Monitoren van GPCR-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen

Samenvatting

GPCR-β-vanger-interacties zijn een opkomende veld in GPCR-geneesmiddelen ontdekking. Nauwkeurige, nauwkeurige en eenvoudig te stellen methoden zijn nodig om dergelijke interacties in levende systemen te monitoren. We vertonen een structurele complementatie test om de interacties van GPCR-β-de-vanger in real-time levende cellen te monitoren, en deze kan worden uitgebreid naar elke GPCR.

Samenvatting

Interacties tussen G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) en β-vanger zijn vitale processen met fysiologische implicaties van groot belang. Momenteel is de karakterisering van nieuwe geneesmiddelen naar hun interacties met β-vanger en andere cytosolische eiwitten zeer waardevol op het gebied van GPCR-geneesmiddelen ontdekking, met name tijdens de studie van GPCR-bevooroordeeld agonisme. Hier tonen we de toepassing van een nieuwe structurele complementatie test om nauwkeurig de receptor-β-vanger in interacties in real time levende systemen te bewaken. Deze methode is eenvoudig, nauwkeurig en kan gemakkelijk worden uitgebreid naar elke GPCR van belang en ook heeft het voordeel dat het overkomt onspecifieke interacties als gevolg van de aanwezigheid van een lage expressie promotor aanwezig zijn in elk vector systeem. Deze structurele complementatie test biedt belangrijke kenmerken die een nauwkeurige en nauwkeurige controle van receptor-β-vanger interacties mogelijk maken, waardoor het geschikt is in de studie van bevooroordeeld agonisme van elk GPCR-systeem en GPCR c-Terminus ' fosforylering codes ' geschreven door verschillende GPCR-kinases (GRKs) en post-translationele modificaties van afvallen die het receptor-β-afradercomplex stabiliseren of destabiliseren.

Inleiding

Gpcrs vertegenwoordigen het doel van bijna 35% van de huidige drugs in de markt^1,2 en een duidelijk begrip van hun farmacologie is cruciaal in de ontwikkeling van nieuwe therapeutische geneesmiddelen³. Een van de belangrijkste aspecten bij de ontdekking van GPCR-geneesmiddelen, in het bijzonder tijdens de ontwikkeling van partijdige agonisten, is de karakterisering van roman liganden naar receptor-β-dein interacties⁴ -en β-dein interacties met andere cytosolische eiwitten, zoals Als clathrin⁵.

Er is gedocumenteerd dat de afhankelijke signalering van β-vanger een belangrijke rol speelt bij neurologische aandoeningen zoals bipolaire stoornis, ernstige depressie en schizofrenie⁶ en ook ernstige bijwerkingen in sommige medicijnen zoals morfine⁷.

De huidige methoden die worden gebruikt om deze interacties te bewaken, vertegenwoordigen meestal niet de werkelijke endogene niveaus van de eiwitten in studie, in sommige gevallen vertonen ze een zwak signaal, fotobleaching en afhankelijk van de GPCR kan het technisch lastig zijn om⁸in te stellen. Deze roman Structural complementatie test maakt gebruik van lage expressie Promoter vectoren om endogene fysiologische niveaus na te bootsen en biedt een hoge gevoeligheid in vergelijking met de huidige methoden⁹. Met behulp van deze aanpak, was het mogelijk om te karakteriseren Galanin receptor-β-arrestin1/2 en ook β-arrestin2-clathrin interacties¹⁰. Deze methodologie kan op grote schaal worden gebruikt voor elke GPCR van bijzonder belang waar β-vanger een belangrijke fysiologische functie speelt of de signalering relevant is bij sommige ziekten.

Protocol

1. ontwerp strategie voor primer

1. Ontwerp primers om genen van belang te introduceren in pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vectoren.
2. Selecteer ten minste één van deze drie locaties als een van de twee unieke beperkings enzymen die nodig zijn voor richtings klonen vanwege de aanwezigheid van een in-frame stop codon die de multicloning-site verdeelt zoals weergegeven in Figuur 1¹¹.
3. Neem de nucleotide sequentie op in de primers zoals weergegeven in tabel 1 om de linker residuen te coderen zoals weergegeven in rood in tabel 2¹¹.
4. Voor pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] vectoren, zorg ervoor dat de 5 ́ primer een ATG codon en een krachtige Kozak consensussequentie (GCCGCCACC) bevat.
5. Voor pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vectoren, zorg ervoor dat de 3 ́ primer een stop codon bevat.
   Notes: elke vector bevat de HSV-TK-promotor om niet-specifieke associatie te minimaliseren en experimentele artefacten te verminderen, ook elke vector heeft een expressie cassette voor ampicillaire resistentie bij bacteriën.

