Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hi-C in nucleus in drosophilacellen

4.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62106

⸱

15 september 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

In dit artikel

Samenvatting

Het genoom is georganiseerd in de nucleaire ruimte in verschillende structuren die kunnen worden onthuld door middel van chromosoom conformatie capture technologieën. De hi-c-methode in de kern biedt een genoombrede verzameling chromatine-interacties in Drosophila-cellijnen, die contactkaarten genereert die kunnen worden verkend met megabaseresolutie op beperkingsfragmentniveau.

Samenvatting

Het genoom is georganiseerd in topologisch koppelende domeinen (TAD's) gescheiden door grenzen die interacties tussen domeinen isoleren. In Drosophila worden de mechanismen die ten grondslag liggen aan TAD-formatie en grenzen nog onderzocht. De toepassing van de hier beschreven hi-C-methode in de kern hielp bij het ontleden van de functie van architecturale eiwitbindende locaties bij TAD-grenzen die het Notch-gen isoleren. Genetische modificatie van domeingrenzen die verlies van AP's veroorzaken, resulteert in TAD-fusie, transcriptiedefecten en topologische veranderingen op lange afstand. Deze resultaten leverden bewijs dat genetische elementen bijdragen aan de vorming van domeingrens en genexpressiecontrole in Drosophila. Hier is de hi-C-methode in de kern in detail beschreven, die belangrijke controlepunten biedt om de kwaliteit van het experiment samen met het protocol te beoordelen. Ook worden de vereiste aantallen sequencing-leesingen en geldige Hi-C-paren weergegeven om genomische interacties op verschillende genomische schalen te analyseren. CRISPR/Cas9-gemedieerde genetische bewerking van regulerende elementen en profilering met hoge resolutie van genomische interacties met behulp van dit hi-C-protocol in de kern zou een krachtige combinatie kunnen zijn voor het onderzoek naar de structurele functie van genetische elementen.

Inleiding

Bij eukaryoten wordt het genoom verdeeld in chromosomen die specifieke gebieden in de nucleaire ruimte bezetten tijdens interfase1. De chromatine die de chromosomen vormt, kan worden onderverdeeld in twee hoofdtoestanden: een van toegankelijke chromatine die transcriptie-permissief is, en de andere van compacte chromatine die transcriptie-repressief is. Deze chromatinetoestanden scheiden en mengen zich zelden in de nucleaire ruimte en vormen twee afzonderlijke compartimenten in de kern2. Op de sub-megabase schaal, grenzen afzonderlijke domeinen van hoogfrequente chromatine interacties, genaamd TADs, die chromosomale organisatiemarkeren 3,4,5. Bij zoogdieren worden tad-grenzen ingenomen door cohesine en CCCTC-bindingsfactor (CTCF)6,7,8. Het cohesinecomplex extrudeert chromatine en stopt op CTCF-bindingsplaatsen die in een convergente oriëntatie in de genomische sequentie worden afgevoerd om stabiele chromatinelussen9,10 , 13,14te vormen . Genetische verstoring van de CTCF DNA-bindende plaats aan de grenzen of vermindering van de overvloed aan CTCF - en cohesine-eiwit resulteert in abnormale interacties tussen regulerende elementen, verlies van TAD-vorming en genexpressiederegulering9,10,11,13,14.

In Drosophila worden de grenzen tussen TAD's bezet door verschillende AP's, waaronder grenselement-geassocieerde factor 32 kDa (BEAF-32), Motif 1 binding eiwit (M1BP), centrosomaal eiwit 190 (CP190), suppressor van hairy-wing (SuHW) en CTCF, en zijn verrijkt met actieve histonmodificaties en Polymerase II16,17,18. Er is gesuggereerd dat in Drosophila TAD's verschijnen als gevolg van transcriptie13,17,19, en de exacte rol van onafhankelijke AP's in grensvorming en isolatie-eigenschappen wordt nog onderzocht. Dus of domeinen in Drosophila een enig gevolg zijn van de aggregatie van regio's van vergelijkbare transcriptietoestanden of dat AP's, waaronder CTCF, bijdragen aan grensvorming, moet dus nog volledig worden gekarakteriseerd. Exploratie van genomische contacten met hoge resolutie is mogelijk geweest door de ontwikkeling van chromosoomconformatie-opnametechnologieën in combinatie met sequencing van de volgende generatie. Het Hi-C protocol werd voor het eerst beschreven met de ligatiestap uitgevoerd "in oplossing"2 in een poging om valse ligatieproducten tussen chromatinefragmenten te voorkomen. Verschillende studies wezen echter op het besef dat het nuttige signaal in de gegevens afkomstig was van ligatieproducten die werden gevormd bij gedeeltelijk gelyseerde kernen die niet in oplossing20,21waren .

