Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een rattenlongtransplantatiemodel van warme ischemie / reperfusieletsel: optimalisaties om de resultaten te verbeteren

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62445

⸱

28 oktober 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery Division of Cardiac Surgery, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2The Collaboration for Organ Perfusion, Protection, Engineering and Regeneration (COPPER) Laboratory, The Ohio State University College of Medicine, 3William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering, College of Engineering, The Ohio State University, 4Comprehensive Transplant Center, The Ohio State University Wexner Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we optimalisaties voor een longtransplantatiemodel bij ratten die dienen om de resultaten te verbeteren. We bieden een maattabel voor manchetten op basis van lichaamsgewicht, een meetstrategie om de 4eintercostale ruimte te bepalen en methoden voor wondsluiting en BAL (bronchoalveolaire lavage) vloeistof- en weefselverzameling.

Samenvatting

Vanuit onze ervaring met longtransplantatie bij ratten hebben we verschillende verbeterpunten gevonden. Informatie in de bestaande literatuur over methoden voor het kiezen van geschikte manchetmaten voor de longader (PV), longslagader (PA) of bronchus (Br) is gevarieerd, waardoor het bepalen van de juiste manchetgrootte tijdens longtransplantatie bij ratten een oefening van vallen en opstaan is. Door de manchettechniek te standaardiseren om de kleinste effectieve manchet te gebruiken die geschikt is voor de grootte van het vat of de bronchus, kan men de transplantatieprocedure veiliger, sneller en succesvoller maken. Omdat diameters van de PV, PA en Br gerelateerd zijn aan het lichaamsgewicht van de rat, presenteren we een strategie voor het kiezen van een geschikte maat met behulp van een op gewicht gebaseerde gids. Aangezien het longvolume ook gerelateerd is aan het lichaamsgewicht, raden we aan dat deze relatie ook moet worden overwogen bij het kiezen van het juiste luchtvolume voor donorlonginflatie tijdens warme ischemie en voor het juiste volume PBS dat moet worden ingebracht tijdens bronchoalveolaire lavage (BAL) vloeistofverzameling. We beschrijven ook methoden voor4e intercostale ruimtedissectie, wondsluiting en monsterverzameling van zowel de inheemse als de getransplanteerde lobben.

Inleiding

Al meer dan drie decennia zijn onderzoekers bezig met het aanpassen en verbeteren van longtransplantatiemodellen bij ratten, zodat de gegenereerde gegevens consistenter zijn en meer een afspiegeling zijn van de werkelijke klinische toestand. In de tijd dat ons laboratorium dit model uitvoerde, hebben we vier verbeterpunten bepaald: manchettechnieken voor anastomosen, identificatie van de 4eintercostale ruimte van de ontvanger, longinflatie en wondsluiting tijdens de procedure van de ontvanger en het oogsten van monsters voor analyse.

Manchettechniekaanpassingen voor anastomosen kunnen de hele transplantatieprocedure verbeteren door de behandelingstijd van de donorlong 1,2,3,4,5,6 te verkorten en de anastomoseprocedure sneller en technisch gemakkelijker te maken voor de microchirurg. Hoewel het van cruciaal belang is om de juiste maat manchetten te gebruiken om het nodige bloed en de luchtstroom naar de getransplanteerde long te leveren, is er beperkte begeleiding met betrekking tot hoe men de grootte van manchetten voor de longader (PV), longslagader (PA) of bronchus (Br) 5,7,8,9 moet kiezen. Aangezien de diameters van de PV, PA en Br gerelateerd zijn aan het lichaamsgewicht van de donor- en ontvangerratten, stellen we voor dat de manchetgrootte wordt gebaseerd op het lichaamsgewicht. Dit rapport biedt een maattabel voor manchetten op basis van het lichaamsgewicht van een rat (180 g tot meer dan 270 g) die dient om de bloed- en luchttoevoer naar de getransplanteerde long te optimaliseren (tabel 1).

