Methodenartikel

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

DOI:

10.3791/62061

⸱

5 januari 2021

 ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol voor de identificatie en kwantificering van belangrijke klassen van in water oplosbare metabolieten in de gist Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode is veelzijdig, robuust en gevoelig. Het maakt de scheiding van structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten van elkaar mogelijk.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolomics is een methodologie die wordt gebruikt voor de identificatie en kwantificering van vele tussenproducten met een laag molecuulgewicht en producten van het metabolisme in een cel, weefsel, orgaan, biologische vloeistof of organisme. Metabolomics richt zich traditioneel op in water oplosbare metabolieten. Het in water oplosbare metaboloom is het eindproduct van een complex cellulair netwerk dat verschillende genomische, epigenomische, transcriptomische, proteomische en omgevingsfactoren integreert. Vandaar dat de metabolomische analyse direct de uitkomst van de actie voor al deze factoren beoordeelt in een overvloed aan biologische processen binnen verschillende organismen. Een van deze organismen is de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae, een eencellige eukaryoot met het volledig gesequencede genoom. Omdat S. cerevisiae vatbaar is voor uitgebreide moleculaire analyses, wordt het gebruikt als een model voor het ontleden van mechanismen die ten grondslag liggen aan veel biologische processen in de eukaryote cel. Een veelzijdige analysemethode voor de robuuste, gevoelige en nauwkeurige kwantitatieve beoordeling van het in water oplosbare metaboloom zou de essentiële methodologie bieden voor het ontleden van deze mechanismen. Hier presenteren we een protocol voor de geoptimaliseerde omstandigheden van metabole activiteit doven in en in water oplosbare metabolietextractie uit S. cerevisiae-cellen. Het protocol beschrijft ook het gebruik van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS) voor de kwantitatieve analyse van de geëxtraheerde in water oplosbare metabolieten. De hier beschreven LC-MS/MS-methode van niet-gerichte metabolomica is veelzijdig en robuust. Het maakt de identificatie en kwantificering mogelijk van meer dan 370 in water oplosbare metabolieten met diverse structurele, fysische en chemische eigenschappen, waaronder verschillende structurele isomeren en stereo-somerische vormen van deze metabolieten. Deze metabolieten omvatten verschillende energiedragermoleculen, nucleotiden, aminozuren, monosacchariden, tussenproducten van glycolyse en tricarbonische cyclustussenproducten. De LC-MS/MS-methode van niet-gerichte metabolomica is gevoelig en maakt de identificatie en kwantificering van sommige in water oplosbare metabolieten mogelijk bij concentraties zo laag als 0,05 pmol/μL. De methode is met succes gebruikt voor het beoordelen van in water oplosbare metabolomen van wild-type en mutante gistcellen gekweekt onder verschillende omstandigheden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In water oplosbare metabolieten zijn tussenproducten met een laag molecuulgewicht en producten van het metabolisme die bijdragen aan essentiële cellulaire processen. Deze evolutionair geconserveerde processen omvatten de omzetting van voedingsstoffen in bruikbare energie, synthese van macromoleculen, cellulaire groei en signalering, celcycluscontrole, regulatie van genexpressie, stressrespons, posttranslataal regulatie van het metabolisme, onderhoud van mitochondriale functionaliteit, vesiculaire cellulaire handel, autofagie, cellulaire veroudering en gereguleerde celdood1,2,3.

Veel van deze essentiële rollen van in water oplosbare metabolieten zijn ontdekt door studies in de ontluikende gist S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Deze eencellige eukaryoot is een nuttig modelorganisme voor het ontleden van mechanismen waardoor in water oplosbare metabolieten bijdragen aan cellulaire processen vanwege zijn vatbaarheid voor geavanceerde biochemische, genetische en moleculair biologische analyses23,24,25,26. Hoewel de LC-MS /MS-methoden van niet-gerichte metabolomica zijn gebruikt voor het bestuderen van de rol van in water oplosbare metabolieten in ontluikende gist3,18,22,27, vereist dit type analyse de verbetering van zijn veelzijdigheid, robuustheid, gevoeligheid en vermogen om onderscheid te maken tussen verschillende structurele isomeren en stereo-somerische vormen van deze metabolieten.

