Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ruimtelijke temporele analyse van Fieldwise flow in Microvasculatuur

5.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60493

⸱

18 november 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biocomplexity Institute, Indiana University, 2Department of Intelligent Systems Engineering, Indiana University, 3Department of Physics, Indiana University, 4Scientific Designs, 5Department of Medicine, Indiana University, 6School of Public Health, Indiana University

In dit artikel

Samenvatting

Om de microvasculaire stroom te kwantificeren uit hoge snelheid capillaire flow beeld sequenties, ontwikkelden we medewerkers (ruimtelijke temporele analyse van Fieldwise flow) software. In het volledige afbeeldingsveld en na verloop van tijd evalueert het personeel stroomsnelheden en genereert het een reeks ruimtelijke kaarten met kleurcodering voor visualisatie en tabellaire uitvoer voor kwantitatieve analyses.

Samenvatting

Veranderingen in de bloedstroomsnelheid en-verdeling zijn van vitaal belang voor het behoud van weefsel-en orgaan perfusie in reactie op verschillende cellulaire behoeften. Verder kan het verschijnen van defecten in de microcirculatie een primaire indicator zijn in de ontwikkeling van meerdere pathologieën. Vooruitgang in optische beeldvorming hebben intravital microscopie (IVM) een praktische aanpak, waardoor beeldvorming op cellulair en subcellulair niveau in levende dieren op hoge snelheid na verloop van tijd. Toch wordt, ondanks het belang van het handhaven van adequate weefsel perfusie, de ruimtelijke en temporele variabiliteit in capillaire stroming zelden gedocumenteerd. In de standaardbenadering wordt gedurende een beperkte tijd een klein aantal capillaire segmenten gekozen voorbeeld vorming. Om de capillaire stroming volledig te kwantificeren op een onbevooroordeelde manier ontwikkelden we ruimtelijke temporele analyse van Fieldwise flow (STAFF), een macro voor FIJI open-source beeldanalyse software. Met behulp van High-Speed beeld sequenties van volledige velden van de bloedtoevoer binnen de haarvaten, produceert het personeel beelden die beweging in de tijd voorstellen genaamd kymographs voor elk tijdsinterval voor elk vasculaire segment. Vanuit de kymografen berekent het personeel snelheden van de afstand die rode bloedcellen na verloop van tijd verplaatsen, en voert de snelheidsgegevens uit als een reeks kleurgecodeerde ruimtelijke kaarten voor visualisatie en in tabelvorm uitvoer voor kwantitatieve analyses. Bij normale muis levers analyseert het personeel gekwantificeerde diepgaande verschillen in stromingssnelheid tussen pericentrale en periportaalgebieden binnen lobules. Nog meer onverwachte zijn de verschillen in stromingssnelheid gezien tussen sinusoïden die naast elkaar staan en schommelingen die binnen enkele seconden in afzonderlijke vasculaire segmenten worden gezien. MEDEWERKERS is een krachtige nieuwe tool die in staat is om nieuwe inzichten te bieden door meting van de complexe spatiotemporele dynamiek van capillaire stroming mogelijk te maken.

Inleiding

De Microvasculatuur speelt een cruciale rol in de Fysiologie en zorgt voor een effectieve perfusie van weefsels onder veranderende omstandigheden. Microvasculaire disfunctie wordt geassocieerd met talloze aandoeningen, waaronder langdurige cardiovasculaire morbiditeit en sterfte, ontwikkeling van dementie en ziekte van zowel de lever als de nieren en is dus een belangrijke factor van belang in een breed scala van biomedische onderzoeken1,2,3,4,5. Hoewel meerdere technieken zijn gebruikt om weefsel perfusie te evalueren, maakt alleen intravital microscopie het verzamelen van gegevens mogelijk in de temporele en ruimtelijke resolutie die nodig zijn om de bloedtoevoer op het niveau van individuele haarvaten te karakteriseren.