Terwijl een nieuwere microchirurg met succes en gemakkelijk een donorlong kan verkrijgen tijdens de donorprocedure, is het transplanteren van de long tijdens de procedure van de ontvanger ingewikkelder en afhankelijk van de ervaring van de microchirurg. Pogingen om de 4eintercostale ruimte te vinden om toegang te krijgen tot de linkerlong van de ontvanger is een van de moeilijkere stappen die enige subjectiviteit bevat en de proceduretijd kan verlengen. Daarom introduceren we een eenvoudige en objectieve methode om te helpen bij de identificatie van de4e intercostale ruimtelocatie door gebruik te maken van borstmetingen en de hartkloppingen om het juiste gebied borstwand te vinden om 4,5,6,10,11,12 te ontleden.

We stellen ook een verbetering voor van de donorlonginflatie, die een potentiële bron van letsel aan het orgaan is. De donorlong loopt leeg totdat de reperfusie begint. Tijdens het hechten van de 4eintercostale ruimte wordt de donorlong gewoonlijk opgeblazen door de PEEP te verhogen van 2 cmH 2 O naar 6 cmH2O. Om longletsel door overinflatie te minimaliseren, stellen we een techniek voor waarbij drie 6-0 nylon hechtingen worden geplaatst rond de 4e rib inferieur aan de5e rib met eenvoudige dubbele knopen. Wanneer het tijd is voor wondsluiting, worden de uiteinden van de drie hechtingen vastgehouden met hemostaten in beide handen, wordt de wond in één keer gesloten door aan elke kant omhoog te trekken en wordt PEEP onmiddellijk teruggebracht tot 2 cmH2O. Op deze manier kan de long zo kort mogelijk uitzetten10.

Aan het einde van een experiment wil de onderzoeker vaak vele soorten monsters verzamelen voor vele soorten analyses van elke transplantatie. Snap bevroren weefsel, formaline vast weefsel, weefsel voor nat-droog gewichtsverhouding om longoedeem te bepalen en bronchoalvelolar lavage (BAL) vloeistof kunnen bijvoorbeeld allemaal worden gebruikt om te beoordelen hoe goed de transplantatie is verlopen. De traditionele methode voor het verzamelen van BAL-vloeistof maakt een gemengd gepoold monster mogelijk van zowel de inheemse lobben van de ontvanger als de getransplanteerde kwab van de donor13,14,15. Om dit te ondervangen, presenteren we een methode om de hilaire gebieden te klemmen die nauwkeuriger inzicht kan geven in de toestand van de getransplanteerde en inheemse longen. Bovendien is het volume PBS dat wordt gebruikt om BAL-vloeistof van elke kant van de longen te verzamelen belangrijk om te overwegen, omdat BAL-vloeistof tal van oplosbare factoren bevat, zoals cytokines en chemokines die worden gemeten op basis van concentratie. Het normaliseren van het volume van de vloeistof die wordt ingebracht tot het geschatte volume van de longcapaciteit kan helpen bij het vergelijken. Met vier lobben aan de rechterkant en één lob aan de linkerkant, heeft elk van de vijf lobben van de rat een ander volume en oppervlak16. Volgens een eerdere studie over volumemeting van longkwabben door Backer et al., van het totale volume van de hele long is het volume van de rechterkwabben 63% (4400 mm 3) en de linkerkwab 37% (2500 mm3). Daarom raden we aan dat het volume PBS dat wordt gebruikt om BAL-vloeistof te verzamelen, moet worden berekend als tweemaal het getijdenvolume (7,2 ml / kg) vermenigvuldigd met 63% voor de rechterlong en 37% voor de linkerlong. Door deze aanpak te gebruiken, kan men beter controleren op variabelen zoals lichaamsgewicht en timing10,16.