2. PCR

1. Instellen en uitvoeren van PCR-reacties om te versterken het insert DNA van het gen van belang met behulp van de primers ontworpen uit stap 1. Het is belangrijk om een high-fidelity DNA-polymerase te gebruiken om mutaties te minimaliseren.
2. Gebruik exact de volgende volgorde om 50 μL PCR-reactie te bereiden. Voeg 35,5 μL gedistilleerd water, 5 μL 10 x polymerase buffer, 5 μL dNTP-mengsel (2,5 mM per stuk), 1 μL plasmide sjabloon (200 ng/μL), 1,25 μL voorwaartse en omgekeerde primers (10 μM) en 1 μL High-Fidelity polymerase (5 U/μL) toe.
3. Met behulp van een Thermocycler het volgende DNA-versterkings programma instellen.
   1. Denature bij 95 °C gedurende 5 min.
   2. Herhaal 25 keer de volgende thermische cyclus: 95 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 1 minuut, 72 °C gedurende 2 minuten per 1 KBP om te worden versterkt.
   3. Voer een laatste verlenging uit bij 72 °C gedurende 10 minuten.
   4. Houd de monsters bij 4 °C binnen de Thermocycler.
      Opmerking: het wordt ten zeerste aanbevolen om een high-fidelity polymerase te gebruiken om puntmutaties te minimaliseren, vooral die zich voordoen tijdens de versterking van lange sequenties. Naarmate de ampliconlengte voor temp langer wordt, neemt de mate van nauwkeurigheid bij de replicatie van het DNA af. Voor de PCR-reactie, kies de gloeien temperatuur op basis van de smelttemperatuur van de regio waar de oligos direct hybridiseren met de DNA-template en niet met alle volgorde van de primer.
4. PCR-product zuivering
   1. Isoleer het PCR-product uit de rest van de PCR-reactie met behulp van een Kit van een fabrikant van voorkeur¹². Het PCR-product is nu klaar voor een beperking van de spijsvertering.

3. DNA-spijsvertering

1. Voor de PCR-product bereiding wordt 50 μL van de digestie reactie als volgt bereid.
   1. Voeg met een tube van 1,5 mL 12 μL gedistilleerd water toe.
   2. Voeg 5 μL 10x buffer toe met de beste compatibiliteit met beide restrictie enzymen.
   3. Vanaf stap 2,4 Voeg 30 μL PCR-product toe
   4. Voeg ten slotte 1,5 μL van elk restrictie-enzym toe.
   5. Meng kort door Vortex en inincuberen bij 37,5 °C 's nachts.
2. Voor de ontvanger plasmide spijsvertering bereiden 50 μL van de spijsvertering reactie als volgt:
   1. Voeg met een tube van 1,5 mL 23 μL gedistilleerd water toe.
   2. Voeg 5 μL 10x buffer toe met de beste compatibiliteit met beide restrictie enzymen.
   3. Voeg 15 μL van het recipiënte plasmide (200 ng/μL) toe.
   4. Voeg 1,5 μL van elk restrictie-enzym toe.
   5. Meng kort door Vortex en inincuberen bij 37,5 °C 's nachts.
      Opmerking: het is belangrijk om 3 μg van het recipiënte plasmide te gebruiken om voldoende materiaal te verkrijgen na de reiniging van de DNA-agarose gel. Het is ook relevant om DNA-digestons 's nachts te laten met behulp van beide enzymen om een hoge kloon efficiëntie te verkrijgen.

4. reiniging en klonen van DNA-agarose gel

1. Bereid een 1% agarose gel voor het uitvoeren van de verteerde DNA plasmide en inserts en doorgaan met het snijden van de bijbehorende bands. Zodra de corresponderende vector en insert bands zijn purified12, bepaal de DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer.
2. Voer DNA-ligatie uit om de wisselplaat aan de ontvangende plasmide te smelten.
3. Bereid ligatie reacties van ongeveer 100 ng totaal DNA inclusief 50 ng plasmide vector.
4. Instellen van de ontvanger plasmide-insert ratio van ongeveer 1:3; het kan worden berekend met behulp van een vector-insert Calculator¹³.
5. Negatieve controles parallel instellen. Bijvoorbeeld, een ligatie van het recipiënte plasmide DNA zonder enige toevoeging geeft informatie over hoeveel achtergrond van onverteerde of zelfdragende recipiënte plasmide aanwezig is.