Microvasculaire stroming kan worden gevisualiseerd in fluorescentiemicroscopie door de beweging van fluorescerende microsferen of door de verplaatsing van rode bloedcellen tegen de achtergrond van membraan-imperbetekende fluorescerende markers (bijv. fluorescently-gelabeld dextran of albumine)6,7. Microvasculaire stroming kan worden afgebeeld in oppervlakkige cellagen met behulp van Widefield microscopie, of op diepte met behulp van confocale of multiphoton microscopie. Capillaire stroomsnelheden zijn echter zodanig dat de passage van rode bloedcellen over het algemeen niet kan worden opgevangen bij snelheden van minder dan 60 frames/s. Aangezien de meeste laser scanning confocale en multiphoton microscopen 1 – 5 s nodig hebben om een volledig afbeeldingsveld te scannen, kan deze snelheid over het algemeen alleen worden bereikt door het gezichtsveld te beperken, soms tot één scanlijn8. Het proces van het beperken van metingen tot geselecteerde capillaire segmenten (1) heeft het potentieel om selectie bias in te voeren en (2) maakt het onmogelijk om ruimtelijke en temporele heterogeniteit vast te leggen in de tarieven van capillaire bloedstroom. Daarentegen kunnen beelden van capillaire netwerken worden verzameld met snelheden van meer dan 100 fps met behulp van Widefield Digitale microscopen uitgerust met wetenschappelijke complementaire metaaloxide Semiconductor (scmos) camera's9,10. Deze goedkope systemen, gebruikelijk in typische biomedische laboratoria, maken het mogelijk om microvasculaire stroming in hele tweedimensionale netwerken te afbeelen, in essentie continu. Het probleem wordt dan een van het vinden van een analyse aanpak die in staat is om zinvolle kwantitatieve gegevens uit de massale en complexe beeld datasets gegenereerd door High-speed video microscopie te extraheren.

Om de analyse van de volledige veld stroom gegevens in te schakelen hebben we personeel ontwikkeld, nieuwe beeldanalyse software die continu microvasculaire flow kan meten in hele Microscoop velden van beeld reeksen verzameld op hoge snelheid11. De aanpak is compatibel met een verscheidenheid aan verschillende experimentele systemen en beeldvormings modaliteiten en de beeldanalyse software van het personeel wordt geïmplementeerd als een macro-toolset voor de FIJI-implementatie van ImageJ12. Het onderliggende principe dat hier wordt gebruikt om microvasculaire stroming te visualiseren, is dat eerst enig contrast moet worden verschaft om de rode bloedcellen binnen haarvaten te kunnen afbeelden. In onze studies, contrast wordt geleverd door een bulk fluorescerende sonde die wordt uitgesloten door de rode bloedcellen. De snelheid van de stroming kan vervolgens worden gekwantificeerd van de verplaatsing van de rode bloedcellen die verschijnen als een negatieve vlek binnen het fluorescently gelabelde plasma in beelden verzameld op hoge snelheid van een levend dier8. Vervolgens gebruiken we medewerkers om een afstand te maken langs elk capillair segment over meerdere intervallen van de tijd met de naam kymographs, en detecteren vervolgens de hellingen die aanwezig zijn in de kymographs13, en van die hellingen worden de percentages van de microvasculaire stroming berekend. De aanpak kan worden toegepast op beelden die zijn verzameld van een capillair bed dat toegankelijk is voorbeeld vorming. Hier beschrijven we de toepassing van IVM en personeel aan studies van de bloedtoevoer in de lever.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dier experimenten werden goedgekeurd en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de institutionele Dierenzorg en het gebruik van de Universiteit van Indiana, en werden opgevolgd door de NRC gids voor de verzorging en het gebruik van dieren.

1. chirurgische voorbereiding voor Intravital microscopie

Opmerking: Dit is geen overlevings operatie. Zodra sectie 1 "chirurgische voorbereiding voor intravital microscopie" is begonnen, kan het werk niet worden onderbroken tot de voltooiing van sectie 2 "Intravital microscopie".

