Het genoom is georganiseerd in de nucleaire ruimte in verschillende structuren die kunnen worden onthuld door middel van chromosoom conformatie capture technologieën. De hi-c-methode in de kern biedt een genoombrede verzameling chromatine-interacties in Drosophila-cellijnen, die contactkaarten genereert die kunnen worden verkend met megabaseresolutie op beperkingsfragmentniveau.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Hi-C in nucleus in drosophilacellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het genoom is georganiseerd in topologisch koppelende domeinen (TAD's) gescheiden door grenzen die interacties tussen domeinen isoleren. In Drosophila worden de mechanismen die ten grondslag liggen aan TAD-formatie en grenzen nog onderzocht. De toepassing van de hier beschreven hi-C-methode in de kern hielp bij het ontleden van de functie van architecturale eiwitbindende locaties bij TAD-grenzen die het Notch-gen isoleren. Genetische modificatie van domeingrenzen die verlies van AP's veroorzaken, resulteert in TAD-fusie, transcriptiedefecten en topologische veranderingen op lange afstand. Deze resultaten leverden bewijs dat genetische elementen bijdragen aan de vorming van domeingrens en genexpressiecontrole in Drosophila. Hier is de hi-C-methode in de kern in detail beschreven, die belangrijke controlepunten biedt om de kwaliteit van het experiment samen met het protocol te beoordelen. Ook worden de vereiste aantallen sequencing-leesingen en geldige Hi-C-paren weergegeven om genomische interacties op verschillende genomische schalen te analyseren. CRISPR/Cas9-gemedieerde genetische bewerking van regulerende elementen en profilering met hoge resolutie van genomische interacties met behulp van dit hi-C-protocol in de kern zou een krachtige combinatie kunnen zijn voor het onderzoek naar de structurele functie van genetische elementen.
Inleiding
Bij eukaryoten wordt het genoom verdeeld in chromosomen die specifieke gebieden in de nucleaire ruimte bezetten tijdens interfase1. De chromatine die de chromosomen vormt, kan worden onderverdeeld in twee hoofdtoestanden: een van toegankelijke chromatine die transcriptie-permissief is, en de andere van compacte chromatine die transcriptie-repressief is. Deze chromatinetoestanden scheiden en mengen zich zelden in de nucleaire ruimte en vormen twee afzonderlijke compartimenten in de kern2. Op de sub-megabase schaal, grenzen afzonderlijke domeinen van hoogfrequente chromatine interacties, genaamd TADs, die chromosomale orga....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Fixatie
- Begin met 10 miljoen Schneider's lijn 2 plus (S2R+) cellen om 17,5 ml van een celsuspensie in Schneider medium te bereiden met 10% foetale runderserum (FBS) bij kamertemperatuur (RT).
- Voeg methanolvrije formaldehyde toe om een eindconcentratie van 2% te verkrijgen. Meng en incubeer gedurende 10 minuten bij RT en zorg ervoor dat je elke minuut mengt.
OPMERKING: Formaldehyde is een gevaarlijke chemische stof. Volg de juiste gezondheids- en veiligheidsvoorschriften en werk in de zuurkast. - Doof de reactie door glycine toe te voegen om een eindconcentratie van 0,125 M te bereiken en meng. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT, gevo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hieronder worden de resultaten van een succesvol Hi-C-protocol beschreven (zie een samenvatting van de hi-c-protocolworkflow in figuur 1A). Er zijn verschillende kwaliteitscontrolecontrolepunten tijdens het hi-C-experiment in de kern. Monster aliquots werden verzameld vóór (UD) en na (D) de chromatine restrictie stap en na ligatie (L). Crosslinks werden omgekeerd, en DNA werd gezuiverd en op een agarose gel gelopen. Een uitstrijkje van 200-1000 bp werd waargenomen bij een beperking met Mbo I.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier gepresenteerde hi-c-methode in de kern heeft een gedetailleerde verkenning van de drosophila-genoomtopologie met hoge resolutie mogelijk gemaakt, waardoor een beeld werd verkregen van genomische interacties op verschillende genomische schalen, van chromatinelussen tussen regulerende elementen zoals promotors en versterkers tot TAD's en identificatie van grotecompartimenten 25. Dezelfde technologie is ook efficiënt toegepast op weefsels van zoogdieren met enkele wijzigingen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) subsidienummer IN207319 en de Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) subsidienummer 303068. A.E.-L. is een masterstudent ondersteund door de CVA-nummer 968128 van de Science and Technology National Council (CONACyT).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 16% (vol/vol) paraformaldehydeoplossing | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzym | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetaal bovien serum (FBS) steriel gefilterd | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI groot fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligatie Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzym | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionogene oppervlakteactieve stof voor toevoeging in lyseringsbuffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' | |
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' | |
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' | |
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' | |
| Fenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (bekende interactie, Figuur 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (bekende interacties, Figuur 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionogene oppervlakteactieve stof voor de activering van SDS |
Referenties
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interact....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
