Hier laten we zien hoe je een goedkope volt-Amperemeter opzetten met programmeerbare uitgangsfrequentie die kan worden gebruikt met in de handel verkrijgbare Chopstick-elektroden voor transepitheliale/endotheliale elektrische weerstand metingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een eenvoudige benadering om TEER metingen uit te voeren met behulp van een zelfgemaakte volt-Amperemeter met programmeerbare uitgangsfrequentie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Transepitheliale/endotheliale elektrische weerstand (TEER) is sinds de jaren tachtig gebruikt om de confluentie en permeabiliteit van in vitro Barrier modelsystemen te bepalen. In de meeste gevallen worden Chopstick-elektroden gebruikt om de elektrische impedantie tussen het bovenste en onderste compartiment van een celcultuurfilterinvoegsysteem met cellulaire monolagen te bepalen. Het filtermembraan stelt de cellen in staat om te hechten, te polariseren en te communiceren door nauwe kruisingen te bouwen. Deze techniek is beschreven met een verscheidenheid van verschillende cellijnen (bijvoorbeeld cellen van de bloed-hersen barrière, bloed-cerebrospinale vloeistof barrière, of gastro-intestinale en pulmonaire tractus). TEER meetapparatuur kan gemakkelijk worden verkregen van verschillende leveranciers van laboratoriumapparatuur. Er zijn echter kostenbesparende en aanpasbare oplossingen denkbaar als een geschikte voltammeter zelf wordt geassembleerd. Het algemene doel van deze publicatie is het opzetten van een betrouwbaar apparaat met programmeerbare uitgangsfrequentie dat kan worden gebruikt met in de handel verkrijgbare Chopstick-elektroden voor TEER-meting.
Inleiding
Epitheliale en endotheliale cellen functioneren als cellulaire grenzen, scheiden van de apicale en basolateraal zijden van het lichaam. Als ze zijn verbonden door middel van nauwe kruispunten, is passieve substantie diffusie door de paracellulaire ruimten beperkt1, resulterend in de vorming van een selectief permeabele barrière. Verschillende kunstmatige barrière systemen zijn ontwikkeld2 met behulp van microvasculaire endotheliale cellen (hbmec, bloed-hersen barrière3,4,5,6,7), vaatvlies plexus Epitheelcellen (hibcpp/pcpec, bloed-cerebrospinale vloeistof barrière8,9,10,11,12,13,14), colorectale adenocarcinoom cellen (CaCO-2, gastro-intestinale modellen15), of luchtweg/alveolaire cellijnen (pulmonale modellen16,17). Deze systemen bestaan meestal uit cellen die zijn gekweekt in een monolaag op permeabele membranen (d.w.z. filter insert-systemen) om toegang te geven tot de apicale en basolateraal zijden. Het is belangrijk dat de integriteit van het modelsysteem overeenkomt met de in vivo omstandigheden. Daarom zijn er verschillende technieken ontwikkeld om de barrièrefunctie te analyseren door de paracellulaire diffusie van Tracer verbindingen over de cellaag te meten. Deze stoffen zijn voorzien van van sucrose, kleurstof gelabelde albumine, FITC-gelabelde inuline of kleurstof gelabeld dextranen2. Chemische kleurstoffen kunnen cellen echter onbruikbaar maken voor verdere experimenten. Om barrière systemen niet invasief te bewaken, kan meting van transepitheliale/transendotheliale elektrische weerstand (teer) over een cellulaire monolaag worden gebruikt2,18,19. Omdat bipolaire elektrode systemen worden beïnvloed door de elektrode polarisatie impedantie bij de elektrode-elektrolyt-interface, worden tetrapolar-metingen over het algemeen gebruikt om deze beperking te overwinnen20. De onderlegtechniek is een vier-terminale sensing (4T) die voor het eerst werd beschreven in 1861 door William Thomson (Lord Kelvin)21. In het kort, de stroom wordt geïnjecteerd door een paar stroom-dragende elektroden terwijl een tweede paar spanning-sensing elektroden wordt gebruikt voor het meten van de spanningsdaling20. Tegenwoordig, zogenaamde Chopstick elektroden bestaan uit een paar dubbele elektroden, elk met een zilver/zilverchloride pellet voor het meten van spanning en een zilveren elektrode voor het passeren van de huidige2. De elektrische impedantie wordt gemeten tussen de apicale en het basolaterale compartiment met de cellaag daartussenin (Figuur 1). Een vierkante Golf signaal met een frequentie van meestal 12,5 Hz wordt toegepast op de buitenste elektroden en de resulterende wisselstroom (AC) gemeten. Bovendien wordt de potentiële druppel over de cellaag gemeten door het tweede (binnenste) elektrode paar. De elektrische impedantie wordt vervolgens berekend volgens de wet van Ohm. TEER-waarden worden genormaliseerd door vermenigvuldiging van de impedantie en het oppervlak van de cellaag en worden meestal uitgedrukt als Ω ∙ cm2.