5. transformatie van klonen

1. Plaats een buis van DH5α bevoegde cellen uit de vriezer bij-80 °C en breng het onmiddellijk over op ijs gedurende 20 minuten.
2. Neem na die tijd 55 μL van DH5α bevoegde cellen en voeg 4 μL ligatie reactie toe en meng door de buis te flikken en op ijs te bewaren voor 45 min.
3. Plaats de buis in een waterbad eerder opgewarmd op 42 ° c voor precies 48 s en onmiddellijk krijgen de buizen terug op ijs voor nog eens 3 min.
4. Voeg 600 μL Luria Bouillon (LB) medium eerder opgewarmd bij 37,5 °C en incuberen met 1 uur schudden bij 200 rpm.
5. Breng 200 μL over in een agar-plaat met ampicilinin 100 μg/mL en verdeel zachtjes over het oppervlak met de vloeistof meestal geabsorbeerd.
6. Incuberen de platen 's nachts om de kolonies volgende ochtend te zien. De ontvangende plasmide op de insert Plate moet significant meer kolonies hebben dan de ontvangende plasmide alleen plaat.

6. isolatie van het afgewerkte plasmide

1. Kies 3-10 individuele bacteriële kolonies en breng in 1 mL LB medium dat ampicilinebevattende (100 μg/mL) bevat en inincuberen gedurende 6 uur.
2. Neem 200 μL bacteriële suspensie en breng over naar 5 ml lb-medium dat dezelfde concentratie ampicilinegehalte bevat als in stap 6,1, en incubeer 's nachts bij 37,5 °c met schudden bij 200 rpm.
3. Gebruik een miniprep DNA Kit zuivering, uitvoeren miniprep DNA-zuiveringen met behulp van 5 mL LB geteeld 's nachts volgens de instructies van de fabrikant¹⁴.
4. Om succesvolle ligaties te identificeren, stelt u PCR-reacties op dezelfde manier in als in sectie 2 met behulp van het DNA dat is verkregen uit stap 6,3 als een sjabloon met dezelfde primers als in punt 2 tijdens de eerste PCR. Positieve klonen zullen PCR-producten produceren met de overeenkomstige grootte.
5. Na grote prep DNA zuivering van de positieve klonen, voeren een diagnostische beperking vertering van 500 ng van gezuiverd DNA met de enzymen gebruikt tijdens de kloon stap en voer de verteerde producten op een 1% agarose gel. Er moeten twee bands zijn: één van de grootte van de vector en één van de grootte van de nieuwe insert.
6. Controleer de construct volgorde door sequentiëren met behulp van de volgende primers: Forward 5 '-aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3 ' en reverse 5 '-gcatttttttcactgcattctagtt-3 '.
   Opmerking: wanneer DNA wordt gerepliceerd met behulp van PCR, is er altijd de mogelijkheid van fouten tijdens de versterking zelfs bij het gebruik van een high-fidelity polymerase, daarom is het zeer belangrijk om de volgorde van de laatste constructies.

7. transfectie en eiwit expressie

1. In een eerder poly-L-lysine-gecoate witte 96 goed plaat, voer celseeding één dag vóór transfectie op 2,5 x 10⁴ cellen per goed met behulp van dulbecco's gemodificeerde eagle's medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 U/ml Penicillaire G, en 100 μg/ mL streptomycine.
2. Gebruik alleen de 60 binnenste putjes om het potentieel voor thermische hellingen over de plaat en de randeffecten van verdamping te minimaliseren. Voeg 200 μL steriel gedestilleerd water toe aan de 36 buiten putten en 150 μL in de ruimten tussen putjes en inincuberen gedurende een nacht bij 37,5 °C en 5% van CO₂.
3. De volgende ochtend voeren transfectie met behulp van 100 ng van totaal DNA (50 ng elke construct).
4. Stel vier verschillende plasmide combinaties (receptor: β-vanger) in volgens Figuur 2b.
5. Gebruik voor elke plasmide combinatie 20 μL gemodificeerde Eagle's minimale essentiële Media gebufferd met HEPES met 0,3 μL lipidische transfectiereagens per put.
6. Voeg 20 μL lipidische transfectiereagens-DNA-mengsel toe aan elk goed en meng de plaat in cirkels gedurende 10 sec.
7. Verander vers medium na 6 uur incubatie bij 37,5 °C en 5% CO₂.
8. Incuberen de plaat voor 24 uur bij 37,5 °C en 5% CO₂.