De afgelopen jaren worden gekenmerkt door aanzienlijke vooruitgang bij het toepassen van de LC-MS/MS-methoden van niet-gerichte metabolomica op de profilering van in water oplosbare metabolieten in vivo. Veel uitdagingen bij het gebruik van deze methodologie blijven echter2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Deze uitdagingen omvatten de volgende. Ten eerste liggen de intracellulaire concentraties van veel in water oplosbare metabolieten onder een gevoeligheidsdrempel voor de momenteel gebruikte methoden. Ten tweede is de efficiëntie van het blussen van metabole activiteit te laag en is de mate van blussen-geassocieerde cellekkage van intracellulaire metabolieten te hoog voor de huidige methoden; vandaar dat de momenteel gebruikte methoden de intracellulaire concentraties van in water oplosbare metabolieten onderschatten. Ten derde kunnen de bestaande methoden geen onderscheid maken tussen de structurele isomeren (d.w.z. moleculen met dezelfde chemische formule maar verschillende atomaire connectiviteit) of stereo-isomeren (d.w.z. moleculen met dezelfde chemische formule en atomaire connectiviteit, maar met de verschillende atomaire opstelling in de ruimte) van specifieke metabolieten; dit voorkomt de juiste annotatie van bepaalde metabolieten door de momenteel gebruikte methoden. Ten vierde zijn de bestaande massaspectrale online databases van ouderionen (MS1) en secundaire ionen (MS2) onvolledig; dit beïnvloedt de juiste identificatie en kwantificering van specifieke metabolieten met behulp van de ruwe LC-MS/MS-gegevens die met behulp van de huidige methoden zijn geproduceerd. Ten vijfde kunnen de bestaande methoden geen enkel type metabolietextractie gebruiken om alle of de meeste klassen van in water oplosbare metabolieten te herstellen. Ten zesde kunnen de bestaande methoden geen enkel type van de LC-kolom gebruiken om alle of de meeste klassen van in water oplosbare metabolieten van elkaar te scheiden.

Hier hebben we de omstandigheden geoptimaliseerd voor het blussen van metabole activiteit in S. cerevisiae-cellen, het handhaven van de meeste in water oplosbare metabolieten in deze cellen vóór extractie en het extraheren van de meeste klassen van in water oplosbare metabolieten uit gistcellen. We ontwikkelden een veelzijdige, robuuste en gevoelige methode voor de op LC-MS/MS gebaseerde identificatie en kwantificering van meer dan 370 in water oplosbare metabolieten geëxtraheerd uit S. cerevisiae-cellen. Deze methode van niet-gerichte metabolomica maakt het mogelijk om de intracellulaire concentraties van verschillende energiedragermoleculen, nucleotiden, aminozuren, monosacchariden, glycolysetussenproducten en tricarbonylcyclustussenproducten te beoordelen. De ontwikkelde LC-MS/MS-methode maakt de identificatie en kwantificering mogelijk van verschillende structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten met diverse structurele, fysische en chemische eigenschappen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het maken en steriliseren van een medium voor het kweken van gist

  1. Maak 180 ml van een compleet gistextract met bactopepton (YP) medium. Het volledige YP medium bevat 1% (w/v) gistextract en 2% (w/v) bactopepton.
  2. Verdeel 180 ml van het YP-medium gelijkmatig over vier Erlenmeyers van 250 ml. Elk van deze kolven bevat 45 ml van het YP-medium.
  3. Steriliseer de kolven met YP-medium door autoclaveren bij 15 psi/121 °C gedurende 45 minuten.