Er zijn systemen waarin cellen en elektroden op een meer verfijnde manier worden gerangschikt, maar zijn ook gebaseerd op het 4T-meetprincipe en kunnen worden gebruikt met dezelfde meetapparatuur. EndOhm systemen, bijvoorbeeld, waarin het filter wordt ingebracht, bevatten een kamer en dop met een paar concentrische elektroden met dezelfde structuur als de Chopstick-elektrode. De vorm van de elektroden zorgt voor een meer uniforme stroom dichtheids stroming over het membraan, waardoor de variatie tussen metingen wordt verminderd. Nog complexer (maar ook accurater) is een Ussing kamer, waarbij een cellaag twee kamers scheidt die gevuld zijn met Ringer's Solution22. De kamer zelf kan worden verstoken met zuurstof, CO2, of N2, en geroerd of aangevuld met experimentele stoffen. Als Ion transport over de cellaag optreedt, kan een potentiaalverschil worden gemeten door twee voltage-sensing elektroden in de buurt van het weefsel. Deze spanning wordt geannuleerd door twee stroomdragende elektroden die naast de cellaag zijn geplaatst. De gemeten stroom geeft dan het netto Ion-transport en de transepitheliale weerstand, die de barrière-integriteit weerspiegelt, kan worden bepaald22. De teer meting kan ook worden toegepast op Body-on-a-chip systemen die de barrière modellen23,24vertegenwoordigen. Deze systemen na te bootsen in vivo omstandigheden van de cellen en vaak bestaan uit verschillende soorten cellen, gestapeld bovenop elkaar in lagen.
Het volgende protocol legt uit hoe u een kosteneffectieve en betrouwbare voltammeter instellen met programmeerbare uitgangsfrequentie die geen statistisch significante verschillen in TEER oplevert in vergelijking met commercieel verkrijgbare meetsystemen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. montage van een basis-volt-Amperemeter voor TEER meting
- Bereid een standaard USB-oplader voor als de 5 V DC-voeding, een USB-verlengsnoer, een microcontroller die zal worden gebruikt als een programmeerbare vierkante golfgenerator, twee standaard multimeters die in staat zijn om wisselstroom en spanning te meten als root mean Square ( True-RMS), vier kabels met banaanpluggen, een telefoon verlengsnoer met een RJ14 female connector, inclusief zes pinnen met de binnenste vier bedrade (6P4C), twee korte kabels, een Luster Terminal, een 120 kΩ voor weerstand, adereindferrules en soldeer lugs. De benodigde gereedschappen zijn een isolatie stripper, een krimptang en een soldeerbout.
- Sluit eerst de USB-extensie aan op de microcontroller-kaart.
- Strip de eind isolatie van twee korte kabels. Soldeer één zijde per kabel ofwel direct op de pinnen 0 en 2 van de microcontroller of op soldeer lugs, die op hun beurt op de respectievelijke pinnen worden geknipt. Krimp de andere uiteinden aan de adereindferregels en verbind ze met een glans klem zoals afgebeeld in Figuur 1.
- Koppel de banaanpluggen aan de multimeters. En krimp het andere uiteinde van elk van de vier kabels.
- Knip het verlengsnoer van de telefoon in twee delen en Demonteer en krimp de geleiders van de zijkant met de vrouwelijke connector. Controleer de continuïteit van de geleiders en pinnen.
- De eerste multimeter wordt gebruikt om de stroom in μA te meten (merk op dat de AC-modus expliciet moet worden ingesteld). Sluit het in een serie met een 120 kΩ voor weerstand aan pinnen vijf en zes van de RJ14 connector, overeenkomend met de buitenste elektrode paar van de Chopstick-elektrode.
- Koppel ten slotte de tweede multimeter, die zal worden gebruikt voor het meten van de transepitheliale voltage drop in mV, via de Luster terminal naar pinnen drie en vier van de RJ14 connector, overeenkomend met het binnenste elektrode paar van de Chopstick-elektrode.
- Monteer indien gewenst de installatie in een chassis.
2. programmering van de microcontroller
- Wijzig indien nodig de opgegeven broncode (aanvullend Codeer bestand 1). In de gegeven vorm, pinnen 0 en 2 wisselt tussen grond en + 5 V met 40 MS half-tijd van oscillatie. Zo wordt een vierkante Golf signaal met een amplitude van 5 V en een frequentie van ongeveer 12,5 Hz gegenereerd. De werkelijke waarden kunnen afwijken als gevolg van de onnauwkeurigheid van de tijd emitter van de microcontroller.
- Verbind de microcontroller met een desktopcomputer via een USB-poort en upload de broncode met bijpassende software25.
3. registratie van spannings oscillogrammen (optioneel)
- Bypass pinnen vijf en zes van de RJ14 connector met een 1 kΩ test weerstand en verbinding maken met een oscilloscoop.
- Controleer de frequentie, piekspanning en golfvorm. Digitaliseer en exporteer de gegevens.
- Indien gewenst, record oscillogrammen van een referentie-apparaat (EVOM) en de zelf-geassembleerde voltammeter ter vergelijking.