8. monitoring receptor-β-arrestin1/2 interacties in HEK293 cellen

1. Aspirate medium en voeg 100 μL gemodificeerde Eagle's minimale essentiële Media gebufferd met HEPES aan elk goed en laat de plaat stabiliseren bij RT voor 10 min.
2. Bereid het furimazine substraat door 1 volume van 100x substraat te combineren met 19 volumes van LCS verdunnings buffer (een 20-voudige verdunning)¹¹, waardoor een 5x voorraad wordt gemaakt om te mengen met celkweekmedium.
3. Voeg 25 μL 5x furimazine toe aan elk goed en meng in kringen zachtjes gedurende 10 sec.
4. Meet de luminescentie gedurende 10 minuten voor signaal stabilisatie bij RT.
   Opmerking: door het gebruik van dit basislijn signaal om de respons van elk goed te normaliseren, zal het bijdragen aan het verminderen van variabiliteit veroorzaakt door verschillen in het aantal cellen per put, ook verschillen in Transfectie-efficiëntie, enz. Eenmaal berekend, gemiddelde de genormaliseerde reactie van repliceren putten voor een bepaalde medicamenteuze behandeling.
5. Bereid 13,5 x ligand-oplossing in gemodificeerde Eagle's minimale essentiële Media gebufferd met HEPES.
6. Voor experimenten bij kamertemperatuur met 10 μL 13,5 x ligand toevoeging, voeg de verbindingen met behulp van injectoren of een multichannel pipet en meng de plaat met de hand of met behulp van een rondschudder (20 s bij 200 rpm).
7. Voor experimenten met 37,5 °C met 10 μL 13,5 x ligand toevoeging, gebruik injectoren om verbindingen te doseren en meng met behulp van het instrument orbitale Shaker. In het geval van het niet gebruiken van injectoren, verwijder de plaat van de luminometer, voeg de liganden en meng de plaat met de hand of met behulp van een rondschudder (20 s bij 200 rpm).
   Opmerking: gebruik injectoren en een shaker binnen het detectie-instrument om temperatuurschommelingen bij het verwijderen van de plaat van de luminometer te minimaliseren. Voor deze test kunnen standaard lichtmeters worden gebruikt. Gebruik een integratie tijd van 0,25 – 2 sec.

Resultaten

Met behulp van de hier gepresenteerde procedure werden de interacties tussen een prototypische GPCR en twee β-vanger-isovormen gemonitord. Glucagon zoals Peptide Receptor (GLP-1R) constructies werden gemaakt met behulp van primers met NheI en EcoRI enzym restrictie sites en gekloond in de vectoren pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] terwijl in het geval van β-vanger, twee extra vectoren werden gebruikte pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] met behulp van enzym beperkings sites BgIII en EcoRI in het g...

Discussie

Met behulp van de hier gepresenteerde methode kunnen interacties tussen GPCR en β-arrestin1/2 worden bewaakt in real time levende systemen met deze GPCR-β-vanger in structurele complementatie test. In dit verband waren we in staat om de differentiële β-vanger in de rekrutering tussen de twee β--vanger-isovormen te observeren door de GLP-1R (een prototypische klasse B GPCR), we observeerden ook een dissociatie van de receptor-β-vanger in complex enkele minuten na het bereiken van de maximale lichtgevende signaal.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Antibiotics penicillin streptomycin	Welgene	LS202-02	Penicillin/Streptomycin
Bacteria Incubatie Apparaat	JEIO Tech	IB-05G	Incubator (Air-Jacket), Basic
Celcultuur medium	Welgene	LM 001-05	DMEM Celcultuur Medium
Celcultuur transfectie medium	Gibco	31985-070	Optimem 1X celcultuur medium
CO2 Incubatie Apparaat	NUAIRE	NU5720	Direct Heat CO2 Incubatie Apparaat
Digitaal waterbad	Lab Tech	LWB-122D	Digitaal waterbad lab tech
DNA Polymerase proofreading	ELPIS Biotech	EBT-1011	PfU DNA polymerase
DNA zuiveringskit	Cosmogenetech	CMP0112	miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini
DNA Taq Polymerase	Enzynomics	P750	nTaq DNA polymerase
Enzyme restrictie BglII	New England Biolabs	R0144L	BglII
Enzyme restrictie buffer	New England Biolabs	B72045	CutSmart 10X Buffer
Enzyme restrictie EcoRI	New England Biolabs	R3101L	EcoRI-HF
Enzyme restrictie NheI	New England Biolabs	R01315	NheI
Enzyme restrictie XhoI	New England Biolabs	R0146L	XhoI
Fetaal bovien serum	Gibco Canada	12483020	Fetaal bovien serum
Gel/PCR DNA MiniKit	Real Biotech Corporation	KH23108	HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
Ligase	ELPIS Biotech	EBT-1025	T4 DNA Ligase
Lichtmicroscoop	Olympus	CKX53SF	CKX53 Microscoop Olympus
Lipide transfectiere reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000
Luminometer	Biotek/Fisher Scientific	12504386	Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers
NanoBiT Systeem	Promega	N2014	NanoBiT PPI MCS Starter Systeem
Nanoluciferase substraat	Promega	N2012	Nano-Glo Live Cell assay systeem
PCR Thermische cycler	Eppendorf	6336000015	Master cycler Nexus SX1
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P4707-50ML	Poly-L-lysine oplossing
Trypsine EDTA	Gibco	25200-056	Trypsine EDTA 10X
Witte Celcultuur 96 wel plaatjes	Corning	3917	Assay Plate 96 wel plaatje