  1. Acclimatiseren 9 – 10 week-oude mannelijke C57BL/6 muizen, voor ten minste 4 dagen en snel voor 16 h voorafgaand aan de studies.
  2. Weeg het dier, bezadigd met 5% Isofluraan en plaats op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur te behouden. Gebruik een zuurstof debiet van 1 – 2 L/min en behoud sedatie met 1-2% isoflurane. Controleer reflexen door teen knijpen. Controleer de temperatuur met een rectale thermometer. Controleer de hartslag en ademhaling visueel.
  3. Wanneer anesthesie is stabiel, scheren het gebied voor de plaatsing van de halsader cannulatie en het gebied onder de ribbenkast voor de blootstelling van de lever.
  4. Voor de jugulaire cannulatie, maak een 1 cm linker ventrale incisie 1 – 2 cm onder de kaak van de muis. Wis alle vet en fascia rond de halsader ader. Bind het voorste uiteinde van de halsader met behulp van 06 hecht tekenreeks om bloeden te voorkomen.
    1. Maak een kleine Nick in de halsader ader en schuif de canule (30 G x 1/2 in, naald), naald houder en polyethyleen slang (0,011 x 0,024 inch2 bevestigd aan een Luer stub-adapter en gevuld met 0,9% zoutoplossing) in ongeveer 1 cm, en Bevestig aan het achterste uiteinde van de halsader met behulp van 0-6 hecht tekenreeks.
  5. Met behulp van de halsader canule leveren 70 kDa fluoresceïne dextran (tot een dosis van 30 mg/kg via injectie van 0,1 ml van een 9 mg/ml oplossing in zout).
  6. Bloot de lever voorbeeld vorming door het maken van een 4 – 6 cm incisie over de romp, 1 – 2 cm onder het midden van de ribbenkast.
  7. Plaats een natte (geweekt in 0,9% zoutoplossing) 2 x 2 inch2 gaas spons onder de linker laterale lever kwal. Plaats de tape op de omtrek van de glazen ruit van een 40 mm dekslip-bodem schotel en breng Cyanoacrylaat lijm aan op de tape. Druk de glasplaat naar de lever en gebruik van katoen getipt applicatoren druk op het gaas in de lijm op de tape te minimaliseren weefsel beweging voor microscopie.
  8. Verplaats het dier naar de Microscoop fase. Voeg steriele 0,9% zoutoplossing toe in het dekslip-bodem schaaltje om de lever tijdens de beeldvormings sessie vochtig te houden. Handhaven temperatuur bij 36 – 37 ° c via verwarmings pads gemonteerd op het podium, een verwarmingskussen geplaatst over het dier en een objectieve kachel.

2. intravital microscopie

  1. Voer intravital microscopie uit op een omgekeerde epifluorescentie Microscoop die is uitgerust met een videocamera die hoge-snelheid beeldopname kan maken.
    Opmerking: Hier is een Xenon-booglamp, fluorescein-specifieke excitatie (480 – 500 nm) en emissie (507-543 nm)-filters, plan fluor 20x, N.A. 0,75 water immersie doelstelling en een High-Speed sCMOS-camera gebruikt.
  2. Selecteer het interessegebied voor capillaire bloedstroom analyse met minimale belichting.
  3. Stel de belichtingstijd kort genoeg in zodat de camera 100 fps kan aanschaffen. Stel verlichtingsniveau in om rode bloedcel schaduwen en de topologie van de vasculatuur duidelijk te visualiseren, terwijl ook fototoxiciteit en fotobleaching van de fluorescerende sonde worden vermeden.
  4. Verzamel afbeeldingen met een snelheid van 100 fps. Stel de pixel resolutie van de camera in tussen ~ 0,65 en ~ 1,3 μm/pixel. Stel de framegrootte in tussen 512 x 512 en 1024 x 1024 pixels. Stel bitdiepte in tussen 8 en 16 bits. Gebruik de hoogste resolutie, framegrootte en bitdiepte die nog steeds 100 fps image Collection op het systeem toestaat.
  5. Sla time series-bestand (en) op als een reeks TIF-bestanden of als native camera/Microscoop-indeling als bio-formaten14 in Fiji de native formaat bestanden kunnen openen.
  6. Meerdere gebieden in de loop van de tijd. Houd de muis op de Microscoop voor maximaal 2 uur. Euthaniseer de muis aan het einde van Imaging.
    Opmerking: De duur van de tijdreeks wordt gebaseerd op het balanceren van de noodzaak tot afbeelding voor een tijdsinterval dat de variabiliteit omarmt, terwijl de levensvatbaarheid van het weefsel niet wordt aangetast. De duur van de tijdreeks kan ook worden bepaald door de bestandsgrootte overwegingen; een 1 min tijdreeks van 1024 x 1024 pixel 16-bits afbeeldingen verzameld op 100 fps genereert een bestand dat 12 GB groot is. Bestandsgrootte overwegingen kunnen ook bepalen framegrootte en bitdiepte gebruikt. Er zijn geen expliciete groottelimieten binnen het personeel.

