Het protocol beschrijft experimentele methoden om stabiele grote histocompatibiliteitscomplexen (MHC) klasse I te verkrijgen door middel van mogelijke β2-microglobuline (β2m) vervangingen van verschillende soorten. De structurele vergelijking van MHC I gestabiliseerd door homologe en heterologe β2m werd onderzocht.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Stabiliteit en structuur van Vleermuis Major Histocompatibiliteit Complexe Klasse I met Heterologe β2-Microglobuline
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex (MHC) speelt een cruciale rol in de presentatie van antigeenpeptiden en de immuunresponsen van T-cellen tegen infectieziekten en tumorontwikkeling. De hybride MHC I gecomplexeerd met heterologe β2-microglobuline (β2m) substitutie van verschillende soorten kan in vitro worden gestabiliseerd. Dit is een haalbaar middel om MHC I van zoogdieren te bestuderen, wanneer de homologe β2m niet beschikbaar is. Ondertussen is aangegeven dat zoogdier β2m substitutie geen significante invloed heeft op de presentatie van peptiden. Er is echter beperkte samenvatting met betrekking tot de methodologie en de technologie voor de hybride MHC I gecomplexeerd met heterologe β2-microglobuline (β2m). Hierin worden methoden gepresenteerd om de haalbaarheid van heterologe β2m substitutie in MHC I-studie te evalueren. Deze methoden omvatten de voorbereiding van expressieconstructies; zuivering van inclusieorganen en herindeling van het MHC-complex; bepaling van de thermostabiliteit van eiwitten; kristalscreening en structuurbepaling. Deze studie biedt een aanbeveling voor het begrijpen van de functie en structuur van MHC I, en is ook belangrijk voor de evaluatie van de T-celrespons tijdens infectieziekte en tumorimmunotherapie.
Inleiding
Het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex (MHC) bestaat in alle gewervelde dieren en is een reeks genen die de celgemedieerde immuniteit tegen infectieuze pathogenen bepaalt. MHC klasse I presenteert endogene peptiden, zoals virale componenten geproduceerd bij virusinfectie, aan T-celreceptoren (TCR) op het oppervlak van CD8+ T-cellen om cellulaire immuniteit te bemiddelen en deel te nemen aan immuunregulatie1. Een structurele studie van MHC I binding aan peptiden geeft informatie over peptidebindende motieven en presentatiekenmerken van MHC I-moleculen, die een essentiële rol spelen bij de evaluatie van CD8+ T-cel im....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van expressieconstructies
- Haal de sequenties van MHC klasse I genen (inclusief voorspelde genen) uit vleermuizen uit de NCBI database.
- Haal hogere zoogdier MHC I zware kettingsequenties op uit de Immuno Polymorphism Database (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) en de UniProt database (www.uniprot.org).
- Om oplosbare MHC-complexen te verkrijgen, mutagenize de sequenties om de cytosolische en transmembrane gebieden te verwijderen.
- Kloon de genen die coderen voor de ectodomains van de vleermuis Ptal-N*01:01 (GenBank nr. KT98792919) (residuen 1–277) en vleermuis β2m (GenBank nr. XP_0069204....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Eerder werk meldde dat de HeV-afgeleide HeV1 (DFANTFLP) peptide werd gepresenteerd door Ptal-N *01:0110,19. Hierin werd de bindingscapaciteit van dit peptide aan Ptal-N*01:01 met homologe vleermuis β2m (bβ2
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De bouw van een hybride eiwitcomplex door heterologe vervanging van verschillende taxa is een gemeenschappelijke strategie voor functionele en structurele onderzoeken wanneer het homologe complex niet beschikbaar is, zoals in de MHC I en zijn liganden. Er is echter een beperkte samenvatting met betrekking tot de methodologie en de technologie. Hierin werd de structuur van vleermuis MHC I, Ptal-N*01:01, gestabiliseerd door bβ2m of hβ2m geanalyseerd. De belangrijkste aminozuren van β2m bind.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te verklaren.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door het open fonds van het belangrijkste staatslaboratorium voor farmaceutische biotechnologie, Nan-jing University, China (Grant no. KF-GN-201905), de National Natural Science Foundation of China (subsidies 81971501). William J. Liu wordt ondersteund door het Excellent Young Scientist Program van de NSFC (81822040) en Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10 kDa MMCO membraan | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) stam | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Draag geschikte handschoenen en oog-/gezichtsbescherming. Bij contact met de ogen onmiddellijk met overvloedig water spoelen en medische hulp inschakelen. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Handschoenen en veiligheidsbril moeten worden gedragen en in een geventileerde keuken worden gebruikt. Bij contact met de ogen onmiddellijk met overvloedig water spoelen en medische hulp inschakelen. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | onze lab | Zhang, S. et al. Structurele basis van cross-alleelpresentatie door HLA-A*0301 en HLA-A*1101 onthuld door twee HIV-afgeleide peptidcomplexen. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Handschoenen en veiligheidsbril moeten worden gedragen en in een geventileerde keuken worden gebruikt. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Gist extract | Oxoid | LP0021 |
Referenties
- Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
- Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