2. Wild-type giststam

  1. Gebruik de BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) stam.

3. Groeiende gist in het YP-medium met 2% glucose

  1. Steriliseer een 20% (w/v) stamoplossing van glucose door autoclaveren bij 15 psi/121 °C gedurende 45 minuten.
  2. Voeg 5 ml van de geautoclaveerde 20% (w/v) stamoplossing van glucose toe aan elk van de twee Erlenmeyers met 45 ml van het gesteriliseerde YP-medium. De uiteindelijke concentratie glucose in het YP-medium is 2% (w/v).
  3. Gebruik een microbiologische lus om gistcellen in elk van de twee Erlenmeyers te enten met het YP-medium dat 2% glucose bevat.
  4. Kweek de gistcellen een nacht bij 30 °C in een roterende shaker bij 200 rpm.
  5. Neem een aliquot van gistcultuur. Bepaal het totale aantal gistcellen per ml cultuur. Tel cellen met behulp van een hemocytometer.

4. Celoverdracht naar en cel groeit in het YP-medium met 2% glucose

  1. Voeg 5 ml van de gesteriliseerde 20% (w/v) stamoplossing van glucose toe aan elk van de resterende twee Erlenmeyers met het geautoclaveerde YP-medium. De uiteindelijke glucoseconcentratie is 2% (w/v).
  2. Breng een volume van de nachtelijke gistcultuur in YP-medium met 2% glucose dat het totale aantal van 5,0 x 107 cellen bevat over in elk van de twee Erlenmeyers met het YP-medium dat 2% glucose bevat. Gebruik een steriele pipet voor de celoverdracht.
  3. Kweek de gistcellen gedurende ten minste 24 uur (of langer, indien het experiment dat vereist) bij 30 °C in een roterende shaker bij 200 tpm.

5. Reagentia maken, labware voorbereiden en apparatuur instellen voor het blussen van cellen

  1. Bereid het volgende voor: 1) een blusoplossing (60% hoogwaardige (>99,9%) methanol in 155 mM ammoniumbicarbonaat (ABC) buffer, pH = 8,0); 2) een ijskoude ABC-oplossing (pH = 8,0); 3) een digitale thermometer die tot -20 °C kan meten; 4) 500 ml grote centrifugeflessen; 5) een voorgekoelde hogesnelheidscentrifuge met een voorgekoelde rotor en voorgekoelde centrifugeflessen van 500 ml voor deze rotor, allemaal bij -5 °C; 6) metabolietextractiebuizen (15 ml glazen centrifugebuizen met hoge snelheid met polytetrafluorethyleen beklede doppen); en 7) droogijs.

6. Cel doven

  1. Gebruik een hemocytometer om het aantal gistcellen per ml YP te bepalen met 2% glucosekweek.
  2. Breng een volume van de cultuur in YP-medium met 2% glucose dat het totale aantal van 5,0 x 108 cellen bevat over in voorgekoelde centrifugeflessen van 500 ml.
  3. Vul de centrifugefles met de cellen snel tot een volume van 200 ml met een blusoplossing die is opgeslagen bij -20 °C.
  4. Centrifugeer de flessen in een snelle centrifuge bij 11.325 x g gedurende 3 minuten bij -5 °C.
  5. Snel en teder de fles uit de centrifuge halen; Schroef het deksel voorzichtig los en verwijder het bovennatuurlijk zonder de pellet te verstoren.
  6. Resuspend de celkorrel snel in 10 ml ijskoude ABC-buffer en breng de suspensie over in een 15 ml hoge snelheid glazen centrifugebuis met een met polytetrafluorethyleen beklede dop voor metabolietextractie.
  7. Verzamel cellen door centrifugatie in een klinische centrifuge bij 3.000 x g gedurende 3 minuten bij 0 °C.
  8. Verwijder snel het supernatant en plaats de buis op droogijs om te beginnen met de extractie van metabolieten of bewaar de buis bij -80 °C tot de extractie.