3. Definieer het vasculaire netwerk met behulp van TrakEM2 in FIJI

Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken na het opslaan van werk op een willekeurig punt in sectie 3.

  1. Download en installeer FIJI van https://imagej.net/Fiji/Downloads.
    Opmerking: Versie 1,51 n van Fiji werd gebruikt voor dit project, en kan worden gedownload van https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip. Merk op dat op Windows, FIJI moet worden geïnstalleerd in de gebruikersruimte en niet in programmabestanden.
  2. Open het filmbestand in FIJI met behulp van het bestand > openen of het gebruik van Bestands > importeren > reeksafbeeldingen. Selecteer één afbeelding uit de stabiele beelden tussen de Ademhalings bedelingen waarbij de topologie van het vasculaire netwerk gemakkelijk te zien is. Selecteer afbeelding ≫ Dupliceer en dupliceer de geselecteerde enkele afbeelding (niet de stapel) en sla de afbeelding op in een nieuwe map. Neem geen spaties op in bestands-of mapnamen.
  3. Stel een nieuw leeg TrakEM2 project in door bestand > nieuwe > TrakEM2 (blanco)te selecteren. Selecteer de nieuwe map met de afzonderlijke afbeelding uit de film als de projectmap. De TrakEM2 Vensters worden geopend.
  4. Klik met de rechtermuisknop in het hoofdwerkgebied en selecteer importeren ≫ afbeelding importeren . Navigeer naar de enkele afbeelding die is opgeslagen in stap 3,3 en selecteer deze.
  5. Klik nogmaals met de rechtermuisknop in het hoofdwerkgebied en selecteer weergave > canvas/laagset AutoResize . Klik met de linkermuisknop in het hoofdwerk venster. De afbeelding vult het werkgebied.
  6. Als u de gebieden in de afbeelding wilt selecteren die het vasculaire netwerk bevatten, selecteert u gebieds lijst selectie in TrakEM2. Klik in het kleinere TrakEM2 venster (sjabloon, project objecten, lagen) met de rechtermuisknop op "• anything". Selecteer nieuwe lijst met onderliggende ≫ gebiedtoevoegen.
  7. Sleep in het kleinere TrakEM2 venster "Template > anything" naar "project Objects > project". Sleep vervolgens "Template > anything > • Area List" op "Project objecten > Project > anything". Onder "Project objecten > project > Alles", zal de gebieds lijst nu aanwezig zijn.
  8. In het hoofdvenster van TrakEM2 onder het tabblad Z-ruimteis een balk met het label gebieds lijst gemaakt. Klik om het te selecteren. In het hoofdvenster van TrakEM2 selecteert u ook het gereedschap Penseel. Druk op SHIFT en rol het muiswiel om een geschikt formaat voor het penseel te selecteren, bijvoorbeeld kleiner dan de diameter van de vasculatuur. Om de TrakEM2 Setup op te slaan, drukt u op Control + S toetsen.
  9. Verf het vasculaire netwerk met de tool penseel. Als u Alt ingedrukt wilt houden terwijl u het gereedschap Penseel gebruikt. Neem geen out-of-focus-regio's op. Bespaar vaak met Control + S.
  10. Bij het labelen van het vasculaire netwerk is voltooid, klik met de rechtermuisknop in het hoofdvenster van TrakEM2 en selecteer exporteer ≫ arealisten als labels (TIF). Selecteer in het pop-upvenster schaal 100% en Exporteer alle gebieds lijst. Sluit TrakEM2 Windows en kies Ja voor project opslaan.
  11. Het beeld van de Arealisten wordt geopend en kan worden weergegeven als een lege zwarte afbeelding. In het hoofd menu van FIJI selecteert u afbeelding ≫ > helderheid/contrast aanpassen . In het B & C venster druk op de auto knop en de arealist zal zichtbaar worden. In het hoofdmenu van FIJI Selecteer afbeelding > opzoek tabellen > Lut omkeren . Sla deze afbeelding van zwarte labels op witte achtergrond op en sluit de afbeelding.
  12. Open het labelbestand in FIJI. Selecteer Plugins > skelet > skeletonize. Sla het geskeletteerde beeld op als een TIF. Gebruik het bestand Skeleton. TIF als een van de invoerbestanden die nodig zijn om de analyse van de personeels stroom uit te voeren. Gebruik geen spaties in bestandsnaam wanneer u het bestand opslaat.
  13. Bewerk indien nodig het skeleton-bestand handmatig door een tussenruimte te plaatsen (met het gereedschap verven) in de lijntekening bijvoorbeeld op locaties waar de vertakkingen in de vasculatuur niet zijn vastgelegd omdat ze uit het beeldvlak gaan.