Opmerking: in dit geval werden de gegevens opgenomen met een digitale opslag Scope HM 208. Omdat het een zeer elementaire digitale oscilloscoop is, kon het beeld intern worden gedigitaliseerd (bevroren), maar moest het worden getekend met een analoge PM 8143 X-Y recorder. De afbeelding is vervolgens gescand.
4. celkweek en TEER meting
- Zaad humaan choroid plexus Papilloma (HIBCPP) cellen op celkweek filter inserts met een poriegrootte van 3 μm in DMEM/F12 (Zie tabel van de materialen) met 10% foetaal kalf serum9. Kweek de cellen bij 37 °C in een verzadigde water atmosfeer met 5% CO2 , zoals beschreven door Dinner et al.9.
- Wanneer de filters een impedantie van 70 Ω ∙ cm2bereiken, verander dan in serum vrije DMEM/F12 en definieer het tijdpunt als dag 0.
- Sluit de elektrode aan op de RJ14-poort van de zelf-geassembleerde voltammeter en sluit de USB-stroomtoevoer aan. Stel de multimeters naar AC voltage mode (mV) en AC Current mode (μA), respectievelijk.
- U ook de elektrode aansluiten op een in de handel verkrijgbare referentie-apparaat en inschakelen volgens de instructies van de fabrikant.
- Steriliseer de elektrode in 80% ethanol gedurende 10 min en equilibreren in het juiste medium voor nog eens 10 min.
- Plaats de elektrode in beide compartimenten van een celcultuurfilterinvoegsysteem (het langere deel van de elektrode in het onderste compartiment en het kortere deel in het bovenste compartiment) dat een HIBCPP-cellaag bevat totdat de meetwaarden constant blijven.
- Voor een referentie-apparaat, noteer de impedantie direct of Bereken de impedantie volgens de wet van Ohm (R = U/I) voor de zelf-geassembleerde voltammeter. Houd er rekening mee dat de elektrode hoek de metingen beïnvloedt.
- Herhaal de TEER meting (stap 3 − 6) van dag 0 tot dag 4.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de werking van een zelf-geassembleerde voltammeter te vergelijken met zijn in de handel verkrijgbare tegenhanger, werd een spannings oscillogram van beide apparaten opgenomen.
Zoals weergegeven in Figuur 2a, heeft het referentie-instrument een vierkant Golf signaal gegenereerd met een amplitude van 80 MV en een oscillatie tijd van 80 MS, wat overeenkomt met een frequentie van 12,5 Hz, bij het...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Voordat een zelfgemaakte voltammeter kan worden gebruikt in een dagelijkse routine, is het essentieel om het apparaat te controleren op de juiste functie. In ons geval werd een halve tijd van oscillatie van 40 MS (12,5 Hz) geprogrammeerd, maar de effectieve oscillatie tijd bleek 60 MS (16,7 Hz). Deze onnauwkeurigheid van de tijd emitter van de microcontroller had geen detecteerbare impact op TEER-metingen. Het is misschien het beste om de werkelijke frequentie te bepalen met behulp van de frequentie-instelling van een va...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere conflicten van belang.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Herman Liggesmeyer en Marvin bende graag bedanken voor hun deskundig advies in elektrotechniek en informatica.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 120 kOhm weerstand | Algemeen (generiek) apparatuur | ||
| Banaanstekker kabels | Algemeen (generiek) apparatuur | ||
| Kabels | Algemeen (generiek) apparatuur | ||
| Chopstick elektrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick elektrode (alternatief) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Krimptang | Algemeen gereedschap | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetaal calf serum (FCS)/Fetaal bovien serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm transparant | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Isolatiestrikker | Algemeen gereedschap | ||
| Lusterklem | Algemeen (generiek) apparatuur | ||
| Oscilloscoop | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotmachine | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Loodbout | Algemeen gereedschap | ||
| Loodhulzen | Algemeen (generiek) apparatuur | ||
| Telefoonkabel met RJ14 (6P4C) connector | Algemeen (generiek) apparatuur | ||
| Testweerstand | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB oplader | Algemeen (generiek) apparatuur | ||
| USB verlengsnoer | Algemeen (generiek) apparatuur | ||
| Voltohmmeter voor TEER meting | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter voor TEER meting (alternatief) | Merck Millicell | ERS | |
| Kabeleindenhulzen | Algemeen (generiek) apparatuur |
Referenties
- Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
- Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160(2014).
- Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).
- Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).
- Ishiwata, I., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP). Human Cell. 18, 67-72 (2005).
- Dinner, S., et al. A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Schwerk, C., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PLoS One. 7, e30069(2012).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).
- Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).
- Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes. Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).
- Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).
- Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).
- Mathia, N. R., et al. Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats. Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).
- Fuchs, S., et al. Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C. Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Yeste, J., et al. Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures. Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754(2016).
- Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. Methods of Measuring Electrical Resistance. , McGraw-Hill. 100-131 (1912).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).
- Esch, M. B., et al. On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic 'body-on-a-chip' devices. Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).
- Arduino IDE. Arduino Web Editor. , https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5(2013).
- Hufnagl, M. Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , University of Vienna. (2010).
- Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. Dössel, O., Schlegel, W. C. 25/7, Springer. Berlin, Heidelberg. (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