Al met al zullen we in dit rapport enkele wijzigingen in het standaard experimentele model van longtransplantatie bij ratten demonstreren die de procedure efficiënter kunnen maken en het vermogen kunnen vergroten om nauwkeurigere en overvloedigere gegevens van elk experiment te genereren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Mannelijke Sprague-Dawley-ratten (180-270 g lichaamsgewicht) werden commercieel gekocht (bijv. Envigo) en werden gehuisvest onder pathogeenvrije omstandigheden in de Ohio State University Animal Facility. Alle procedures werden humaan uitgevoerd volgens de NIH en de National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals en met de goedkeuring van the Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol # 2012A00000135-R2).

1. Eerste installatie

  1. Chirurgische apparaten instellen.
    OPMERKING: Dit is een niet-overlevingsoperatie. Als overlevingsoperaties moeten worden uitgevoerd, moeten steriele instrumenten en barrièrevoorzorgsmaatregelen worden genomen.
    1. Schakel de hartslag-/zuurstofsaturatiebewakingsapparatuur en het verwarmingsbord in op 42 °C.
    2. Schakel het ventilatie- en anesthesieapparaat in om de isofluraanverdamper voor te verwarmen.
      OPMERKING: Gebruik een getijdenvolume (Td) van 7,2 ml/kg, een positieve expiratoire druk (PEEP) van 2 cmH2O en een ademhalingsfrequentie van 80 bpm.
    3. Vul de anesthesiespuit met 10 ml vloeibaar isofluraan en monteer de spuit op het beademings- en anesthesieapparaat.
    4. Schakel de chirurgische microscoop in met de hoogte en focus aangepast aan de voorkeuren van de microchirurg.
    5. Schakel het elektrocautery-apparaat in.
  2. Bereid chirurgische hulpmiddelen voor en leg ze klaar (figuur 1).
    OPMERKING: Alle chirurgische hulpmiddelen werden gedurende 30 minuten geautoclaveerd bij 121 °C.
  3. Verzamel en registreer het lichaamsgewicht van donor- en ontvangerratten.
  4. Gebruik tabel 1 en het lichaamsgewicht van de rat om de juiste maat van de angiokatheter (20, 18, 16, 14 of 12 G) te bepalen om manchetten te maken.
  5. Bereid manchetten voor longslagader (PA), bronchus (Br) en longader (PV) voor met behulp van de maattabel op basis van lichaamsgewicht (tabel 1 en figuur 2).
    1. Plaats een angiokatheter van 20 G, 18 G, 16 G, 14 G of 12 G (Figuur 2A-E) op een steriel oppervlak onder de chirurgische microscoop.
    2. Gebruik vervolgens een rib-back chirurgisch mes # 11 (figuur 2F) om de angiokatheter in een hoek van 90 ° te snijden om een 2 mm lang manchetlichaam te vormen met een lipje van 1 mm x 1 mm (breedte x hoogte) aan de bovenkant van het manchetlichaam (figuur 2G).
    3. Bewaar manchetten in steriele zoutoplossing totdat ze klaar zijn voor gebruik.
  6. Bereid oplossingen voor.
    1. Bereid een mengsel van ketamine en xylazine in een steriele injectieflacon door 1 ml xylazine (100 mg / ml) toe te voegen aan 10 ml ketamine (100 mg / ml).
      OPMERKING: De vervaldatum voor deze cocktail wordt bepaald aan de hand van de vroegste vervaldatum van de gebruikte componenten.
    2. Zuig in spuiten de juiste dosering voor de ratten (0,1 ml van het ketamine / xylazine-mengsel per 100 g lichaamsgewicht van de rat; bijvoorbeeld voor een rat van 200 g zou 0,2 ml ketamine / xylazine-mengsel worden afgeleverd).
      OPMERKING: Deze dosering levert 91 mg / kg ketamine en 9,1 mg / kg xylazine aan de rat en moet een rat 60-80 minuten verdoofd houden.
    3. Bereid heparine dat wordt toegediend in een dosis van 1.000 E/kg.
    4. Bewaar de zoutoplossing, PBS en conserveringsoplossing op ijs (Materiaaltabel).