7. Bereiding van reagentia, laboratoriumartikelen en apparatuur voor de extractie van metabolieten

  1. Bereid het volgende voor: 1) LC-MS-kwaliteit chloroform; 2) Methanol van LC-MS-kwaliteit; 3) LC-kwaliteit nano-zuiver water; 4) LC-MS-graad (ACN); 5) glasparels (zuurgewassen, 425-600 μm); 6) een vortex met een schuimbuishouder kit met retainer; 7) 15 ml hoge snelheid glazen centrifugebuizen met polytetrafluorethyleen beklede doppen; 8) MS injectieflacons; 9) droogijs; en 10) buizen van 1,5 ml eenmaal gewassen met ethanol, eenmaal met ACN en eenmaal met nanozuiver water.
    OPMERKING: Gebruik alleen micropipette tips en buizen gemaakt van polypropyleen dat bestand is tegen organische oplosmiddelen.

8. Extractie van metabolieten

  1. Voeg aan de metabolieten die vanaf stap 6.7 op droogijs worden bewaard of bij een buis van -80 °C worden bewaard, het volgende toe: 1) 2 ml chloroform opgeslagen bij -20 °C; 2) 1 ml methanol opgeslagen bij -20 °C; 3) 1 ml ijskoud nanozuiver water; en 4) 200 μL van 425-600 μm zuurgewassen glasparels.
  2. Dek af en sluit de mond van een buis met aluminiumfolie. Plaats buizen in een schuimbuishouderset met houder en vortex ze gedurende 30 minuten op gemiddelde snelheid (d.w.z. met een snelheid die is ingesteld op 6, waarbij 12 de maximale snelheid van een vortex is) bij 4 °C om de extractie van metabolieten te vergemakkelijken.
  3. Incubeer de buis gedurende 15 minuten op ijs (GEEN droogijs!) om eiwitneerslag en de scheiding van het bovenste waterige van de onderste organische fase te bevorderen.
  4. Centrifugeer de buis in een klinische centrifuge bij 3.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Deze centrifugatiestap maakt het mogelijk om de bovenste waterige fase (die in water oplosbare metabolieten bevat) te scheiden van de middelste laag (die celresten en eiwitten bevat) en van de onderste organische fase (die voornamelijk lipiden bevat).
  5. Gebruik een micropipette om de bovenste waterige fase (400 μL) over te brengen naar een gewassen en gelabelde buis van 1,5 ml met 800 μL ACN die werd bewaard bij -20 °C.
    OPMERKING: Er zal witte wolkenneerslag zijn na het toevoegen van de bovenste waterige fase aan ACN, die op -20 °C wordt gehouden.
  6. Centrifugeer de buis met het monster in een tafelcentrifuge bij 13.400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: De witte wolkenneerslag verdwijnt na centrifugeren.
  7. Breng 800 μL over van het bovenste gedeelte van een vloeistof in de buis naar een gelabelde MS-injectieflacon. Bewaar het monster bij 0 °C totdat het wordt geanalyseerd met LC-MS/MS.

9. Voorbereiding van reagentia, labware en apparatuur voor LC

  1. Bereid het volgende voor: 1) een vortex; 2) een ultrasone sonicator; 3) MS glazen injectieflacons; 4) een LC-systeem uitgerust met een binaire pomp, ontgasser en autosampler; 5) een zwitterionische fasechromatografiekolom (5 μm polymeer, 150 x 2,1 mm) genoemd in de tabel met materialen; 6) een kolomverwarming; en 7) mobiele fasen, waaronder fase A (5:95 ACN:water (v/v) met 20 mM ammoniumacetaat, pH = 8,0) en fase B (100% ACN).