4. de film volgorde voorbereiden voor personeels analyse

  1. Open het filmbestand in FIJI met behulp van bestand > openen of bestand > importeren > reeks afbeeldingen. Selecteer een tijdsperiode van de Afbeeldingsvolgorde voor stromings analyse (kan seconden tot minuten zijn, honderden tot tienduizenden frames) waar de weefsel positie na verloop van tijd stabiel is gebleven, behalve tijdens de ademhaling.
  2. Selecteer afbeelding ≫ Dupliceer en dupliceer het geselecteerde gedeelte van de reeks door de nummers van het begin-en eindframe te typen. Controleer afbeelding ruimtelijke en temporele kalibratie onder afbeelding > Eigenschappen en corrigeer indien nodig. Sla het afbeeldingsbestand op als een TIF (of als een ongecomprimeerd AVI). Dit Movie. TIF is nodig als invoerbestand om de personeels analyse uit te voeren. Neem geen spaties op in de bestandsnaam.

5. Installeer personeel Macro's in FIJI

Let op: (belangrijk) meerdere mappen binnen de Fiji map submappen hebben vergelijkbare bestandsnamen, sommige gekapitaliseerd, sommige niet. Wees er zeker van dat de juiste mappen zijn geselecteerd bij het installeren van personeel.

  1. Download de staf macro's van https://github.com/icbm-iupui/STAFF.
  2. Om te installeren, opent u eerst de map FIJI.
    1. Op Windows vind de map waar FIJI is geïnstalleerd in de gebruikersruimte, meestal op het bureaublad. Zoek op MacOS het FIJI-pictogram in de map toepassingen, klik met de rechtermuisknop en selecteer openen.
  3. Open de map plugins in de map FIJI. Open de map Macro's in de map plugins. Kopieer personeel. IJM in deze map Macro's: Fiji\plugins\Macros\STAFF.ijm.
  4. Open de map plugins in de map FIJI. Kopieer STAFF_Dir. jar in deze map plugins: Fiji\plugins\ STAFF_Dir. jar.
  5. Open de map macro's in de map FIJI. Open de map AutoRun in deze map macro's. Kopieer STAFF_Loader. IJM naar deze AutoRun-map: Fiji\macros\AutoRun\ STAFF_Loader. IJM.
  6. Start FIJI en controleer de installatie van de macro. Selecteer Plug-ins > macro'som de installatie te controleren. Wanneer correct geïnstalleerd het dropdown menu zal omvatten: open-Create project, analyseren skelet, tijdsintervallen bewerken, analyseren flow en produceren ruimtelijke kaart.
  7. Als deze opdrachten niet aanwezig zijn in het menu Macro's, selecteert u Plug-ins > macro's > installeren, opent u de map Fiji\plugins\Macros, selecteert u het bestand staff. IJM en klikt u op de knop OK . De opdrachten moeten nu worden weergegeven in het menu Plug-ins > macro's .