Het protocol werd vervolgens aangepast om de ligatie in de kern uit te voeren als onderdeel van het eencellige Hi-C-experiment22. Het hi-c-protocol in de kern werd vervolgens opgenomen in de celpopulatie Hi-C om een consistentere dekking over het volledige bereik van genomische afstanden te produceren en gegevens te produceren met minder technische ruis23,24. Het protocol, hier in detail beschreven, is gebaseerd op het populatie-in-nucleus Hi-C protocol23,24 en werd gebruikt om de gevolgen te onderzoeken van het genetisch verwijderen van DNA-bindende motieven voor CTCF en M1BP van een domeingrens bij de Notch-gen locus in Drosophila25. De resultaten tonen aan dat het veranderen van de DNA-bindende motieven voor AP's aan de grens drastische gevolgen heeft voor de vorming van notch-domein, grotere topologische defecten in de regio's rond de Notch-locus en genexpressiederegulering. Dit geeft aan dat genetische elementen op domeingrenzen belangrijk zijn voor het behoud van genoomtopologie en genexpressie in Drosophila25.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Fixatie

  1. Begin met 10 miljoen Schneider's lijn 2 plus (S2R+) cellen om 17,5 ml van een celsuspensie in Schneider medium te bereiden met 10% foetale runderserum (FBS) bij kamertemperatuur (RT).
  2. Voeg methanolvrije formaldehyde toe om een eindconcentratie van 2% te verkrijgen. Meng en incubeer gedurende 10 minuten bij RT en zorg ervoor dat je elke minuut mengt.
    OPMERKING: Formaldehyde is een gevaarlijke chemische stof. Volg de juiste gezondheids- en veiligheidsvoorschriften en werk in de zuurkast.
  3. Doof de reactie door glycine toe te voegen om een eindconcentratie van 0,125 M te bereiken en meng. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT, gevolgd door 15 minuten op ijs.
  4. Centrifugeer gedurende 5 minuten gedurende 400 × g bij RT en vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C; gooi het supernatant weg. Resuspendeer de pellet zorgvuldig in 25 ml koude 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing.
  5. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
    OPMERKING: Als u doorgaat met het protocol, gaat u naar stap 2.1 voor lysis; anders, flash-freeze de pellet in vloeistof N2 en bewaar de pellet op -80 °C.

2. Lysis

  1. Resuspendeer de cellen in 1 ml ijs-koude-lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% van niet-ionische oppervlakteactieve stof (zie de tabel met materialen);10 mM NaCl; 1x proteaseremmers) en stel het volume in op 10 ml met ijskoude lysisbuffer. Pas het volume aan om een concentratie van 1 × 106 cellen/ml te verkrijgen. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs en meng elke 2 minuten door de buizen om te keren.
  2. Centrifugeer de kernen op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant voorzichtig weg. Was de pellet 1x met 1 ml koude lysisbuffer en breng deze over naar een microcentrifugebuis. Was de pellet 1x met 1 ml koude 1,25x restrictiebuffer en resuspendeer elke celpellet in 360 μL 1,25x restrictiebuffer.
  3. Voeg 11 μL 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) per buis (0,3% eindconcentratie) toe, meng voorzichtig door pipetten en incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten, schuddend bij 700-950 tpm. Pipet op en neer om klonten een paar keer te verstoren tijdens de incubatie.
  4. Blus de SDS door 75 μL niet-ionische oppervlakteactieve stof (10% oplossing, zie de tabel met materialen)per buis (1,6% eindconcentratie) toe te voegen en incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten, schuddend bij 950 tpm. Pipet een paar keer op en neer om klonten tijdens de incubatie te verstoren.
    OPMERKING: Als klonten groot zijn en moeilijk te verstoren, verlaagt u de draaisnelheid tot 400 tpm tijdens SDS- en oppervlakteactieve behandelingen. Als de klonten moeilijk te verdelen zijn door pipetten, splits het monster dan in tweeën; de volumes van de beperkingsbuffer, SDS en oppervlakteactieve stof aan te passen; en ga verder met de permeabilisatie. Draai vervolgens de kernen op minimale snelheid (200 × g),gooi het supernatant voorzichtig weg, bundel de monsters samen in een 1X-beperkingsbuffer en ga verder met de spijsvertering. Neem een aliquot van 10 μL als onverteerd monster (UD).

