Methodenartikel

Nanodifferentiële scanningfluormetrie voor screening in fragmentgebaseerde looddetectie

6.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62469

⸱

16 mei 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Oncode Institute and Division of Biochemistry, the Netherlands Cancer Institute, 2Institute for Organic Chemistry and Chemical Biology, Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Johann Wolfgang Goethe-University

In dit artikel

Samenvatting

Het monitoren van veranderingen in de smelttemperatuur van een doeleiwit(d.w.z.thermische verschuivingstest, TSA) is een efficiënte methode voor het screenen van fragmentbibliotheken van een paar honderd verbindingen. We presenteren een TSA-protocol dat robotica-ondersteunde nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) implementeert voor het monitoren van intrinsieke tryptofaanfluorescentie en lichtverstrooiing voor fragmentscreening.

Samenvatting

Thermische verschuivingstests (TSA's) onderzoeken hoe de smelttemperatuur (Tm)van een doeleiwit verandert als reactie op veranderingen in zijn omgeving(bijv.buffersamenstelling). Het nut van TSA, en in het bijzonder van nano-differentiële scanningfluoimetrie (nano-DSF), is in de loop der jaren vastgesteld, zowel voor het vinden van omstandigheden die helpen bij het stabiliseren van een specifiek eiwit als voor het kijken naar ligandbinding door veranderingen in de schijnbare Tmte monitoren . Dit artikel presenteert een efficiënte screening van de Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragmentbibliotheek (768 verbindingen) door het gebruik van nano-DSF, monitoring Tm om potentiële fragmentbinding te identificeren. De vereisten met betrekking tot eiwitkwaliteit en -concentratie voor het uitvoeren van nano-DSF-experimenten worden kort geschetst, gevolgd door een stapsgewijs protocol dat een nano-liter robotdispenser gebruikt die vaak wordt gebruikt in structurele biologielaboratoria voor het bereiden van de vereiste monsters in 96-well platen. Het protocol beschrijft hoe de reagensmengsels worden overgebracht naar de haarvaten die nodig zijn voor nano-DSF-metingen. Daarnaast biedt dit artikel protocollen voor het meten van thermische denaturatie (monitoring van intrinsieke tryptofaanfluorescentie) en aggregatie (monitoring van lichtverstrooiing) en de daaropvolgende stappen voor gegevensoverdracht en -analyse. Ten slotte worden screeningsexperimenten met drie verschillende eiwitdoelen besproken om het gebruik van deze procedure in de context van lead discovery-campagnes te illustreren. Het algemene principe van de beschreven methode kan gemakkelijk worden overgebracht naar andere fragmentbibliotheken of worden aangepast aan andere instrumenten.

Inleiding

Programma's voor het ontdekken van geneesmiddelen beginnen vaak met het screenen van chemische verbindingen op hun vermogen om te interageren met en / of de functie van medicijndoelen, meestal eiwitten, te wijzigen. De zogenaamde "hits" die in dergelijke schermen worden gevonden, leggen de basis voor de ontdekking van nieuwe leads en ontwikkelingskandidaten, en voor de meeste nieuwe geneesmiddelen die tegenwoordig in licentie worden gegeven. De beschikbaarheid van high-throughput-methoden is daarom onmisbaar om een enorm aantal beschikbare doelen met een groot aantal verschillende verbindingen te screenen om snel hun strakke binding of hun vermogen om een specifieke functie van het doelwit te moduleren te identificeren. Nadat hits zijn geïdentificeerd, worden de meest veelbelovende hit-target combinaties in een uitgebreide pijplijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen geduwd met behulp van andere, vaak dure en tijdrovende technologieën, om "structuur-activiteitsrelaties" (SAR) te begrijpen.

Structurele biologische benaderingen, zoals die worden aangeboden door de door de EU gefinancierde toegangsprogramma's "Infrastructure for NMR, EM, and X-rays for Translational Research" (iNEXT) en de huidige opvolger iNEXT-Discovery, worden vaak gebruikt om de interacties van talrijke verbindingen in extreem detail te bestuderen en tegelijkertijd de affiniteit en farmacologische eigenschappen van de eerste hits te verbeteren door typisch verschillende rondes synthetische chemie1. Loodverbindingen die voortkomen uit deze "van hit naar lead" -campagnes worden ontwikkelingskandidaten en gaan preklinische studies in. De goed ontwikkelde moleculaire screeningsmethodologie kan grofweg worden onderverdeeld in twee benaderingen, namelijk de ligand-based lead discovery (LBLD) en fragment-based lead discovery (FBLD). In LBLD-campagnes worden eiwitreceptoren gescreend met een paar duizend met de hand geplukte liganden (op basis van de structuur van natuurlijke liganden of de structuur van het doelwit), of met vele tienduizenden verbindingen in medicijnachtige ligandbibliotheken die een groot deel van de chemische ruimte bedekken.

Meestal worden de verbindingen getest op hun remmende activiteit in een activiteitstest, meestal het monitoren van een enzymatische functie. In FBLD-campagnes2,3,4,5worden echter enkele honderden verbindingen die typisch kleiner zijn dan geneesmiddelen (100-200 Dalton) getest op hun vermogen om het doelwit rechtstreeks te binden, zonder het gebruik van een activiteitstest. Deze binding kan interfereren met de doelactiviteit en kan worden gemeten door vele biofysische methoden die direct rapporteren over het vermogen van fragmenten om aan het doelwit te binden, of door structurele methoden zoals röntgenkristallografie6 en nucleaire magnetische resonantiespectroscopie7, en meer recent, ook cryo-elektronenmicroscopie. Wanneer fragmenten zich binden op verschillende locaties die dicht bij elkaar liggen op het eiwit, kunnen de verschillende, meestal lage affiniteitsbindende fragmenten rationeel chemisch worden gecombineerd om een kleine set leads te creëren die in meer detail kunnen worden bestudeerd. Dit resulteert vaak in verbindingen met een hogere affiniteit en krachtigere verbindingen, en deze methodologie is belangrijke moleculen met klinisch potentieel gaan opleveren. De keuze voor een "ideale" fragmentenbibliotheek die chemische groepen efficiënt exploiteert, is al vele jaren een actief onderzoeksgebied8,9,10.