2. Voorbereiding van donorratten

  1. Induceer anesthesie bij de donorrat door intraperitoneaal het ketamine- en xylazinemengsel te injecteren en ~ 10 minuten te wachten tot zich een chirurgisch anesthesievlak ontwikkelt dat kan worden beoordeeld door gebrek aan respons op teenknijpen.
  2. Scheer het incisiegebied met behulp van elektronische tondeuses.
  3. Plaats de donorrat in rugligging op de chirurgische verwarmingsplaat en veeg het incisiegebied af met een steriel gaasje gedrenkt in betadine. Veeg vervolgens het gebied af met een 70% isopropylalcoholdoekje. Herhaal dit 3 keer.
  4. Maak een 3 tot 4 cm middellijn huidincisie halverwege de nek met een schaar en ontleed zorgvuldig onderhuidse weefsels en spieren met een tang (in plaats van een schaar om bloedingen te voorkomen).
  5. Voor endotracheale intubatie, rijg 4-0 zijden hechtdraad rond de luchtpijp en breng een 16 G angio-katheter in de luchtpijp. Bind de hechtdraad rond de luchtpijp stevig vast met een dubbele knoop en eindig vervolgens met een enkele knoop om de angio-katheter op zijn plaats te houden.
  6. Sluit de angiokatheter aan op de beademingsmachine en onderhoud een chirurgisch anesthesievlak bij de rat met 1-2% isofluraan.
  7. Voer een laparo-sternotomie uit als een gecombineerde middellijn en transversale incisie met behulp van een schaar.
  8. Injecteer heparine (1.000 E/kg) met een insulinespuit via de inferieure vena cava (IVC) en laat 10 minuten voor systemische circulatie.
    OPMERKING: Deze toediening van heparine voorkomt bloedstolsels in de donorlong.
  9. Ontleed het diafragma voorzichtig door langs de thoracale boog te snijden en leg vervolgens de thoracale holte bloot door het borstbeen naar de nek te volgen.

3. Donorlong-ischemie en verkrijging

  1. Euthanaseer de donorrat door het IVC door te snijden.
  2. Terwijl de longen nog steeds ventileren, knipt u zowel de rechter- als de linkeroorschelp met een micro-ontleedveerschaar en gravity flush-longen met 20 ml conserveringsoplossing in een spuit die op 28 cmH2O hangt door de zwaartekracht verbonden met slangen en een 18 G angio-katheter die rechtstreeks door de longslagader wordt ingebracht.
  3. Koppel de ventilator los van de endotracheale buis en sluit deze aan op een spuit van 5 ml gevuld met een juiste hoeveelheid lucht op basis van het lichaamsgewicht.
    OPMERKING: Het volume lucht om de longen op te blazen kan worden berekend als met tweemaal het getijdenvolume (Td = 7,2 ml / kg), bijvoorbeeld, een rat van 200 g zou een Td van 1,44 ml hebben en vermenigvuldigen met 2 zou gelijk zijn aan 2,88 ml lucht die nodig is om de longen op te blazen.
  4. Blaas de longen van de donor op.
  5. Plaats een Yasargil-klem op de luchtpijp om de longen opgeblazen te houden en bedek de longen en het hart met steriel katoenen gaas. Hydrateer het gaas met zoutoplossing, wikkel de donorrat met een onderkussen en laat het 1 uur op het verwarmende operatiebord liggen om warme ischemie in de longen te veroorzaken (figuur 3).
  6. Na 1 uur warme ischemie, snijd het hart-longblok met micro-ontleedveerschaar en tang en plaats op steriel gaas bevochtigd met ijskoude PBS op een steriele petrischaal op ijs.
    OPMERKING: Alle volgende stappen moeten plaatsvinden terwijl de longen op de petrischaal op ijs liggen.
  7. Snijd longbanden zorgvuldig in met een micro-ontleedbare veerschaar om de linkerlong te scheiden van de slokdarm en de post-cavalkwab.
  8. Knip het linker long hilar gebied voorzichtig bij met Vannas-Tubingen veerschaar en zorg voor de linker PV, PA en Br.
  9. Plaats manchetten op PV, PA of Br (figuur 4A-C).
    1. Gebruik een mug hemostat om het manchetlipje vast te pakken.
    2. Gebruik een fijne tang om het distale uiteinde van de PV, PA of Br door het juiste manchetlichaam te grijpen, het extra weefsel rond de manchet te gebruiken en vast te zetten met 8-0 Nylon hechtdraad. Gebruik Vannas-Tübingen veerschaar om extra weefsel en de manchet rond het manchetlichaam te trimmen.
  10. Houd de donorlong bedekt met gaas bevochtigd met zoutoplossing op de petrischaal op ijs totdat deze klaar is om te worden getransplanteerd in de ontvangende rat (figuur 4D).
    OPMERKING: De gemiddelde koude ischemietijd is 84 min ± 11 min S.D.