3. Enzymatische spijsvertering

  1. Verteer het chromatine door 200 eenheden (U) Mbo I per buis toe te voegen en incubeer bij 37 °C gedurende een periode variërend van 4 uur tot 's nachts tijdens het draaien (950 tpm).
  2. Voeg de volgende dag nog eens 50 U Mbo I per buis toe en incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur tijdens het draaien (950 tpm).
  3. Inactiveer het enzym door de buizen gedurende 20 minuten op 60 °C te incuberen. Leg de buizen op ijs.
    OPMERKING: Neem een aliquot van 10 μL als verteerd monster (D).

4. Biotinylering van DNA-uiteinden

  1. Om het beperkingsfragment overhangen op te vullen en het DNA-uiteinden te labelen met biotine, voeg 1,5 μL elk van 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL van 0,4 mM biotine dATP, 17,5 μL Tris low-EDTA (TLE) buffer [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0] en 10 μL van 5 Meng voorzichtig en incubeer gedurende 75 minuten bij 37 °C. Schud bij 700 tpm elke 10 s gedurende 30 s. Leg alle buizen op ijs tijdens het bereiden van de ligatiemix.

5. Ligatie

  1. Breng elk verteerd chromatinemengsel over in een afzonderlijke buis van 1 ml met ligatiemengsel (100 μL 10x ligatiebuffer, 10 μL 10 mg/ml runderserumalbumine, 15 U T4 DNA-ligase en 425 μL dubbel gedestilleerd water [ddH2O]). Meng grondig door zachte pipetten en incubeer 's nachts bij 16 °C.

6. Crosslink omkering en DNA zuivering

  1. Degradeer eiwitten door 50 μL van 10 mg/ml Proteinase K per buis toe te voegen en incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur. Keer crosslinks om door de temperatuur te verhogen tot 65 °C en 's nachts te incuberen.
  2. Degradeer RNA door 20 μL RNase A van 10 mg/ml toe te voegen en gedurende 1 uur bij 37 °C te incuberen.
  3. Voer fenol uit: chloroformextractie gevolgd door ethanolprecipitatie.
    1. Voeg 1 volume fenol-chloroform toe en meng grondig door inversie om een homogene witte fase te verkrijgen.
      OPMERKING: Fenol is een gevaarlijke chemische stof. Volg de juiste gezondheids- en veiligheidsvoorschriften. Werk in de zuurkast.
    2. Centrifugeer gedurende 15 min. op 15.000 × g. Breng de waterfase over in een verse microcentrifugebuis van 2 ml. Voer een terugwinning van de onderste laag uit met 100 μL TLE-buffer en breng de waterfase over in dezelfde buis van 2 ml.
    3. Precipitaat DNA door toevoeging van 2 volumes 100% ethylalcohol (EtOH), 0,1 volumes van 3 M natriumacetaat en 2 μL 20 mg/ml glycogeen. Incubeer bij -20 °C gedurende een periode variërend van 2 uur tot 's nachts.
    4. Draai op 15.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C en was de pellets 2x met ijskoude 70% EtOH. Droog de pellets bij RT en resuspend in 100 μL TLE buffer. Kwantificeer het DNA met behulp van een fluorogene kleurstof die selectief aan DNA en een fluorometer bindt volgens de instructies van de fabrikant (Tabel van materialen).
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken. Bewaar ligatieproducten bij 4 °C voor de korte termijn of bij -20 °C voor de lange termijn. Gebruik een aliquot (100 ng) van het materiaal als ligated monster (L) voor kwaliteitscontrole.