Terwijl de eerste nadruk lag op het bestrijken van de volledige chemische ruimte, werd de aandacht vervolgens gericht op het mogelijk maken van de stroomafwaartse chemische combinatie van fragmenthits om loodverbindingen te produceren. Dergelijk onderzoek heeft geleid tot de zogenaamde "klaargemaakte" bibliotheken. Deze bevatten fragmenten met ten minste één functionele groep die snelle, goedkope follow-up synthetische chemie mogelijk maken voor efficiënte vooruitgang bij het bestuderen van SAR. Een van de activiteiten die door iNEXT werd gekatalyseerd, was het bijwerken van de bibliotheek die is ontwikkeld door onderzoekers van het Diamond Light Source and Structural Genomics Consortium. Deze gezamenlijke inspanning resulteerde in de DSi-Poised library11,die ook is gevalideerd binnen iNEXT12. Later werd deze bibliotheek afgestemd op de beschikbaarheid van verbindingen in de REAL Database van Enamine Ltd., een chemische onderzoeksorganisatie en producent van grote collecties bouwstenen en samengestelde bibliotheken voor screening. DSi-Poised is nu beschikbaar voor iedereen voor aankoop, maar ook beschikbaar in veel iNEXT-Discovery partnerlaboratoria voor ondersteunde fragmentscreeningprojecten.

De high-end röntgenkristallografie en NMR structurele biologie technologieën hebben beide hun voor- en nadelen voor FBLD. Beide vereisen geïsoleerde doelmonsters en leveren de atomaire details met hoge resolutie op die vereist zijn voor FBLD. Kristallen zijn echter nodig voor röntgenkristallografie en de fragmenten binden zich aan holtes in de goed geordende eiwitgebieden die niet betrokken zijn bij het bouwen van het driedimensionale kristalrooster. Oplossing NMR levert vaak verschillende hits op dan röntgenkristallografie, omdat het niet wordt beïnvloed door de kristalomgeving en goed is in het detecteren van binding, ook in gedeeltelijk geordende eiwitgebieden. Hoewel op ligand gebaseerde NMR-experimenten relatief snel zijn, vereisen ze nog steeds een aanzienlijke hoeveelheid tijd en materiaal en kunnen ze routinematig alleen worden gedaan voor relatief kleine eiwitdoelen of -domeinen. Voor het prioriteren van verbindingen voor kristallografische of NMR-experimenten zijn biofysische benaderingen gebruikt13,14,15.

Omdat recente instrumentatie en computationele protocollen efficiënte kristallografische screening voor FBLD mogelijk maken door structuren te bepalen en ~ 1.000 fragmenten zeer efficiënt te analyseren, is deze prioritering minder essentieel geworden in op röntgen gebaseerde onderzoeken. Voor NMR blijft het echter wenselijk om goedkopere en snellere experimenten te gebruiken om prioriteit te geven aan bibliotheekscreening en instrumenttijd te besparen op hoogwaardige apparatuur. Tegelijkertijd kan het gebruik van een combinatie van wezenlijk verschillende technologieën onafhankelijke bevestiging bieden van bindende gebeurtenissen, of zelfs extra hits die niet worden opgepikt door alleen de kristallografie of NMR-methode te gebruiken. Kristallografische en NMR-technieken vereisen beide zeer dure apparatuur en kunnen vaak alleen worden uitgevoerd in speciale externe faciliteiten met hulp van lokale, hoogopgeleide experts. Daarnaast vraagt het goed analyseren van resultaten ook veel expertise. Hoewel programma's zoals iNEXT en iNEXT-Discovery de toegang tot dergelijke faciliteiten democratiseren16, is erkend dat goedkope, snelle en high-throughput FBLD-screening door andere methoden drugsscreeningprogramma's in een veel breder scala aan laboratoria kan aanmoedigen. Dergelijke resultaten kunnen vervolgens worden gebruikt als een indicatie om samenwerkingen met medicinale chemici op te bouwen en om de duurste screeningsexperimenten te prioriteren voor de meest veelbelovende verbindingen als NMR- en kristallografiefaciliteiten beperkingen opleggen aan het aantal verbindingen dat kan worden gescreend.

De TSA vormt een snelle, efficiënte en relatief goedkope en toegankelijke biofysische methode17 die kan worden gebruikt voor FBLD-screening. Het is gebruikt in meerdere omgevingen, van het helpen vinden van stabiele eiwitcondities voor kristallisatieproeven18, tot het vinden van verbindingen die binden aan specifieke doelen in cellen19. TSA's zijn ook gebruikt voor het meten van de dissociatieconstanten voor liganden die doeleiwitten binden, omdat ligandbinding vaak leidt tot veranderingen in de thermische stabiliteit. In alle TSA's wordt de verandering in denaturatietemperatuur van een eiwit (de stabiliteit ervan) gemeten als een functie van een langzame temperatuurstijging. Een efficiënte manier om eiwitdenaturatie bij verhitting te volgen, is door DSF of Thermofluor, die fluorescentie-doven van een hydrofobe kleurstof (meestal Sypro Orange) kwantificeert bij interactie met blootgestelde hydrofobe eiwitgebieden die zich ontvouwen als gevolg van temperatuurstijging.