4. Voorbereiding van de ontvangende ratten

  1. Induceer anesthesie bij de ontvangende rat op dezelfde manier als de donorrat door intraperitoneaal het ketamine- en xylazinemengsel (0,1 ml per 100 g rat) te injecteren en 10 minuten te wachten tot een chirurgisch anesthesievlak zich ontwikkelt dat kan worden beoordeeld door gebrek aan respons op teenknijpen.
  2. Scheer incisiegebied met behulp van elektronische tondeuses.
  3. Plaats de donorrat in rugligging en veeg het incisiegebied af met een steriel gaasje gedrenkt in betadine. Veeg vervolgens het gebied af met een 70% isopropylalcoholdoekje. Herhaal dit 3 keer.
  4. Voordat de rat aan de beademingsmachine wordt bevestigd, tekent u lijnen op de borst van de rat ter voorbereiding op het vinden van de 4e intercostale ruimte.
    1. Meet de borstkas van de suprasternale inkeping tot de xiphoid-processus en teken een lijn (figuur 5A).
    2. Teken in het midden van deze lijn een lijn langs de linkerkant van de borst die de helft van de meting meet van de suprasternale inkeping tot het xiphoid-proces (figuur 5A en B).
  5. Intubeer de ontvanger met behulp van een angiokatheter van 16 G via visualisatie met behulp van de glasvezelkabel die is aangesloten op een LED-lampje van de endotracheale intubatiekit.
  6. Sluit de angio-katheter aan op de ventilator en onderhoud een chirurgisch anesthesievlak met 1-2% isofluraan.
  7. Om de 4eintercostale ruimte te vinden, zoekt u het gebied van de borstwand waar een sterke voelbare hartimpuls kan worden gevoeld (figuur 5C, rode cirkel).
  8. Snijd op deze locatie de huid in met een schaar en de spier met een micro-ontleedveerschaar en gebruik het oprolmechanisme om de 4e intercostale ruimte zo ver mogelijk te openen (figuur 5D en E).
    OPMERKING: Gebruik elektrische cauterie om bloedingen tijdens de spierdissectie te voorkomen of te stoppen.
  9. Zodra de intercostale ruimte wijd is geopend, ontleedt u voorzichtig de ligamenten rond de linkerlong van de ontvanger met behulp van een Vannas-Tübingen veerschaar en trekt u de long uit het borstgebied met behulp van steriele wattenstaafjes en een tang.
  10. Plaats steriel gaas rond de linkerlong en houd het vast met een Dieffenbach bulldogklem.
  11. Breng een Yasargil-klem zo proximaal mogelijk aan op het hilaire gebied van de linkerlong.