7. Beoordeel de kwaliteit van hi-c-sjablonen

  1. Kwalitatieve controles op de spijsvertering en ligatie
    1. Zuiver DNA van de UD en D aliquots door de crosslinks om te draaien en voer fenol:chloroform extractie en ethanol neerslag uit zoals hierboven beschreven.
    2. Laad 100 ng UD-, D- en L-monsters in een 1,5% agarosegel. Zoek naar een uitstrijkje gecentreerd rond 500 bp in het D-monster versus een hoge moleculaire gewichtsband voor het L-monster (zie representatieve resultaten).
  2. Kwantitatieve controle van de spijsverteringsefficiëntie
    OPMERKING: Om de spijsverteringsefficiëntie nauwkeuriger te beoordelen, gebruikt u de UD- en D-monsters als sjablonen om kwantitatieve polymerasekettingreacties (qPCR) uit te voeren met behulp van primers die als volgt zijn ontworpen.
    1. Ontwerp een primerpaar dat een DNA-fragment versterkt dat de DNA-beperkingsplaats bevat voor het enzym dat wordt gebruikt voor de spijsvertering (Mbo I in het huidige protocol), R genoemd in de formule in stap 7.2.3.
    2. Ontwerp een primerpaar dat een controle-DNA-fragment versterkt dat niet de beperkingsplaats bevat voor het enzym dat voor de spijsvertering wordt gebruikt (Mbo I voor het huidige protocol), C genoemd in de formule in stap 7.2.3.
    3. Gebruik de cyclusdrempelwaarden (Ct-waarden) van de versterking om de beperkingsefficiëntie te berekenen volgens de onderstaande formule:
      % restrictie = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
      Waarbij CtR verwijst naar de Ct-waarde van fragment R, en CtC verwijst naar de Ct-waarde van het fragment C voor monster D en monster UD.
      OPMERKING: Het beperkingspercentage weerspiegelt de efficiëntie van het restrictie-enzym dat het beperkte (R) DNA-fragment splijt in vergelijking met een controle(C) DNA-fragment dat de beperkings-DNA-locatie niet bevat. Een beperkingsefficiëntie van ≥ 80% wordt aanbevolen.
  3. Detectie van bekende interacties
    1. Voer PCR uit om een interne ligatiecontrole te versterken om interacties op korte en/of middellange of lange afstand te onderzoeken (zie representatieve resultaten).
    2. U kunt ook primers ontwerpen om een ligatieproduct te versterken waarbij de primers in voorwaartse of omgekeerde richting in aangrenzende beperkingsfragmenten staan.
  4. Invul- en biotinelabeling
    1. Controleer de hi-C markering en ligatie-efficiëntie door versterking en vertering van een bekende interactie of een ligatieproduct tussen aangrenzende beperkingsfragmenten in het genoom, zoals hierboven beschreven.
      OPMERKING: Succesvolle invulling en ligatie van de Mbo I-site (GATC) genereert een nieuwe site voor het restrictie-enzym Cla I (ATCGAT) op het ligatieknooppunt en regenereert de Mbo I-site.
    2. Verteer het PCR-product met Mbo I, Cla I of beide. Na het uitvoeren van de monsters op een gel van 1,5-2%, schat u het relatieve aantal 3C- en Hi-C-ligatieverbindingen door de intensiteit van de snede- en ongesneden banden te kwantificeren26.
      OPMERKING: Een efficiëntie van > 70% is gewenst (zie representatieve resultaten).

8. Sonicatie

  1. Soniceer de monsters om 200-500 bp DNA fragmenten te verkrijgen. Verdun voor het instrument dat in dit protocol wordt gebruikt (zie de tabel met materialen)het monster (van 5 tot 10 μg) in 130 μL ddH2O per buis en stel het instrument in op sonicaat tot 400 bp: vulniveau: 10; heffingsfactor: 10%; piekincidentvermogen (w): 140; cycli per uitbarsting: 200; tijd(en): 80.

9. Biotine verwijdering / eindreparatie

OPMERKING: De onderstaande stappen zijn aangepast voor 5 μg Hi-C DNA.

  1. Breng het monster (130 μL) over in een verse microcentrifugebuis om de verwijdering van biotine uit te voeren. Voeg 16 μL 10x ligatiebuffer, 2 μL van 10 mM dATP, 5 μL T4 DNA Polymerase (15U) en 7 μL ddH2O (160 μL totaal volume) toe. Incubeer bij 20 °C gedurende 30 min.
  2. Voeg 5 μL 10 mM dNTPs, 4 μL 10x ligatiebuffer, 5 μL T4 polynucleotidekinase (10 U/μL), 1 μL Klenow en 25 μL ddH2O (200 μL totaal volume) toe. Incubeer bij 20 °C gedurende 30 min.

10. Grootte selectie

  1. Om fragmenten te selecteren, meestal in het bereik van 250-550 bp, voert u eerst sequentiële SPRI-grootteselectie (Solid Phase Reversible Immobilization) uit met 0,6x, gevolgd door 0,90x volgens de instructies van de fabrikant, en elute het DNA met behulp van 100 μL TLE.