Nano-DSF verwijst meestal naar het meten van de thermische stabiliteit van eiwitten in afwezigheid van externe kleurstoffen. Een van de eerste instrumenten die deze mogelijkheid bood, was de OPTIM1000 die een breed spectrum van lichtintensiteit en lichtverstrooiing van een monster meet. Deze machine maakte de gelijktijdige meting van eiwitontvouwing (meestal na tryptofaanfluorescentie) en eiwitaggregatie mogelijk (omdat gevormde nanodeeltjes resulteren in een toename van lichtverstrooiing bij ~ 400 nm). Later introduceerde de Prometheus het gebruik van backreflectie voor het meten van aggregatie en gevoelige detectie van het fluorescentiesignaal, waardoor screening van lage eiwitconcentraties met een goede gevoeligheid mogelijk werd20. In de volgende sectie wordt beschreven hoe Prometheus werd gebruikt om een fragmentscreeningprotocol te demonstreren voor het detecteren van treffers voor verschillende eiwitdoelen. Een korte introductie over de verwachte eiwitkwaliteit en -kwantiteit wordt gevolgd door een stapsgewijs protocol voor het voorbereiden, uitvoeren en analyseren van de fragmentscreeningsexperimenten. Screeningsresultaten voor drie eiwitten zijn getoond als voorbeeldgegevens die zijn verkregen als onderdeel van iNEXT-Discovery-samenwerkingen.

Protocol

OPMERKING: De eiwitten die worden gebruikt in nano-DSF-experimenten moeten zuiver (>95%) en homogeen zijn, zoals beoordeeld door natriumdodecylssulfaat-polyacrylamidegelelektroforese. Voordat het fragmentscherm wordt uitgevoerd, moet de stabiliteit van de eiwitten in verschillende bufferomstandigheden worden bepaald. Een lage ionische sterkte, lage zoutbuffer die minimaal interfereert met het eiwit moet worden gebruikt om de directe interactie met de fragmenten niet te beïnvloeden. De buffers die in dit protocol doorgaans worden gebruikt voor het controleren van de stabiliteit, worden weergegeven in aanvullende tabel S1. De concentratie van het eiwit dat voor dit experiment als stamoplossing moet worden gebruikt, is meestal 0,2 mg ml-1. Voor het screenen van de volledige DSi-Poised-bibliotheek (768 verbindingen) is een totaal van ~ 12 ml eiwit van die concentratie, een totaal van ~ 2,5 mg, nodig. De DSi-Poised-bibliotheek die in deze experimenten werd gebruikt, werd geleverd in 96-well-formaat(figuur 1). De concentratie van de fragmenten werd aangepast naar 100 mM in 20% v/v dimethylsulfoxide (DMSO). Opgemerkt moet worden dat het hier beschreven mengprotocol resulteert in lage uiteindelijke DMSO-concentraties van 0,4% v/v; hoewel het zeer onwaarschijnlijk is dat dit de stabiliteit van het eiwit beïnvloedt, moet het effect van DMSO voor elk nieuw eiwit worden gecontroleerd.

figure-protocol-1
Figuur 1: De soorten platen die voor deze experimenten worden gebruikt. (A) U-bodemplaat. (B) 96-well plaat. (C) Een close-up van de 96-putplaat met de subruimte 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Plaatvoorbereiding

  1. Haal een fragmentplaat uit de -20 °C/-80 °C vriezer en laat deze ontdooien bij kamertemperatuur, met zacht schudden op een benchtop shaker. Centrifugeer de plaat op 500 × g gedurende 30 s om eventuele druppels te verzamelen die aan de zijkant van de putten blijven plakken.
    OPMERKING: Aangezien de fragmentbibliotheek opgelost in DMSO-d6 (smeltpunt 19 °C) beschikbaar is, is het essentieel om ervoor te zorgen dat elke verbinding volledig is ontdooid en opgelost.
  2. Neem een MRC 2-well kristallisatieplaat(figuur 1A)en pipetteer 14,7 μL van de eiwitvoorraadoplossing in elke subput. Om dit op een tijdsefficiënte manier te doen, bewaart u het eiwit in een reagensreservoir(Materialentabel)en gebruikt u een meerkanaalspipet voor het doseren(Figuur 2A,B).
    OPMERKING: Voor de DSi-Poised-bibliotheek bevatten, afhankelijk van het formaat, niet alle putten van de 96-putplaat verbindingen. Meestal zijn de rijen A, H en kolommen 1, 12 gevuld met DMSO. De rijen A, H en kolommen 1, 12 mogen dus niet met eiwit worden gevuld, omdat deze putten aan het einde van de volgende stap geen fragmenten bevatten; alleen DMSO wordt daar door de robot naartoe overgebracht. Houd er rekening mee dat de lege rijen en kolommen in sommige platen verschillen.

figure-protocol-2
Figuur 2: Overzicht van de fragmentscreeningsprocedure. (A) Met behulp van een meerkanaalspipet en reagensreservoir om het eiwit af te geven. (B) Het eiwit in de 96-putplaat af geven. (C) Fragmentdosering door de dispenserrobot. D) Laden van het eiwit in de haarvaten. (E) Lade met de capillaire houder. (F) Close-up van de capillaire houder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 3: Overzicht van de apparatuur die in deze experimenten is gebruikt. (A) Nanodispenserrobot die wordt gebruikt voor het doseren van fragmenten. Plaatposities worden aangegeven. (B) Programma-interface voor het definiëren van een nieuwe plaat. (C) Interface van het doseerprogramma. (D) Het doseerprogramma dat wordt gebruikt om de fragmenten af te geven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Fragment nano-afgifte door de Mosquito-robot