5. Anastomosen

  1. Pulmonale ader (PV) anastomose
    1. Plaats 7-0 nylon hechting rond de PV van de ontvanger.
    2. Snijd het PV van de ontvanger in met de Vannas-Tübingen veerschaar door de bovenste en onderste segmentaderen zo distaal mogelijk door te snijden en spoel bloed uit met 0,2 ml gehepariniseerde zoutoplossing (1 U / ml) met behulp van een insulinespuit.
    3. Plaats de donorlong nog omwikkeld met ijskoud nat steriel gaas in de borstholte.
    4. Steek het PV met manchetten van de donor in het PV van de ontvanger en zet het vervolgens vast met de voorgeplaatste 7-0 nylon hechting (figuur 6).
  2. Bronchiale (Br) anastomose
    1. Plaats 7-0 nylon hechting rond de Br van de ontvanger.
    2. Snijd de Br van de ontvanger in door de bovenste en onderste segmentale luchtwegen zo distaal mogelijk dwars af te snijden met een veerschaar van Vannas-Tübingen.
    3. Steek de geboeide Br van de donor in de Br van de ontvanger en zet vast met de voorgezette 7-0 nylon hechting (figuur 6).
  3. Longslagader (PA) anastomose:
    1. Plaats 7-0 nylon hechting rond de PA van de ontvanger.
    2. Snijd de PA van de ontvanger uit de adventitiële schede, snijd de helft van de omtrek van het vat in met een Vannas-Tübingen veerschaar en spoel vervolgens bloed in de PA met 0,2 ml gehepariniseerde zoutoplossing (1 U / ml) met behulp van een insulinespuit.
    3. Steek de geboeide PA van de donor in de PA van de ontvanger en zet deze vast met de voorgezette 7-0 nylon hechting (figuur 6).

6. Reperfusie

  1. Verwijder de Yasargil-klem op de hilum om reperfusie en beademing van de getransplanteerde donorlong mogelijk te maken (figuur 7).
  2. Ontleed de inheemse linkerlong van de ontvanger met behulp van een micro-ontleedveerschaar en -tang.
  3. Herpositioneer de getransplanteerde linkerlong zorgvuldig in de thorax van de ontvanger.
  4. Sluit de thoracotomie-incisie met behulp van 6-0 nylon hechtdraad.
    1. Plaats drie 6-0 nylon hechtingen met eenvoudige dubbele knopen rond de ribben superieur aan de 4e rib en inferieur aan de 5erib (figuur 8A).
    2. Gebruik hemostaten om de drie hechtingen samen te brengen (figuur 8B).
    3. Verhoog de PEEP tot 6 cmH2O in de ventilatiestanden.
    4. Bind alle drie de knopen tegelijkertijd samen door weg te trekken om de wond te sluiten (figuur 8C).
    5. Verlaag de PEEP onmiddellijk tot 2 cmH2O.
    6. Sluit de huid met 6-0 nylon hechting.
      OPMERKING: Ons laboratorium bestudeert de acute fase na transplantatie, zodat de ontvangende rat in dit model 3 uur na de transplantatie wordt overleefd onder beademing en anesthesie en vervolgens worden monsters verzameld.