6. kwantificeren van vasculaire stroom met personeel

  1. Een nieuw project maken.
    1. Selecteer Plug-ins > macro's ≫ Open-Create project en volg de aanwijzingen om een configuratiebestand te maken of bij te werken.
    2. Navigeer in het menu project openen-maken naar en selecteer de projectmap, de invoerbestandsmap en de invoerbestanden Movie. TIF en Skeleton. TIF. Bewerk indien nodig de namen van de automatisch ingevulde uitvoerbestanden.
    3. Invoerwaarden voor de kortste segment lengte (20 μm), maximale snelheid gemeten (2.000 μm/s) en maximale snelheid toegewezen (1.000 μm/s).
      Opmerking: Het product van de kortste segment lengte en frames per seconde geeft de maximale stromingssnelheid die theoretisch kan worden gemeten. De hoogste capillaire stroomsnelheden die in de literatuur worden gerapporteerd, zijn ongeveer 2.000 μm/s15. In de lever, we waargenomen dat capillaire stroomsnelheden over het algemeen gemiddeld rond 300 μm/s en zelden overschreden 1.000 μm/s.
    4. Typ de waarden voor pixelgrootte en framesnelheid voor de Afbeeldingsvolgorde (van metagegevens van afbeeldingen of experimentele notities). Deze waarden vereisen invoer van de gebruiker. Controleer de flikkering correctie vak als de beelden hebben periodieke achtergrond intensiteit flikkering.
    5. Selecteer parameters voor de beste visualisatie van de gegevens. Selecteer de maximale snelheid die is toegewezen om ongeveer 95% van de gegevens op te nemen, zodat de gegevens over het volledige bereik van de kleurenschaal worden toegewezen. PERSONEEL wijst hoge snelheid uitschieters aan het High-Speed einde van de kleur schaal.
  2. Analyseer het skelet.
    1. Selecteer Plug-ins > Macro's > skelet analyseren . Het bestand Skeleton. TIF wordt geopend en de Manager van de regio van belang (ROI) wordt geopend en uitgevoerd.
      Opmerking: Met het analyseren van Skeleton classificeert u elke pixel op het aantal neighbors als een eindpunt, op een kruising of in een segment. Voor elk segment wordt een identificatienummer (ID-nummer), een gekalibreerde vertakkings lengte en de ruimtelijke coördinaten van de uiteinden van de vertakking vastgelegd.
    2. Wacht tot segment-Id's worden weergegeven in het skelet, de segment lijst wordt weergegeven in de ROI Manager en een pop-up die aangeeft dat het ROI Manager-bestand voor het skelet is opgeslagen. Klik op OK.
    3. Controleer dat tussen ademhalingsbewegingen het skelet blijft over waar rode bloedcellen door het capillair passeren (bijvoorbeeld niet de rand en niet buiten het capillair). Geef de gelabelde segmenten weer als een overlay op de film door het filmbestand te openen en vervolgens het ROI zip-bestand naar de geopende film te slepen. Speel de film af met de overlegde segmenten.
  3. Selecteer tijdsintervallen.
    1. Selecteer Plug-ins > macro's > tijds intervallen selecteren . Wacht totdat de macro een kymograph uit één segment genereert gedurende de totale tijd voor de film. Vanuit deze kymograph selecteert de gebruiker tijdsintervallen voor analyse. Gebruik Control + + toetsen om de grootte van de kymograph indien nodig te vergroten.
    2. Het gereedschap Rechthoek selecteren wordt automatisch geactiveerd. Teken een rechthoek rond elk tijdsinterval. Een goed uitgangspunt voor de tijdsinterval lengte is de 1 – 2 s interval tussen de ademhaling, die zichtbaar zijn als horizontale vervaagde gebieden in de kymograph.