10. Scheiding van geëxtraheerde metabolieten door LC

  1. Onderwerp de inhoud van de MS-injectieflacon gedurende 15 minuten aan ultrasone ultrasoonapparaat.
  2. Vortex de MS injectieflacon 3x gedurende 10 sec bij kamertemperatuur (RT).
  3. Plaats de MS injectieflacon in de putplaat.
  4. Houd tijdens de chromatograaf de kolom op 45 °C en een debiet van 0,250 ml/min. Bewaar het monster in de putplaat bij 0 °C. Raadpleeg tabel 1 voor de LC-gradiënten die tijdens chromatografie moeten worden gebruikt.
    OPMERKING: Een representatief totaal ionchromatogram van in water oplosbare metabolieten die zijn geëxtraheerd uit cellen van de wildtype stam BY4742 is weergegeven in figuur 1. De metabolieten gescheiden door LC werden geïdentificeerd en gekwantificeerd door massaspectrometrische analyse die werd uitgevoerd in positieve ionisatie [ESI (+)] modus, zoals beschreven voor stap 11.

11. Massaspectrometrische analyse van metabolieten gescheiden door LC

  1. Gebruik een massaspectrometer uitgerust met verwarmde elektrospray-ionisatie (HESI) voor de identificatie en kwantificering van in water oplosbare metabolieten die werden gescheiden door LC. Gebruik de analyser van de massaspectrometer voor MS1-ionen en de detector van de massaspectrometer voor MS2-ionen. Gebruik de instellingen in tabel 2 en tabel 3 voor de gegevensafhankelijke acquisitie van respectievelijk MS1- en MS2-ionen.
  2. Gebruik een monstervolume van 10 μL voor de injectie in zowel de ESI-modus (+) als de ESI-modus (-).

12. Identificatie en kwantificering van verschillende metabolieten door de verwerking van ruwe gegevens van LC-MS/MS

  1. Gebruik de software die wordt genoemd in de Tabel met materialen om de identificatie en kwantificering van verschillende in water oplosbare metabolieten uit ruwe LC-MS /MS-bestanden uit te voeren. Deze software gebruikt MS1 voor metabolietkwantificering en MS2 voor metabolietidentificatie. De software maakt gebruik van de meest uitgebreid samengestelde massaspectrale fragmentatiebibliotheek om de metabolieten te annoteren met behulp van de ruwe gegevens van LC-MS / MS door MS-spectra te matchen. Deze software maakt ook gebruik van de exacte massa van MS1 en isotopenpatroon match om metabolieten te annoteren met behulp van online databases. Zie figuur 2 voor meer informatie.
  2. Gebruik de bibliotheek van databases en spectra, die vrij online beschikbaar is (https://www.mzcloud.org), om te zoeken naar MS2-spectra van de onbewerkte gegevens.