7. Verzameling van experimentele monsters (plasma, longweefsel)

  1. Voor controlemonsters verzamelt u de rechterkwabben van de donor nadat de reperfusieperiode van 3 uur is gestart.
    1. Vries de superieure kwab en post-cavalkwab in voor eiwit- of RNA-expressieanalyses, behoud de middelste kwab voor histologie en gebruik de inferieure kwab voor de verhouding tussen nat en droog gewicht (figuur 9A).
  2. Bereid u 10 minuten voor het einde van de reperfusietijd van 3 uur voor op het oogsten van de ontvangermonsters door heparine (1.000 E/kg) met een insulinespuit in de halsader te injecteren.
    OPMERKING: Deze toediening van heparine voorkomt bloedstolsels in de longen en zorgt voor een grondiger blozen op het moment van verkrijging.
  3. Plasma collectie
    1. Aan het einde van de reperfusieperiode van 3 uur verzamelt u 1 ml bloed met een spuit via de IVC.
    2. Bewaren op ijs en vervolgens centrifugeren op 2.000 x g gedurende 10 minuten om plasma te oogsten.
  4. Euthanaseer de ontvangende rat door de IVC door te snijden om exsanguinatie mogelijk te maken.
  5. Ontleed het diafragma langs de thoracale boog en leg de thoracale holte bloot door de ribbenkast te ontleden.
  6. Verzamel BAL-vloeistof uit de inheemse of getransplanteerde longen indien gewenst (optioneel).
    OPMERKING: Als de verhouding tussen nat en droog gewicht of histologie op de long wordt uitgevoerd, mag balvloeistofverzameling niet worden uitgevoerd omdat dit de resultaten kan beïnvloeden.
    1. Rijg 4-0 zijden hechtdraad rond de luchtpijp en bind een strakke dubbele knoop rond de luchtpijp en intubatiebuis om vloeistoflekkage te voorkomen.
    2. Bereken de hoeveelheid ijskoude PBS voor BAL-vloeistofverzameling van de rechterlobben en linkerkwab.
      OPMERKING: De volumeverhouding voor de rechterlong is 63%, terwijl de volumeverhouding voor de linkerlong 37% is16. Om de hoeveelheid PBS te bepalen die in elke zijde moet worden ingebracht, moet het volume daarom worden berekend als tweemaal het getijdenvolume (Td = 7,2 ml / kg) vermenigvuldigd met 63% voor de rechterlong en 37% voor de linkerlong.
    3. Plaats een Yasargil-klem op het linker longgebied (figuur 10A) en spuit, met een spuit aangesloten op de angio-katheter, injecteer de berekende hoeveelheid ijskoude PBS in de rechterlong (de oorspronkelijke lobben van de ontvanger) en vang de BAL-vloeistof op door zachtjes op de zuiger van de spuit te trekken. Voer twee keer uit.
      OPMERKING: Men zou 70-80% herstel van ingesmelde vloeistof moeten verwachten.
    4. Verwijder de Yasargil-klem op de linkerlong en plaats de klem op het rechterlonggebied (figuur 10B).
    5. Verzamel BAL-vloeistof uit de getransplanteerde linkerkwab op dezelfde manier als het werd verzameld voor de rechterkwabben en verwijder vervolgens de klem op het hilaire gebied van de rechterlong.
  7. Knip de rechter en linker oorschelp met een micro-ontleedveerschaar en spoel de longen door de zwaartekracht door de PA met behulp van een 18 G angio-katheter bevestigd aan de slang en een spuit met 20 ml voorgekoelde conserveringsoplossing hangend bij 28 cmH2O.
  8. Verzamel monsters uit de long van de ontvanger.
    1. Snap-freeze de superieure kwab en post-caval kwab voor eiwit- of RNA-expressieanalyses, behoud de middelste kwab voor histologie en gebruik de inferieure kwab voor de verhouding tussen nat en droog gewicht) (figuur 9A).
    2. Verdeel de linker getransplanteerde linkerkwab in drie delen: het bovenste gebied verzameld voor snap-frozen, het middelste gebied voor histologie en het onderste gebied voor nat-droog gewichtsverhouding (figuur 9B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om longoedeem te meten, werd de verhouding nat-drooggewicht berekend. De inheemse kwab van de donor, de getransplanteerde kwab en de inheemse kwab van de ontvanger werden verzameld zoals beschreven in het protocol en onmiddellijk gewogen voor nat gewicht, gedroogd bij 60 ° C gedurende 48 uur en vervolgens opnieuw gewogen voor het droge gewicht. Een verhoogde verhouding tussen nat en droog gewicht zou wijzen op longoedeem. Onze resultaten geven aan dat de getransplanteerde kwab een significant...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit rapport hebben we ingegrepen bij verschillende kritieke stappen in een longtransplantatieprotocol bij ratten om de procedure te optimaliseren. Hoewel verschillende manchettechnieken voor longtransplantatie bij ratten zijn gemeld 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