    3. Klik op de T -toets of de toevoegen knop in de ROI Manager voor het vastleggen van tijdsinterval selecties. Herhaal dit voor zoveel tijdsintervallen als gewenst. Maak selecties opeenvolgend van boven (of links) naar beneden (of rechts) van de kymograph.
    4. Evalueer parameter keuzen (van open-Create project) door het selecteren van een klein aantal tijdsintervallen (3 tot 4) en het voltooien van de analyse voor alleen die intervallen, omdat analyseren stroom (de volgende stap) uren kan duren voor grote gegevenssets.
    5. Klik op OK in het venster een ROI voor elk tijdsinterval maken wanneer u klaar bent. Er verschijnt een pop-upvenster wanneer de geselecteerde intervallen zijn opgeslagen in de projectmap. Klik op OK.
  4. Analyseer de stroom.
    1. Selecteer Plugins > Macro's > flow analyseren en het dialoogvenster flow parameters analyseren wordt geopend en geeft de waarden weer die zijn ingevoerd in de stap project openen-maken. Bewerk indien nodig en klik op OK.
    2. Het dialoogvenster namen van uitvoerbestanden wordt geopend en geeft de namen weer die zijn ingevoerd in de stap project openen-maken. Bewerk indien nodig en klik op OK.
    3. Er wordt een dialoogvenster geopend waarin wordt gevraagd of de gebruiker klaar is om te beginnen met de analyse. Klik op OK en de analyse wordt gestart. Wacht op een dialoogvenster dat wordt geopend om aan te geven wanneer de stroom analyse is voltooid.
      Opmerking: De benodigde tijd is afhankelijk van de processorsnelheid en de grootte van de gegevensset.
    4. Bevestig dat de resultaten bestanden zijn opgeslagen als CSV-indeling werkbladbestanden in de projectmap.
      Opmerking: Uitvoerbestanden omvatten: segment_velocities. CSV bevat Velocity waarden met positieve en negatieve waarden die de stromingsrichting aangeven. Cellen die segmenten vertegenwoordigen die kleiner zijn dan de minimumlengte, bevatten de tekst kort. Cellen met snelheidswaarden die groter zijn dan de maximale gemeten snelheid bevatten de tekst uit (voor uitschieter). kym_ang. CSV bevat kymograph-hoeken, gemeten door de Directionality plugin in Fiji. good_fit. CSV bevat de goedheid van de pasvorm van een curve tot de verdeling van de hoeken gemeten vanuit elke kymograph. Slechte goedheid van pasvorm (< 0,8) kan duiden op verborgen vertakkingspunten in een segment, verandering in snelheid tijdens het tijdsinterval, lamp of kamer licht flikkering.
    5. Controleer of segment_velocities. csv bevat een paar waarden. Als er een groot aantal uit waarden, controleert u of de minimale segment lengte te analyseren is niet minder dan 15-20 μm, vervolgens opnieuw analyseren stroom. Als de nieuwe segment_velocities. CSV nog steeds een groot deel van de waarden bevat, controleer dan de flikkering correctie vak en voer vervolgens analyseren stroomopnieuw.
  5. Maak ruimtelijke kaarten.
    1. Selecteer Plug-ins > macro's > Maak ruimtelijke kaart en het venster ruimtelijke kaart parameters wordt geopend, waarin de waarden worden weergegeven die zijn ingevoerd in de stap open-Create project. Bewerk indien nodig, of ga door met selecteren OK.
    2. Kijk als een tijdelijke sequentie van ruimtelijke kaarten van stroomsnelheden wordt gegenereerd met kleur die de stromingssnelheid aangeeft. De uitvoer is in de vorm van een. TIF-afbeeldings stack met één afbeelding voor elk tijdsinterval. Blader door de. TIF-stack om ruimtelijke en temporele variatie in de stroom te visualiseren. Sla de stapel op als een AVI-bestand (ongecomprimeerd voor maximale draagbaarheid) om te delen als een film.