  1. Controleer het type plaat waarin de fragmenten worden geleverd(Tabel met materialen).
  2. Controleer fragment- en eiwitplaatdefinities op de Mosquito.
    1. Schakel de nanodispenser in(Figuur 3A). Zorg ervoor dat er geen obstakels zijn rond de bewegende componenten.
    2. Open de grafische gebruikersinterface, klik op het tabblad Setup en controleer onder Deck Configurationof het type plaat waarin de verbindingen worden geleverd en het type waarin het eiwit is overgebracht in sectie 1 al aanwezig zijn in de lijst van de Beschikbare platen. Als dit niet het jaar is, klikt u op Opties| Platen en maak een nieuwe plaatdefinitie door de juiste waarden voor het eigenschapstype in te vullen (Figuur 3B).
      OPMERKING: Deze waarden voor de MRC 2-well plaat en de 96-well plaat die in dit experiment zijn gebruikt, zijn weergegeven in respectievelijk Supplemental Table S2 en Supplemental Table S3.
  3. Het doseerprogramma
    1. Geef op het tabblad Setup de plaatposities op onder Deck Configuration.
      OPMERKING: De Mosquito die in dit experiment wordt gebruikt, heeft twee plaatposities op het dek. Positie 1 wordt gedefinieerd als de bronplaaten positie 2 is de bestemmingsplaat.
    2. Kies in het vervolgkeuzemenu Greiner U-bodemplaat voor positie 1 en MRC 2-putplaat voor positie 2 (figuur 2C). Sla het protocol op.
  4. Fragmentuitdeling
    1. Plaats de fragmentplaat op positie 1 en de eiwitplaat op positie 2 van het dek(figuur 3A).
    2. Klik op het tabblad Protocol (Figuur 3D)op Bestand en kies het protocol dat is opgeslagen in paragraaf 2.3 voor het doseren van de fragmenten. Definieer het volume van de af te staan fragmenten; gebruik 0,3 μL. Voor een typische plaat, waarbij de kolommen 1 en 12 geen fragmenten bevatten, definieert u de beginlocatie in kolom 2 en de eindlocatie in kolom 11. Als kolom 2 of 11 leeg is, gebruikt u in sommige platen respectievelijk de kolommen 3 en 10 als begin- en eindwaarde.
      OPMERKING: Vanwege de Mosquito-opstelling kunnen alleen kolommen worden overgeslagen, geen rijen; voor de rijen zal de mug DMSO pipetteren. Zorg ervoor dat de optie Tip wijzigen is geselecteerd als Altijd, om de fragmentbibliotheek niet te besmetten.
    3. Klik op Uitvoeren om het programma te starten. Nadat het doseren, dat ~ 2 minuten duurt, is voltooid, verwijdert u het eiwit en de fragmentplaten van de robot en sluit u ze terug met een zelfklevende afdichtingsfilm. Centrifugeer kort de eiwitplaat (500 × g,30 s) om eventuele druppels die aan de zijkanten van de putten kleven te verzamelen voordat u doorgaat naar de volgende stap.

3. Meting van nano-DSF

OPMERKING: Een gedetailleerde beschrijving over het uitvoeren van TSA's met behulp van de Prometheus NT.48 is eerder gepubliceerd20. Belangrijke punten in het kader van fragmentscreening worden hier genoemd.

  1. Plaatinspectie vóór de meting
    1. Inspecteer de putten van de eiwitplaat visueel op neerslag die mogelijk is opgetreden als gevolg van de toevoeging van de fragmenten. Als neerslag in veel putten wordt waargenomen, verminder dan de concentratie van de fragmenten en herhaal het experiment.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de eiwitplaat op kamertemperatuur te houden; de fragmenten hebben de neiging om onoplosbaar te worden bij lagere temperaturen.
  2. Voorbereiding van de Prometheus
    1. Schakel het Prometheus-instrument in. Druk op het touchscreen op Lade openen om toegang te krijgen tot de capillaire laadmodule van het instrument. Verwijder de magneetstrip van de laadmodule en reinig de spiegel met ethanol om eventuele stofdeeltjes te verwijderen.
  3. Overdracht van de eiwitfragmentenplaat naar haarvaten
    OPMERKING: Deze stap omvat het overbrengen van het gemengde eiwit / fragmentmonster van elke put in de eiwitplaat naar de haarvaten voor gebruik met de Prometheus. Hiervoor, hoewel het standaard capillaire type meestal wordt gebruikt, is het mogelijk om de high sensitivity capillairen te gebruiken voor zeer lage eiwitconcentraties.
    1. Plaats de eiwitplaat en de haarvaten naast het instrument om gemakkelijk toegang te hebben tot de capillaire laadmodule.
    2. Neem een capillair, houd het aan het ene uiteinde en raak de oplossing in de eiwitplaat aan met het uiteinde van het capillair om het monster door capillaire werking over te brengen. Draag altijd handschoenen en zorg ervoor dat u het capillair in het midden niet aanraakt, omdat onzuiverheden(bijvoorbeeldstofdeeltjes) van de handschoenen de meting zouden beïnvloeden.
    3. Plaats het capillair in de aangewezen positie van de houder en zorg ervoor dat het goed is uitgelijnd en gecentreerd.
    4. Herhaal stap 3.3.2 en 3.3.3 en vul zo alle posities in de laadmodule. Laad alle haarvaten die u nodig heeft voor de meting.
      OPMERKING: Voor een enkele run kunnen maximaal 48 haarvaten worden geladen.
    5. Plaats aan het einde de magneetstrip bovenop de haarvaten om ze op hun plaats te houden en druk op Lade sluiten om het experiment te starten.
  4. Voer het nano-DSF-experiment uit
    1. Fluorescentie scan
      1. Open de Prometheus applicatie PR. ThermControlen maak een nieuw project door te klikken op Start Nieuwe sessie met de naam ProteinName_ScreenName_PlateNumber. Voer eerst een Discovery Scan uit om de fluorescentie van de monsters te detecteren.
        OPMERKING: De fluorescentieniveaus moeten idealiter hoger zijn dan 3.000 tellen voor elk monster. Monsters met fluorescentie boven de verzadigingsgrens van het instrument (20.000 tellen) worden niet gemeten.
      2. Wijzig het fluorescentiesignaal van de monsters door het excitatievermogen van de laser aan te passen(figuur 4).
    2. Thermische denaturatie
      1. Klik op het tabblad Smeltscan. Om het experiment uit te voeren, stelt u de starttemperatuur in op 20 °C, de eindtemperatuur op 95 °C en de temperatuurhelling op 1 °C min-1. Klik op Meting starten.
    3. Aantekeningen maken bij het experiment
      1. Nadat de experimenten zijn gestart, klikt u op het tabblad Annotatie en resultaten. Annoteer elk capillair door het een uniek plaat- en putnummer te geven.
        OPMERKING: Capillair 1B2 zou bijvoorbeeld overeenkomen met plaat 1 en goed B2. In dit tabblad kunnen extra kolommen worden toegevoegd voor het experiment, bijvoorbeeldeiwitnaam, buffer, eiwitconcentratie. Nadat het experiment is voltooid, worden de resultaten ook op dit tabblad weergegeven. Dit is een goed moment om aan het einde van de dag te pauzeren; de experimenten vinden 's nachts plaats, de resultaten kunnen de volgende dag worden verzameld.
    4. Gegevensvisualisatie en -export
      1. Nadat het experiment is voltooid, klikt u op het tabblad Smeltscan om de smelt- en verstrooiingscurven voor de monsters weer te geven. Als u de resultaten in een spreadsheet wilt exporteren, klikt u op het tabblad Smeltscan, klikt u op Exporterenen kiest u Verwerkte gegevens exporteren in het vervolgkeuzemenu.

