Deze methode beschrijft de monstervoorbereiding uit gekweekte cellen en dierlijk weefsel, extractie en derivatisering van coenzym A in de monsters, gevolgd door hogedrukvloeistofchromatografie voor zuivering en kwantificering van het guarderivaten coenzym a door absorptie of fluorescentiedetectie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantificering van co-enzym A in cellen en weefsels
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Opkomende onderzoek is gebleken dat het cellulaire co-enzym A (CoA) levering kan worden beperkt met een nadelig effect op de groei, metabolisme en overleving. Meting van cellulaire CoA is een uitdaging vanwege de relatief lage overvloed en de dynamische omzetting van gratis CoA naar CoA thioesters die, op zijn beurt, deelnemen aan talrijke metabole reacties. Een methode wordt beschreven die tijdens de monstervoorbereiding door potentiële valkuilen navigeert om een assay te leveren met een breed lineair detectiebereik dat geschikt is voor gebruik in vele biomedische laboratoria.
Inleiding
Co-enzym A (CoA) is een essentiële cofactor in alle levende organismen en wordt gesynthetiseerd uit pantotheenzuur, ook wel pantothenaat (het zout van pantotheenzuur) of vitamine B5. CoA is de belangrijkste intracellulaire drager van organische zuren, met inbegrip van korte-keten-zuren zoals acetaat en succinaat, tak-keten zuren zoals propionaat en methylmalonaat, lange-keten vetzuren zoals palmitaat en OLEAAT, zeer lange-keten vetzuren zoals meervoudig onverzadigde vetzuren en xenobiotica zoals valproïnezuur. Het organisch zuur vormt een thio ester binding enzymatisch met CoA om het gebruik ervan als substraat in meer dan 100 reacties in intermediair metabolisme
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De in dit protocol bedoelde dier procedure is uitgevoerd volgens de protocollen 323 en 556 en is specifiek goedgekeurd door het St. Jude Children's Research Hospital institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité.
1. voorbereiding van de oplossingen
Opmerking: gebruik ultrapuur water voor alle oplossingen en indien aangegeven in procedures.
- Bereid 1 mM kaliumhydroxide (KOH) in water.
- Bereid 0,25 M KOH in water.
- Bereid 1 M Trizma-HCl in water en breng aan op pH 8,0.
- Bereid 100 mM monobromobimane (mBBr) in acetonitril (Optima grade). Stock oplossingen van mBBr zijn stabiel bij-....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een relatief snelle en betrouwbare methode voor de detectie van totaal CoA in gekweekte cellen en weefsels is ontwikkeld door het thiol van CoA te derivatiseren tot een fluorescerende stof met behulp van mBBr, en vervolgens de afgeleide CoA-bimane te zuiveren met behulp van omgekeerde fase HPLC. Een standaard curve wordt eerst gegenereerd, waar bekend en toenemende hoeveelheden van de CoA-bimane standaard worden individueel geïnjecteerd en de gebieden onder de pieken in de CoA-bimane chromatogrammen worden uitgezet als e.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier tonen we een betrouwbare, stapsgewijze procedure voor het kwantificeren van totaal CoA in cellen en dierlijke weefsels met een breed scala aan lineaire detectie die toegankelijk is in veel laboratoria met een HPLC met een absorptie-of fluorescentie-uitgangs detector. Als alternatief is massaspectrometrie een veelgebruikte techniek voor het evalueren van CoA-en CoA-thioesters, maar is niet algemeen beschikbaar vanwege de kosten van de instrumentatie en de gespecialiseerde kennis die nodig is voor de ontwikkeling van .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
MWF, CS en SJ schreven de krant, MWF en CS verstrekte de gegevens en de cijfers, COR ontwierp de experimenten en heeft het manuscript kritisch bekeken. SJ en Cor zijn uitvinders op een octrooiaanvraag in behandeling (PCT/US17/39037) "kleine molecuul modulatoren van pantothenaat kinases" gehouden door St. Jude children's Research Hospital die betrekking heeft op de PZ-2891 compound waarnaar wordt verwezen in dit artikel.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de financiering van gesponsord onderzoek dat wordt aangeboden door CoA Therapeutics, Inc., een dochteronderneming van BridgeBio LLC, de National Institutes of Health Grant GM34496, en de Amerikaanse Libanese Syrische geassocieerde liefdadigheidsinstellingen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
Referenties
- Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
- Jackowski, S., Rock, C. O.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