BAW, YGL en JLK worden ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidie R01HL143000. BAW wordt ondersteund door de subsidie van het Ministerie van Defensie (DOD) W81XWH1810787. SMB wordt ondersteund door NIH-subsidie R01DK123475. JM wordt ondersteund door NIH-subsidies AR061385, AR070752, DK106394 en AG056919, evenals door DOD-subsidie W81XWH-18-1-0787.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12 Gauge angio-catheterBD382277
14 Gauge angio-catheterB. Braun4251717-02
16 Gauge angio-catheterB. Braun4252586-02
18 Gauge angio-catheterB. Braun4251679-02
20 Gauge angio-catheterB. Braun4252527-02
4-0 silk sutureSurgical Specialties Corp.SP116
6-0 nylon sutureAD SurgicalS-N618R13
7-0 nylon sutureAD SurgicalS-N718SP13
8-0 nylon sutureAD SurgicalXXS-N807T6
Betadine SprayAvrio Health L.PUPC 367618160039
ClippersVWRMSPP-023326
Castroviejo micro dissecting spring scissorsRoboz Surgical Instrument CoRS-5668
Dumont #5 - Fine ForcepsFine Science Tools11254-20
ElectrocauteryMacanMV-7A
Endotracheal intubation kitKent ScientificETI-MSE
ForcepsFine Science Tools11027-12
Halsted-mosquito hemostatRoboz Surgical Instrument CoRS-7112
HeparinFresnius Medical CareC504701
Insulin syringeLife TechnologiesB328446
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-25
Isopropyl Alcohol SwabsBD326895
KetamineHikma Pharmaceuticals PLCNDC 0413-9505-10
Dieffenbach Bulldog ClampWorld Precision InstrumentsWPI14117
Needle holder/Forceps, CurvedMicrinsMI1542
Needle holder/Forceps, StraightMicrinsMI1540
Perfadex Plus (Organ Preservation Solution)XVIVO Perfusion ABREF# 19950
PhysioSuiteKent ScientificPS-MSTAT-RTWordt gebruikt om SpO2 en hartslag te controleren
RetractorRoboz Surgical Instrument CoRS-6560
SalinePP Pharmaceuticals LLCNDC 63323-186-10
ScissorsFine Science Tools14090-11
SomnoSuite Small Animal Anesthesia SystemKent ScientificSS-MVG-Module
Sterile  Cotton Gauze PadFisherbrand22-415-469
Surgical MicroscopeLeicaM500-N w/ OHS
Syringe 5mLBD309646
Vannas-Tubingen Spring ScissorsFine Science Tools15008-08
XylazineKorn Pharmaceuticals CorpNDC 59399-110-20
Yasargil ClampAesculap, IncFT351TWordt gebruikt om de bronchus te klemmen
Yasargil ClampAesculap, IncFT261TWordt gebruikt om het hilum te klemmen
Yasargil Clamp ApplicatorAesculap, IncFT484T

Referenties

  1. Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
  2. Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
  3. Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
  4. Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1(2013).
  5. Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407(2020).
  6. Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
  7. Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
  8. Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
  9. Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
  10. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
  11. Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
  12. Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
  13. Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
  15. Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
  16. De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), Hoboken. 720-727 (2009).
  17. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309(2015).
  18. Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947(2012).
  19. Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387(2014).
  20. Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
  21. Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
  22. Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Cuffingtechnieklongslagaderlongaderbronchoalveolaire lavagedissectie van de intercostale ruimtemeting van longoedeemchirurgische microscoop
Een rattenlongtransplantatiemodel van warme ischemie / reperfusieletsel: optimalisaties om de resultaten te verbeteren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.