11. Biotine pulldown/A-tailing/adapter ligatie

OPMERKING: Voer de wasbeurten uit door de magnetische kralen opnieuw te gebruiken door te vortexen, draai de monsters gedurende 3 minuten op een draaiend wiel en draai het monster vervolgens kort naar beneden en plaats het op de magnetische standaard. Laat de kralen aan de magneet plakken, gooi het supernatant weg en ga verder met de volgende wasstap. Voer de wasbeurten uit bij 55 °C op een thermoblok met rotatie in plaats van het roterende wiel.

  1. Maak het uiteindelijke volume op tot 300 μL per monster met TLE voor pull-down. Bereid de kraalwasbuffers voor: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% Tween), 0.5x TB, 1x No-Tween buffer (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM
  2. Gebruik 150 μL streptavidine-gebonden magnetische kralen (zie de tabel met materialen)per bibliotheek. Was de kralen 2x met 400 μL 1x TB. Resuspend kralen in 300 μL 2x NTB.
  3. Meng de kralen met het 300 μL Hi-C materiaal en incubeer bij RT gedurende 30 minuten op een draaiend wiel om biotinebinding aan streptavidin kralen mogelijk te maken.
  4. Was de kralen met 400 μL van 0,5x TB en incubeer gedurende 3 minuten op 55 °C, draaiend bij 750 tpm. Was de kralen in 200 μL 1x restrictiebuffer.
  5. Resuspendeer de kralen in 100 μL dATP tailing mix (5 μL van 10 mM dATP, 10 μL van 10x restrictiebuffer, 5 μL Klenow exo-, en 80 μL ddH2O). Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
  6. Verwijder het supernatant, was de kralen 2x met 400 μL van 0,5x TB door gedurende 3 minuten op 55 °C te broeden en bij 750 tpm te draaien.
  7. Was de kralen met 400 μL van 1x NTB en vervolgens met 100 μL 1x ligatiebuffer.
  8. Resuspend de kralen in 50 μL van 1x ligatiebuffer en breng de suspensie over naar een nieuwe buis. Voeg 4 μL voorgegloeide PE-adapters (15 μM-voorraad) en 2 μL T4-ligase (400 U/μL, d.w.z. 800 U/tube) toe; incubeer bij RT gedurende 2 uur.
    OPMERKING: Voorgloei de adapters door gelijke volumes van zowel PE 1.0- als PE 2.0-adapters (voorraad van 30 μM) toe te voegen en gedurende 10 minuten bij RT te broeden (zie de tabel met materialen).
  9. Herover de kralen door het supernatant te verwijderen en de kralen 2x te wassen met 400 μL TB. Was de kralen met 200 μL van 1x NTB, vervolgens met 100 μL 1x restrictiebuffer en resuspend de kralen in 40 μL 1x restrictiebuffer.

12. PCR-versterking

  1. Stel PCR's van 25 μL volume in met 5, 6, 7 en 8 cycli. Gebruik voor elke PCR:
    Reactie Recept
    Hi-C kralen2,5 μL
    10 μM PE PCR primer 1 (Tabel van Materialen)0,75 μL
    10 μM PE PCR primer 2 (Tabel van Materialen)0,75 μL
    10 mM dNTP0,6 μL
    5x reactiebuffer5 μL
    DNA-polymerase0,3 μL
    ddH2O14,65 μL
    Totaal25 μL
    CycliTemperatuurTijd
    198 °C30 s
    n cycli98 °C10 s
    65 °C30 s
    72 °C30 s
    172 °C7 min