13. Membraanintegriteitstest door propidiumjodide (PI) kleuring en fluorescentiemicroscopie

  1. Nadat de cel is geblust zoals beschreven voor stap 6, wast u de gebluste cellen grondig met 15 ml ABC-buffer om de blusoplossing te verwijderen. Verzamel cellen door centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij 0 °C.
  2. Resuspend de celkorrel in 1 ml ABC-buffer en voeg 0,5 ml van de PI-oplossing (0,5 mg/ml) toe.
  3. Vortex een buis met het monster 3x gedurende 10 s en incubeer het gedurende 10 minuten in het donker en op ijs.
  4. Centrifugeer de buis met het monster in een tafelcentrifuge bij 13.400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  5. Verwijder het supernatant en suspens de pellet in 1 ml ABC-buffer.
  6. Centrifugeer de buis bij 13.400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap nog 2 keer om de PI te verwijderen die aan het celoppervlak is gebonden.
  7. Resuspend de pellet in 300 μL ABC-buffer. Plaats 10 μL van de suspensie op het oppervlak van een microscoopglaasje.
  8. Leg de differentiële interferentiecontrast (DIC) en fluorescentiemicroscopiebeelden vast met een fluorescentiemicroscoop. Gebruik een filter dat is ingesteld op de excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 593 nm en 636 nm.
  9. Gebruik een software om het totale celnummer (in de DIC-modus) en het aantal fluorescerend gekleurde cellen te tellen. Gebruik deze software ook om de intensiteit van kleuring voor individuele cellen te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om een kwantitatieve beoordeling van in water oplosbare metabolieten in een gistcel te verbeteren, hebben we de omstandigheden van celuitroeiing geoptimaliseerd voor metabolietdetectie. Cel doven voor dit doel omvat een snelle arrestatie van alle enzymatische reacties binnen een cel31,33,37,38. Een dergelijke stopzetting van cellulaire metabole activiteit is een...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om het hier beschreven protocol met succes te gebruiken, volgt u de hieronder beschreven preventieve maatregelen. Chloroform en methanol extraheren verschillende stoffen uit laboratoriumplastic. Ga er daarom voorzichtig mee om. Vermijd het gebruik van kunststoffen in stappen waarbij contact wordt gemaakt met een van deze twee organische oplosmiddelen. Gebruik borosilicaat glazen pipetten voor deze stappen. Verrijs deze pipetten voor gebruik met chloroform en methanol. Gebruik alleen micropipette tips en buizen gemaakt va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn huidige en voormalige leden van het Titorenko-laboratorium dankbaar voor de discussies. We erkennen het Centrum voor Biologische Toepassingen van Massaspectrometrie, het Centrum voor Structurele en Functionele Genomica en het Centrum voor Microscopie en Cellulaire Beeldvorming (allemaal aan de Concordia University) voor uitstekende diensten. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada (RGPIN 2014-04482 en CRDPJ 515900 - 17). K.M. werd ondersteund door de Concordia University Armand C. Archambault Fellowship en de Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chemicaliën
AcetonitrilFisher ScientificA9554
AmmoniumacetaatFisher ScientificA11450
AmmoniumbicarbonaatSigma9830
BactopeptonFisher ScientificBP1420-2
ChloroformFisher ScientificC297-4
GlucoseFisher ScientificD16-10
L-histidineSigmaH8125
L-leucineSigmaL8912
L-lysineSigmaL5501
MethanolFisher ScientificA4564
MethanolFisher ScientificA4564
Propidium jodideThermo ScientificR37108
UracilSigmaU0750
GistextractFisher ScientificBP1422-2
Hardware-apparatuur
500 ml centrifuge flessenBeckman355664
Agilent 1100 series LC systeemAgilent TechnologiesG1312A
Beckman Coulter CentrifugeBeckman6254249
Beckman Coulter Centrifuge RotorBeckmanJA-10
Centra CL2 klinische centrifugeThermo Scientific004260F
Digitaal thermometerOmegaHH509
Foam Tube Holder Kit met RetainerThermo Scientific02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionische fase kolom (5µm polymeer 150 x 2.1 mm)Sigma Milipore150460
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
Ultrasonische sonicatorFisher Scientific15337416
VortexFisher Scientific2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µmAgilent Technologies883725-901
Laboratoriummaterialen
2-mL glazen monsterflacons met Teflon voering doppenFisher Scientific60180A-SV9-1P
Glazenerwtjes (zuur gewassen, 425-600 μm)Sigma-AldrichG8772
HemacytometerFisher Scientific267110
15-mL hogesnelheid glazen centrifuge buizen met Teflon voering doppenPYREX05-550
Software
Compound Discoverer 3.1Fisher ScientificV3.1
Giststam
Giststam BY4742DharmaconYSC1049

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786(2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973(2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020(2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046(2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588(2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148(2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308(2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301(2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122(2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3(2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251(2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Wateroplosbare metabolietenextractie van metabolietencelquenchingzwitterionische fasekolomfluorescentiemicroscopiepropidiumjodide kleuring

Gerelateerde artikelen