figure-protocol-4
Figuur 4: Aanpassing van het excitatievermogen en het fluorescentiesignaal. (A) Bij 80% excitatievermogen ligt het fluorescentiesignaal voor de meeste monsters boven de verzadigingslimiet. (B) Het fluorescentiesignaal wordt teruggebracht tot meetbare niveaus door het excitatievermogen te verlagen tot 60%. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Iteratie

  1. Herhaal stap 1-3 om 16 runs uit te voeren op de volledige Enamine-bibliotheek van 768 verbindingen (16 × 48 = 768).
  2. Aangezien de meting van elke plaat ~ 1,5 uur duurt om te voltooien, voltooit u de annotatie (3.4.3) en bereidt u de volgende eiwitfragmentenplaat voor door de stappen in secties 1 en 2 te herhalen.
    OPMERKING: Op een typische werkdag kunnen 4-6 platen worden gemeten, afhankelijk van de ervaring. De screening van de gehele DSi-bibliotheek kan in totaal 3-4 dagen worden afgerond.

5. Data-analyse

  1. De gegenereerde gegevens onderzoeken
    1. Zodra elke run is voltooid, klikt u op het tabblad Annotaties en resultaten om de resultaten weer te geven. Richt u voor elk monster op twee berekende waarden die het belangrijkst zijn in dit overzicht: 1) De verstrooiingstemperatuur (Begin # 1 voor verstrooiing), die de temperatuur aangeeft aan het begin van verhoogde monsterverstrooiingsgebeurtenissen en kenmerkend is voor aggregatie; 2) de Tm (buigpunt #1 voor ratio)waarde geëxtraheerd uit de verhouding tussen fluorescentiegebeurtenissen bij 330 en 350 nm-waarden die typisch overeenkomen met de maximale veranderingen van tryptofaanfluorescentie bij veranderingen in zijn omgeving.
    2. Zorg ervoor dat u de verstrooiing en de smeltcurven voor elk capillair controleert op het tabblad Smeltscan om er zeker van te zijn dat deze waarden betrouwbaar zijn.
  2. Exporteren en inspecteren naar een spreadsheet
    1. Exporteer de gegevens van alle verschillende runs voor inspectie naar een spreadsheetsoftware, zoals beschreven in 3.4.4, en om overzichtstabellen en plots te maken. Klik op de verschillende spreadsheets in het spreadsheetbestand om de informatie in elk blad te noteren.
      1. Houd er op het blad Overzicht rekening mee dat elke rij overeenkomt met één experiment. Observeer langs een overzicht van parameters(bijv.,begin- en eindtemperatuur) de berekende waarden voor de Tm en het verstrooiings begin (zie 5.1 hierboven voor namen en uitleg, en aanvullende bestanden 1 en 2 voor een voorbeeld). Terwijl de software twee of meer Tm-waarden berekent (buigpunt # 1 en # 2 voor Ratio) voor sommige monsters, kijkt u naar de smeltovergangscurve om te bepalen welke van de Tm-waarden correct is.
      2. Houd er in het bladen Verhouding rekening mee dat elke kolom overeenkomt met een monster en elke rij met de gegevens die bij elke temperatuurstap worden gelezen. Observeer de fluorescentietelwaarden die overeenkomen met elke temperatuurstap en gebruik ze om de smeltcurven voor specifieke monsters uit te zetten, waarbij de temperatuurkolom wordt uitgezet tegen de fluorescentietelkolom. Merk op dat de gegevens in de Ratio (eerste afgeleide), 330 nm, 330 nm (eerste afgeleide), 350 nm, 350 nm (eerste afgeleide) worden gebruikt om de ratio en de eerste afgeleide (die een maximum heeft bij de maximale veranderingssnelheid) in een vergelijkbaar formaat te berekenen.
      3. Let op vergelijkbare gegevens voor verstrooiing in het verstrooiingsblad. Genereer de verstrooiingscurve voor elk monster door de temperatuurkolom uit te plotten tegen de verstrooiingskolom. Zoek naar het blad voor de verstrooiing eerste afgeleide.
  3. Het creëren en valideren van een globaal overzicht voor alle fragmenten
    1. Nadat u de juiste Tm-waarden voor de fragmenten hebt gecontroleerd, combineert u de kolommen Voorbeeld-ID en Buigpunt van 330/350 nm-verhouding (Tm) van alle runs in één nieuw resultaatbestand en kopieert u deze kolommen uit elke run.
    2. Gebruik de gemiddelde Tm-waarde van het inheemse eiwit (meestal berekend over tien runs) en trek deze af van de Tm-waarden van elk monster om de ΔTmte krijgen. Sorteer de resultaten over ΔTm in aflopende volgorde om de monsters te identificeren die resulteren in de grootste verschuiving.
    3. Verdeel de fragmenten in bakken afhankelijk van de ΔTm-verschuiving en genereer een frequentietabel voor de hele bibliotheek door de ΔTm voor elke bak uit te zetten tegen het aantal fragmenten (Figuur 5). Voor het gemak geeft u de as weer die het aantal fragmenten in de logboekschaal vertegenwoordigt. Gooi het monster in de prullenbak met ΔTm ±1 en pas de andere bakken aan elke run aan om het aantal uitschieters empirisch aan te passen.

