiDoc Touch Imaging System
ChloroformSigmaC2432
DetergentiaSigmaP5927Polysorbaat 20
Fluorescentie lezerPerkin-Elmer 1420-011VICTOR Multilabel Counter
Forminezuur LC-MS kwaliteitSigma94318
GlycerolSigmaG551615 % om laadbuffer met Tris-HCl, SDS en 2–mercaptoethanol te maken
GoTaq G2 polymerasePromegaM7841
HClSigmaH1758Corrosief
HILIC KolomGrace   -Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; deeltjesgrootte 2.7 μm) Kolom
HILIC Guard KolomGrace   -Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Kolom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugaat anti-konijn antilichaamSigmaA6154Niet te vaak invriezen/ontdooien
HPLC AutosamplerBeckman Coulter   -System Gold 508 Autosampler
HPLC SysteemBeckman Coulter   -System Gold 128 Solvent Module HPLC
IsopropanolSigma24137Ontvlambaar
Kanamycine sulfaatSigmaK4000Toxisch
KClSigmaP95412 g/L met NaCl, Na2HPO4 en KH2PO4 om PBS te maken
KH2PO4SigmaP97912.4 g/L met NaCl, Na2HPO4 en KCl om PBS te maken
Laadbuffer
Luminol oplossingGe HealthcareRPN2232Bereid de oplossing met behulp van het commerciële ECL Prime Western Blotting System kit
Lyofilizator5PascalLIO5P0000DGT
MassaspectrometerBruker Daltonics  -Bruker Esquire 6000; de massaspectrometer was uitgerust met een ESI-bron en de analyzer was een ionenval
MethanolSigma32213
MgSO4SigmaM7506
Melk-blokkeer oplossingRistora   -3 % in PBS
Na2HPO4SigmaS7907Gebruik met NaH2PO4 om Natriumfosfaat buffer te maken
NaClSigmaS301480 g/L met KCl, Na2HPO4 en KH2PO4 om PBS te maken; 10 g/L om LB medium (pH 7.5 met NaOH) met Gistextract, Tryptone en Agar Bacteriologisch Kwaliteit te maken
NaH2PO4SigmaS8282 Gebruik met Na2HPO4 om Natriumfosfaat buffer te maken; 14.4 g/L om PBS te maken
NaOHSigmaS8045
Nitrocellulose membraanGe Healthcare10600002
Pepsine uit varkensgastrische mucosaSigmaP7000
Peroxidase substraat ECLGE HealthcareRPN2235Lichtgevoelig materiaal
Pomp Vacuum PersVWR111400000098
Reagens ASigmaB9643Gebruik 50 delen van dit reagens met 1 deel van reagens B om BCA werkoplossing te bereiden
Reagens BSigmaB9643Gebruik 1 deel van dit reagens met 50 delen van reagens A om BCA werkoplossing te bereiden
RifamycineDuchefa BiochemieR0146Toxisch – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Natriumdodecylsulfaat)SigmaL3771Ontvlambaar, toxisch, corrosief

Referenties

  1. Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
  2. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
  3. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  4. Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we? Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957(2010).
  5. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
  6. Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
  7. Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
  8. Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
  9. Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
  10. Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
  11. Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).
  12. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
  13. Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).
  14. Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
  15. Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015).
  16. Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
  17. Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
  18. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
  19. Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).
  20. Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, FSO217 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Oraal vaccinvacu minfiltratieAgrobacteriumWestern blotmaagdarmverteringlyofilisatierecombinant eiwit
Voorbijgaande expressie in rode biet van een biofarmaceutische kandidaat vaccin voor Type 1 Diabetes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.