7. kwantitatieve analyse met gebruikmaking van de personeels output

  1. Open het bestand segment_velocities. csv in een spreadsheet of een statistisch analyseprogramma. Deze waarden hebben een positief of negatief teken dat de richting van de stroom aangeeft ten opzichte van de start-/stoppunten van dat segment (vastgelegd in het ROI-bestand van het segment).
  2. Maak een nieuwe werkblad pagina met de absolute waarden van alle snelheidswaarden. Gebruik deze waarden om de totale gemiddelde stromingssnelheid, gemiddelde stromingssnelheid voor alle vasculaire segmenten na verloop van tijd, stromingssnelheid voor elk vasculaire segment na verloop van tijd te berekenen en histogrammen van aanslag verdelingen te maken.
  3. Bereken waarden rond specifieke morfologische regio's of andere regio's van belang door eerst de specifieke relevante segmenten in het gelabelde skelet te vinden en vervolgens analyses op deze geselecteerde segmenten uit te voeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

PERSONEELS analyse genereert een volledige telling van microvasculaire snelheden over gehele Microscoop velden gedurende perioden van seconden tot minuten. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3en Figuur 4. Figuur 1 toont een voorbeeld van een tijdreeks van het microvasculaire netwerk in de lever van een muis, de generatie van het gesk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn meerdere kritieke stappen in dit protocol. Ten eerste, minimalisatie van de beweging tijdens intravital beeldvorming van de lever is essentieel voor het genereren van films die bruikbaar zijn voor capillaire stroming analyse met behulp van personeel. Vanwege de nabijheid van het diafragma, korte perioden van respiratie-geïnduceerde beweging optreden, met de verzekerde lever terugkeren naar de oorspronkelijke positie na elke adem. Het beveiligen van de chirurgisch blootgestelde lever tegen de dekslip-bodem schotel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs rapporteren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

De hier gepresenteerde studies werden ondersteund door de financiering van de National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 en NIH NIDDK P30 DK079312). Intravital microscopie studies werden uitgevoerd in het Indiana Center voor biologische microscopie. We danken Dr. Malgorzata Kamocka voor technische assistentie bij microscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#5 forcepsFine Science Tools11251-20Dumont #5 Inox Forceps
C57BL/6 muizenJackson Labsmannetjes 9-12 weken oud
CannulaInstechBTPE-10Polyethyleen buis 0,011 x 0,024 inches
CMOS cameraHamamatsuC11440-42U304.0LT Wetenschappelijke CMOS
Schaaltje met glasbodemElectron Microscopy SciencesWillCo Dish glazen bodem GWST5040
Dissectie schaarFine Science Tools
Fiji ImageJ Beeldanalysesoftwarehttps://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Fluoresceïne dextranThermo Fisher, InvitrogenD1822Dextran, Fluorescein, 70.000 MW, Anionisch, Lysine Fixable
GaasjeFisher22-415-5042x2 inch Dukal steriele gaasjes
VerwarmingskussenReptithermRH-4tussen muis en tafel
VerwarmingskussenSunbeam000732-500-000Uover muis
Omgekeerde epifluorescentiemicroscoopNikonNikon TiE omgekeerde microscoop
Isis Knaagdier scheerapparaatBraun AesculapGT420
IsofluoraanAbbott GmbHPZN4831850
Luer-adapterFisher14-826-19ECatheteradapter
Micro schaarCastro Viejo
MicroscoopobjectiefNikonPlan Fluor 20x, NA 0,75 water immersie
NaaldFisher30 G x1/2"
NaaldhouderOlsen-Hegar
ObjectiefverwarmingBioScience ToolsMTC-HLS-025Temperatuurregelaar met objectiefverwarming
Rectale thermometerBraintree Scientific, INCTH-5AMuis lichaamstemperatuur bewaking
STAFF macro'shttps://github.com/icbm-iupui/STAFF
HechtdraadHarvard Bioscience723288zwarte zijde hechtdraad, 6-0, spoel

Referenties

  1. Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
  2. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  3. Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
  4. Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
  5. Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
  6. Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
  7. Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
  8. Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).
  9. von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
  10. Huang, Z. -L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156(2011).
  11. Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Liu, Z. -Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369(1991).
  14. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  15. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  16. Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
  17. Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
  18. Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
  19. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052(2013).
  20. Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106(2013).
  21. Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
  22. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
  23. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303(2015).
  24. Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).
  25. Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341(2014).
  26. Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Microvasculaire flowintravitale microscopiecapillaire flowFIJI beeldanalyseTrakEM2 projectSkeleton Eyeskymografenanalysesnelheidsmapping
Ruimtelijke temporele analyse van Fieldwise flow in Microvasculatuur
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.