Resultaten

Een volledig scherm van de DSi-Poised-bibliotheek (768 fragmenten) werd uitgevoerd op drie eiwitten van medisch belang, namelijk het buitenste kinetochore Highly Expressed in Cancer 1-eiwit (Hec1, of Ndc80), het regulerende tetraricopeptide repeat (TPR) domein van het monopolaire spindelkinase 1 (Mps1) en het SARS-CoV-2 3C-achtige protease, Nsp5, dat de C-terminus van het replicase polyproteïne op 11 locaties afsplitst. De buffercondities die voor elk eiwit zijn gekozen, evenals de eiwitconcentratie en Tm van de eiwitten, zijn weergegeven in aanvullende tabel S4.

figure-results-1
Figuur 5: Frequentieverdeling van de verschuiving in smelttemperatuur (ΔTm) voor de drie eiwitten, Hec1, Mps1 en Nsp5, in deze studie gepresenteerd als representatieve resultaten. Afkortingen: Hec1 = Sterk uitgedrukt in Kanker 1 eiwit; Mps1 = monopolair spindelkinase 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-achtige protease. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De resultaten van de drie screenings met behulp van het hierboven beschreven protocol, weergegeven als de frequentieverdeling van de verandering in Tm versus het aantal fragmenten, zijn weergegeven in figuur 5. Deze percelen zijn gegenereerd zoals beschreven in punt 5.3 van het protocol, waarbij de frequentie van de waargenomen verandering in T m wordtuitgezet. De betekenis van de verschuiving moet op een subjectieve manier worden gedefinieerd voor elk ander project, zoals beschreven in de discussiesectie hieronder. Negatieve waarden duiden op een verlaging van de smelttemperatuur in aanwezigheid van een fragment, een positieve waarde een toename in Tm. Uit dergelijke percelen is het gemakkelijk waar te nemen dat voor Nsp5 alle fragmenten een destabiliserend effect hebben, terwijl voor Hec1 en Mps1 zowel stabiliserende als destabiliserende treffers worden waargenomen. Dit is te verwachten en zal besproken worden.

Discussie

Dit protocol beschrijft een methode met een gemiddelde tot hoge doorvoer voor het screenen van fragmentbibliotheken met behulp van enkele veelgebruikte robotica en meetinstrumenten. Schermen zoals beschreven in dit protocol kunnen routinematig worden uitgevoerd door de NKI Protein Facility in Amsterdam, bijvoorbeeld als een iNEXT-Discovery-service, vaak zelfs gratis voor gebruikers na voorsteltoepassing en peer review. In dergelijke gevallen kan de DSi-Poised-bibliotheek door de faciliteit worden geleverd, maar het gebruik van andere bibliotheken kan ook worden besproken in de context van elke verschillende gebruikerstoepassing en serviceovereenkomst. De keuze van instrumenten in dit protocol vertegenwoordigt praktische oplossingen voor veel laboratoria, maar moet niet worden beschouwd als een gouden standaard. Labelvrije methoden worden aanbevolen voor het meten van de thermische stabiliteit van het doeleiwit voor fragmentscreening, in plaats van methoden die milieugevoelige labels gebruiken voor het detecteren van ontvouwen in een reverse-transcriptie polymerasekettingreactie thermocycler.

Labelvrije methoden, zoals die hier worden gepresenteerd met behulp van het Prometheus-instrument, hebben enkele voordelen: ze gebruiken lage hoeveelheden eiwit, vaak een paar ordes van grootte minder; ze kunnen worden gebruikt om tegelijkertijd de verstrooiing van het monster en dus de aggregatie te meten; en de labels die worden gebruikt voor het detecteren van ontvouwing in andere benaderingen kunnen anders interageren met elk fragment, wat resulteert in meetartefacten. Dit protocol is beschreven in het kader van de Mosquito-robot, die het pipetteren van een zeer klein volume monster (0,3 μL) mogelijk maakt dat niet handmatig kan worden gedaan. De Mosquito is een populaire robot, aanwezig in vele laboratoria die werken aan structurele biologie en projecten voor het ontdekken van geneesmiddelen; het protocol kan echter duidelijk alternatieve benaderingen gebruiken voor pipetteren met een laag volume.

