We beschrijven het gebruik van een varkenshoornvlies om de antivirale werkzaamheid van experimentele geneesmiddelen te testen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Porcine Corneal Tissue Explant om de werkzaamheid van Herpes Simplex Virus-1 Antivirale middelen te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Virussen en bacteriën kunnen een verscheidenheid aan oculaire oppervlaktedefecten en degeneratie veroorzaken, zoals wonden en zweren door hoornvliesinfectie. Met een seroprevalentie die wereldwijd varieert van 60-90%, veroorzaakt het Herpes Simplex Virus type-1 (HSV-1) vaak mucocutane laesies van het orofaciale gebied die zich ook manifesteren als laesies en infectiegerelateerde blindheid. Hoewel de huidige antivirale geneesmiddelen effectief zijn, vereist het ontstaan van resistentie en persistentie van toxische bijwerkingen de ontwikkeling van nieuwe antivirale middelen tegen deze alomtegenwoordige ziekteverwekker. Hoewel in vitro beoordeling enkele functionele gegevens oplevert met betrekking tot een opkomend antiviraal middel, tonen ze de complexiteit van oculair weefsel in vivo niet aan. In vivo studies zijn echter duur en vereisen getraind personeel, vooral bij het werken met virale agentia. Vandaar dat ex vivo modellen efficiënte maar goedkope stappen zijn voor antivirale testen. Hier bespreken we een protocol om infectie door HSV-1 te bestuderen met behulp van varkenshoornvliezen ex vivo en een methode om ze topisch te behandelen met behulp van bestaande en nieuwe antivirale geneesmiddelen. We demonstreren ook de methode om een plaque-assay uit te voeren met behulp van HSV-1. De gedetailleerde methoden kunnen worden gebruikt om vergelijkbare experimenten uit te voeren om infecties te bestuderen die lijken op de HSV-1-ziekteverwekker.
Inleiding
Mensen die lijden aan ooginfecties lopen vaak verlies van hetgezichtsvermogen op 1. Met een hoge seroprevalentie wereldwijd lijden HSV-geïnfecteerde personen aan terugkerende ooginfecties die leiden tot cornealittekens, stromale keratitis en neovascularisatie2,3,4,5. HSV-infecties hebben ook aangetoond dat ze minder vaak een reeks ernstige aandoeningen veroorzaken bij immuungecompromitteerde, onbehandelde patiënten zoals encefalitis en systemische morbiditeit6,7,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Al het varkensweefsel dat in deze studie werd gebruikt, werd geleverd door een externe particuliere organisatie en geen van de dierbehandeling werd uitgevoerd door personeel van de Universiteit van Illinois in Chicago.
1. Materialen
-
Reagentia
- Gebruik de volgende reagentia voor plaquetest: poedermethylcellulose, Dulbecco's gemodificeerde eagle's medium (DMEM), foetaal runderserum (FBS), penicilline en streptomycine (P / S) voor plaquetest.
- Gebruik kristalviolettabletten en ethanol (moleculair biologische kwaliteit) voor het bereiden van kristalviolette oplossing voor plaque-assay.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de werkzaamheid van de experimentele antivirale middelen te begrijpen, moeten ze uitgebreid worden getest voordat ze worden verzonden voor in vivo klinische onderzoeken bij mensen. In dit verband moeten positieve controle-, negatieve controle- en testgroepen worden geïdentificeerd. Trifluorothymidine (TFT) wordt al lang gebruikt als de voorkeursbehandeling om herpes keratitis topisch te behandelen16. Gebruikt als een positieve controle, vertonen de tft behandelde hoornvliesgroepen een lagere in.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Eerder onderzoek heeft aangetoond dat BX795 een veelbelovende rol speelt als antiviraal middel tegen HSV-1-infectie; door het TANK-bindende kinase 1 (TBK1)16te remmen . Zowel TBK1 als autofagie hebben een rol gespeeld bij het helpen remmen van HSV-1-infectie, zoals aangetoond op menselijke cornea-epitheelcellen. BX795 bleek maximaal effectief te zijn met antivirale activiteit bij een concentratie van 10μM en met behulp van zowel western blot-analyse als virale plaque-analyse van belangrijke virale.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling en geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door NIH-subsidies (R01 EY024710, RO1 AI139768 en RO1 EY029426) aan D.S. A.A. werd ondersteund door een F30EY025981-beurs van het National Eye Institute, NIH. Studie werd uitgevoerd met behulp van de varkens hoornvliezen verkregen van Park Packing bedrijf, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 30 G hypodermische naalden. | BD | 305128 | |
| 500 mL glazen fles. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotisch en Antibioticum (AA) | GIBCO | 15240096 | Als portie in 5 mL buizen en ingevroren tot gebruik |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Bioveiligheidskast met een Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certificering. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Steriele Calcium Alginate Standaard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Celkrabber - 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Kristal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Bewaar het poeder op een donkere plaats |
| Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium - DMEM | GIBCO | 41966029 | Bewaar bij 4 °C tot gebruik |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetaal bovien serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Als portie in 50 mL buizen en ingevroren tot gebruik |
| Vlakke pincet - 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Vriezers --80 °C. - | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Verse doos met messen. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Gaas | Johnson & Johnson | 108 vierkante inch folder 12 lagen | |
| HSV-1 17GFP | in huis gekweekt | - | Originele stam van Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expresserende HSV-1 stam 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium - ITS | GIBCO | 41400045 | Als portie in 5 mL buizen en ingevroren tot gebruik |
| Magnetische roerder. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metaalschaar. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipetten 1 tot 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essentieel Medium - MEM | GIBCO | 11095080 | Bewaar bij 4 °C tot gebruik |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Bewaar bij 4 °C tot gebruik |
| Penicilline/streptomycine. | GIBCO | 15140148 | Als portie in 5 mL buizen en ingevroren tot gebruik |
| Fosfaat Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Bewaar op kamertemperatuur |
| Varkenshoornvliezen | Park Packaging Co., Chicago, IL | Speciale bestelling op verzoek | |
| Procedure bench covers - naar behoefte. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serologische pipetten | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serologisch pipetteerapparatuur. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscoop | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Roermagneet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Weefselkweekkolven, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Weefselkweekincubators die 5% CO2 en 37 °C temperatuur kunnen handhaven. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Weefselkweekbehandelde platen (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsine-EDTA (0,05%), fenol rood | GIBCO | 25-300-062 | Als portie in 10 mL buizen en ingevroren tot gebruik |
| Vero cellen | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
Referenties
- Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
- Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