13. Definitieve PCR-versterking

  1. Voer de uiteindelijke PCR-versterking uit onder dezelfde omstandigheden als hierboven beschreven en het aantal geselecteerde cycli. Splits het monster met 5 μL Hi-C kralen als sjabloon in 50 μL reacties.
  2. Verzamel alle PCR-reacties en breng ze over naar een verse buis. Gebruik de magneet om de streptavidin kralen te verwijderen en het supernatant (PCR producten) terug te winnen. Breng de kralen over in een verse buis, was de kralen zoals aangegeven in stap 11.2.9 en bewaar in 1x beperkingsbuffer bij 4 °C als back-up.
  3. Zuiver de PCR-producten met 0,85x het volume van de SPRI-kralen volgens de instructies van de fabrikant. Elute met 30 μL TLE buffer.
  4. Kwantificeer de Hi-C-bibliotheek met behulp van een fluormetrisch instrument en bevestig de kwaliteit van de bibliotheek door capillaire elektroforese op basis van chips.
  5. Gebruik als laatste kwaliteitscontrolepunt 1 μL van de Hi-C-bibliotheek als sjabloon om een PCR-reactie uit te voeren met behulp van 10 cycli met dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 12.1. Verdeel het PCR-product in twee microcentrifugebuizen: verteer de ene met Cla I en laat de andere onverteerd als controlemiddel. Voer de producten uit in een agarosegel van 1,5-2% (zie representatieve resultaten).
  6. Ga verder met 50 bp of 75 bp paired-end sequencing op een geschikt sequencing platform.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hieronder worden de resultaten van een succesvol Hi-C-protocol beschreven (zie een samenvatting van de hi-c-protocolworkflow in figuur 1A). Er zijn verschillende kwaliteitscontrolecontrolepunten tijdens het hi-C-experiment in de kern. Monster aliquots werden verzameld vóór (UD) en na (D) de chromatine restrictie stap en na ligatie (L). Crosslinks werden omgekeerd, en DNA werd gezuiverd en op een agarose gel gelopen. Een uitstrijkje van 200-1000 bp werd waargenomen bij een beperking met Mbo I...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier gepresenteerde hi-c-methode in de kern heeft een gedetailleerde verkenning van de drosophila-genoomtopologie met hoge resolutie mogelijk gemaakt, waardoor een beeld werd verkregen van genomische interacties op verschillende genomische schalen, van chromatinelussen tussen regulerende elementen zoals promotors en versterkers tot TAD's en identificatie van grotecompartimenten 25. Dezelfde technologie is ook efficiënt toegepast op weefsels van zoogdieren met enkele wijzigingen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) subsidienummer IN207319 en de Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) subsidienummer 303068. A.E.-L. is een masterstudent ondersteund door de CVA-nummer 968128 van de Science and Technology National Council (CONACyT).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16% (vol/vol) paraformaldehydeoplossingAgar ScientificR1026
Biotin-14-dATPInvitrogenCA1524-016
ClaI enzymNEBR0197S
COVARIS UltrasonicatorCovarisLE220-M220
Cut SmartNEBB72002S
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) 1xLife Technologies41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1Invitrogen65002
Fetaal bovien serum (FBS) steriel gefilterdSigmaF9665
Klenow Dna PolI groot fragmentNEBM0210L
Klenow exo(-)NEBM0210S
Ligatie BufferNEBB020S
MboI enzymNEBR0147M
NP40-IgepalSIGMACA-420Non-ionogene oppervlakteactieve stof voor toevoeging in lyseringsbuffer
PE adapter 1.0Illumina5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'
PE adapter 2.0Illumina5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 1.0Illumina5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 2.0Illumina5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'
Fenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1SIGMAP2069
Primer 1 (bekende interactie, Figuur 2A)Sigma5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'
Primer 2 (bekende interacties, Figuur 2A)Sigma5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'
Protease inhibitor cocktail tabletRoche4693132001
Proteinase KRoche3115879001
QubitThermoFisherQ33327
RNAseRoche10109142001
SPRI BeadsBeckmanB23318
T4 DNA ligaseInvitrogen15224-025
T4 DNA polymeraseNEBM0203S
T4 polynucleotide kinase (PNK) NEBM0201L
TaqPhusionNEBM0530SDNA polymerase
Triton X-100Non-ionogene oppervlakteactieve stof voor de activering van SDS

Referenties

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
  4. Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
  5. Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
  6. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
  7. Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
  8. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  9. Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
  10. Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
  11. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
  12. Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
  13. Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
  14. Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
  15. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
  16. Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82(2014).
  17. Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189(2018).
  18. Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
  19. Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
  20. Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403(2013).
  21. Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
  22. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  23. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  24. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175(2015).
  25. Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894(2020).
  26. Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).
  27. Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259(2015).
  28. Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093(2016).
  29. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310(2015).
  30. Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
  31. Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198(2015).
  32. Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189(2018).
  33. Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
  34. Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
  35. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137(2008).
  36. Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
  37. Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
  38. Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
  39. Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
  40. Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
  41. Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
  42. Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
  43. Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Chromatinestructuurtopologisch geassocieerde domeinenTAD-grenzenarchitecturale eiwittenchromatinverteringbiotine-pulldownCRISPR-genetische modificatiegenomische interacties
Hi-C in nucleus in drosophilacellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.