Fragmentbibliotheken bevatten verbindingen die zijn opgelost in DMSO. Een van de eerste uitdagingen is het vinden van de optimale DMSO-concentratie waarbij het eiwit stabiel blijft en de verbindingen oplosbaar blijven. Dit omvat het uitvoeren van de metingen bij verschillende DMSO-concentraties om de optimale omstandigheden voor screening te bepalen. Het hier gebruikte eiwit tot fragment verdunning resulteert in DMSO-concentraties van 0,2%; de meeste eiwitten zijn redelijk stabiel in deze omstandigheden. De hoeveelheid eiwit die nodig is voor het uitvoeren van de screening voor de 768-samengestelde bibliotheek is ~ 2-3 mg in totaal, omdat de metingen meestal worden uitgevoerd bij lage eiwitconcentraties (0,2 mg ml-1). Werken met dergelijke relatief lage eiwitconcentraties verlaagt niet alleen de productiekosten van eiwitten, maar vermindert ook de kans op eiwitneerslag. De lage eiwitconcentratie heeft geen invloed op de detectie van fragmentbinding, omdat de concentratie van de fragmenten in het experiment ~ 2 mM is, waardoor ook zwakke bindmiddelen kunnen worden geïdentificeerd.

Aangezien de detectie van smeltovergangen in deze experimenten is gebaseerd op fluorescentie-intensiteit, is een cruciaal aspect het bepalen van het excitatievermogen van de laser waarmee de metingen moeten worden uitgevoerd. De interactie van de verbindingen met het eiwit kan (i) geen effect hebben op de intrinsieke fluorescentie, (ii) resulteren in doven, of (iii) de intrinsieke fluorescentie verhogen. Daarnaast betekent het werken met lage eiwitconcentraties dat het aantal fluorescenties voor het inheemse eiwit laag zou zijn. Het excitatievermogen moet daarom zo worden afgesteld dat de meeste monsters kunnen worden gemeten. Het verstrooiingsprofiel van elke run biedt belangrijke informatie over de aggregatie-effecten die kunnen worden geactiveerd door de toevoeging van een fragment. Bovendien is het effect van temperatuur op de oplosbaarheid van verbindingen ook te zien op het verstrooiingsprofiel.

Onverwacht werd voor veel verbindingen waargenomen dat de verstrooiing daadwerkelijk afnam met toenemende temperatuur (figuur 6). Het is daarom belangrijk om zowel naar de smeltovergangscurve als het bijbehorende verstrooiingsprofiel te kijken om te beslissen over de betrouwbaarheid van elk experiment, vooral voor die fragmenten die worden beschouwd als kandidaten voor meer veeleisende metingen door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie, of zelfs worden beschouwd als hits voor follow-upchemie. Een specifieke beperking van de methode voor fragmentscreeningsdoeleinden is dat veel fragmenten in de DSi-Poised-bibliotheek een significante intrinsieke fluorescentie hebben, soms zelfs boven de verzadigingslimiet van de detector, en daarom kunnen deze niet goed worden gescreend op doelbinding, zelfs niet bij een laag excitatievermogen. Een ander punt om op te merken voor deze methode is dat het alleen kan worden gebruikt met eiwitten die tryptofaanresiduen bevatten.

figure-discussion-1
Figuur 6: Effect van temperatuur op de oplosbaarheid van verbindingen. Smeltende overgangscurve en verstrooiingsprofiel van Hec1 met twee verschillende verbindingen. (A) Uit het verstrooiingsprofiel blijkt dat voor dit monster de oplosbaarheid niet wordt beïnvloed door de temperatuur. (B) Het verstrooiingsprofiel laat zien dat de oplosbaarheid van dit monster toeneemt met toenemende temperatuur. De smeltovergangscurve is in dit geval dus niet betrouwbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een open vraag is wat moet worden beschouwd als een significante verandering in Tm, niet vanuit een wiskundig perspectief, maar vanuit het praktische oogpunt: welke verandering in Tm is belangrijk om te beschouwen als indicatief voor binding van een ligand aan een eiwit? In deze voorbeelden worden verschuivingen van minder dan 1 °C gezien voor 74% van de fragmenten voor het binden van Hec1, 66% voor Mps1 en 53% voor Nsp5. 1 °C beschouwen als 'significante verandering' zou nauwelijks hits opleveren die het waard zijn om na te streven door follow-up chemie. In de overzichtsgrafieken (figuur 5) zijn bakken van 1, 2, 5 of meer dan 5 graden Tm verschuiving, positief of negatief, meegenomen. Dit vereist aanpassing per specifiek geval om een goed overzicht te geven en om geïnformeerde besluitvorming mogelijk te maken, waardoor de volgende stap wordt bepaald. Met name voor sommige eiwitten werden zowel stabilisatie als destabilisatie van het doelwit waargenomen, afhankelijk van de beschouwde fragmenten. Beide gebeurtenissen zijn interessant, omdat beide het resultaat kunnen zijn van fragmentbinding, en beide kunnen leiden tot een goed vervolgmolecuul om eiwitgedrag te manipuleren.

Een laatste vraag blijft, namelijk: "wat definieert een nuttige hit?". In feite hangt het antwoord af van de specifieke situatie. Voor Hec1 bijvoorbeeld werden alle fragmenten die het eiwit met meer dan 2 graden stabiliseren of met meer dan 5 graden destabiliseren, gecommuniceerd naar onze chemiemedewerkers, die nieuwe moleculen ontwierpen op basis van deze treffers. Voor Nsp5 werden echter de meest destabiliserende treffers gecommuniceerd naar onze NMR-medewerkers om de van nanoDSF afgeleide hits met NMR-experimenten te bevestigen. Met andere woorden, de screeningsresultaten die uit dit protocol worden verkregen, moeten met voorzichtigheid en op een contextafhankelijke manier worden geanalyseerd, waarbij weloverwogen beslissingen worden genomen op basis van de specifieke vraag en de omringende methodologie. In ieder geval is de hier beschreven methode een complementaire benadering van bestaande methodologieën zoals röntgen- en NMR-gebaseerde screening, die gericht kunnen zijn op het bevestigen, prioriteren of geven van nieuwe ideeën voor chemiecampagnes.

Aanvullende tabel S1: Lijst van buffers die worden gebruikt voor het screenen van eiwitten. Afkortingen: HEPES = 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur; DTT = dithiothreitol; MOBS = 4-(N-morfolino)butaansulfonzuur. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S2: Eigenschappen voor MRC 2-well plaat voor gebruik met nanodispenser robot. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S3: Eigenschappen voor 96-well V-bottom plaat voor gebruik met nanodispenser robot. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S4: De buffer, eiwitconcentratie en Tm van de eiwitten die in representatieve resultaten worden besproken. Afkortingen: DTT = dithiothreitol; Hec1 = Sterk uitgedrukt in Kanker 1 eiwit; Mps1 = monopolair spindelkinase 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-achtige protease. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Overzichtsparameters-voorbeeldgegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Tm en ΔTm waarden voor 406 fragmenten-voorbeeldgegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Openbaarmakingen

Er zijn geen onthullingen.

Dankbetuigingen

"Dit werk profiteerde van de toegang tot de NKI Protein Facility, een Instruct-ERIC-centrum. Financiële steun is verleend door iNEXT, projectnummer 653706, en iNEXT-Discovery, projectnummer 871037, gefinancierd door het Horizon 2020-programma van de Europese Commissie".

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ClearVue SheetsMolecular Dimensionsadhesive sealing film voor eiwitplaat
CORNING 6570 Aluminium Sealing TapeCORNINGadhesive sealing film voor fragmentplaat
DSi poised libraryEnamineFragmentbibliotheek met 768 verbindingen gebruikt in deze studie
Elisa Reagent ReserviorThermoFisher Scientific15075Reagensreservoir gebruikt voor het pipetteren van het eiwit
Greiner ronde (U) bodemplatenCat. Nr. 650201Fragmenten geleverd in deze platen
Mosquito type X1sptlabtechArtikelnr- 3019-0003Nanoliter dispenser
MRC 2-well kristallisatieplaatMRC96T-PS
Pierce ELISA Reagent ReservoirsPierce
Prometheus High Sensitivity capillairenCatalogus PR-C006
Prometheus NT.48 nanoDSFNanotemperCatalogusnr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalogusnr PR-AGO)nanoDSF en licht terugverstrooiing
Prometheus Standard capillair typeCatalogus PR-C002
TX-1000ThermoscientificCentrifuge voor platen

Referenties

  1. Hoffer, L., Muller, C., Roche, P., Morelli, X. Chemistry-driven hit-to-lead optimization guided by structure-based approaches. Molecular Informatics. 37 (9-10), 1800059(2018).
  2. Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
  3. Ress, D. C., Congreve, M., Murray, C. W., Carr, R. Fragment-based lead discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 660-672 (2004).
  4. Carr, R. A. E., Congreve, M., Murray, C. W., Rees, D. C. Fragment-based lead discovery: Leads by design. Drug Discovery Today. 10 (14), 987-992 (2005).
  5. Bradley, A. R., et al. The SGC beyond structural genomics: Redefining the role of 3D structures by coupling genomic stratification with fragment-based discovery. Essays in Biochemistry. 61 (5), 495-503 (2017).
  6. Davies, T. G., Tickle, I. J. Fragment screening using X-ray crystallography. Topics in Current Chemistry. 317, 33-59 (2012).
  7. Ma, R., Wang, P., Wu, J., Ruan, K. Process of fragment-based lead discovery - A perspective from NMR. Molecules. 21 (7), 854(2016).
  8. Troelsen, N. S., Clausen, M. H. Library design strategies to accelerate fragment-based drug discovery. Chemistry. 26 (50), 11391-11403 (2020).
  9. Shi, Y., von Itzstein, M. How size matters: Diversity for fragment library design. Molecules. 24 (15), 2838(2019).
  10. Taylor, A., Doak, B. C., Scanlon, M. J. Design of a fragment-screening library. Methods in Enzymology. 610, 97-115 (2018).
  11. Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).
  12. Sreeramulu, S., et al. NMR quality control of fragment libraries for screening. Journal of Biomolecular NMR. 74 (10-11), 555-563 (2020).
  13. Pfaff, S. J., Chimenti, M. S., Kelly, M. J. S., Arkin, M. R. Biophysical methods for identifying fragment-based inhibitors of protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1278, 587-613 (2015).
  14. Fattori, D., Squarcia, A., Bartoli, S. Fragment-based approach to drug lead discovery: Overview and advances in various techniques. Drugs in R & D. 9 (4), 217-227 (2008).
  15. Winter, A., et al. Biophysical and computational fragment-based approaches to targeting protein-protein interactions: Applications in structure-guided drug discovery. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (4), 383-426 (2012).
  16. Boelens, R., et al. iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  17. Zhang, R., Monsma, F. Fluorescence-based thermal shift assays. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 13 (4), 389-402 (2010).
  18. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).
  19. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  20. Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. How to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the Virus-X Project. Journal of Visualized Experiments JoVE. (144), e58666(2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Thermal Shift Assayfragment screeningeiwitstabiliteitligandbindingsmelttemperatuurcapillaire beladingeiwitdenaturatiefragmentbibliotheek

Gerelateerde artikelen