Dit artikel presenteert een partieel heterotopisch osteomyocutaan flaptransplantatieprotocol bij ratten en de mogelijke uitkomsten ervan in de follow-up op middellange termijn.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Partieel heterotopisch hindlimbtransplantatiemodel bij ratten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gevasculariseerde composiet allotransplantaties (VCA) vormen de meest geavanceerde reconstructieoptie voor patiënten zonder autologe chirurgische mogelijkheden na een complex weefseldefect. Gezichts- en handtransplantaties hebben het leven van misvormde patiënten veranderd, waardoor ze een nieuw esthetisch en functioneel sociaal orgaan hebben. Ondanks veelbelovende resultaten presteert VCA nog steeds ondermaats als gevolg van levenslange immunosuppressiecomorbiditeiten en infectieuze complicaties. De rat is een ideaal diermodel voor in vivo studies naar immunologische routes en afstotingsmechanismen van transplantaten. Ratten worden ook veel gebruikt in nieuwe conserveringstechnieken voor samengesteld weefseltransplantaten, waaronder perfusie- en cryopreservatiestudies. Modellen die worden gebruikt voor VCA bij ratten moeten reproduceerbaar, betrouwbaar en efficiënt zijn met een lage postoperatieve morbiditeit en mortaliteit. Heterotope ledemaattransplantatieprocedures voldoen aan deze criteria en zijn gemakkelijker uit te voeren dan orthotopische ledemaattransplantaties. Het beheersen van microchirurgische modellen van knaagdieren vereist solide ervaring in microchirurgie en dierverzorging. Hierin wordt een betrouwbaar en reproduceerbaar model van partiële heterotope osteomyocutane flaptransplantatie bij ratten, de postoperatieve uitkomsten en de middelen om mogelijke complicaties te voorkomen gerapporteerd.
Inleiding
In de afgelopen twee decennia is VCA geëvolueerd als een revolutionaire behandeling voor patiënten die lijden aan ernstige misvorming, waaronder gezicht1,amputaties van de bovenste ledematen2,penis3en andere complexe weefseldefecten4,5. De gevolgen van levenslange immunosuppressie belemmeren echter nog steeds een bredere toepassing van deze complexe reconstructieve operaties. Fundamenteel onderzoek is cruciaal om anti-afwijzingsstrategieën te verbeteren. Het verhogen van de VCA-conserveringstijd is ook essentieel om de transplantatielogistiek te verbeteren en de donorpool te vergroten (omdat VCA-donoren aan meer criteria moeten voldoen dan solide orgaandonoren, waaronder huidskleur, anatomische grootte, geslacht). In deze context worden transplantaties van ledematen van ratten veel gebruikt in studies naar de immuunafstoting van allografts6,7,nieuwe tolerantie-inductieprotocollen8en conserveringsstudies9,10,11. Daarom zijn deze VCA-modellen een belangrijk element om te beheersen voor VCA translationeel onderzoek.
Osteomyocutane flappen zijn in de literatuur beschreven als betrouwbare modellen om VCA te bestuderen bij ratten8,12,13,14. Hoewel orthotopische transplantaties van alle ledematen langdurige evaluatie van de transplantaatfunctie mogelijk maken, is het een tijdrovende procedure die gepaard gaat met hogere postoperatieve morbiditeit en mortaliteitscijfers14. Heterotope ledemaattransplantatiemodellen zijn daarentegen niet-functioneel, maar maken reproduceerbare studies op VCA mogelijk. Postoperatieve uitkomsten kunnen betrouwbaar worden verwacht vóór de start van een VCA-transplantatiestudie bij ratten. Deze studie rapporteert een partieel heterotopisch osteomyocutaan flaptransplantatiemodel bij de rat met frequente mogelijke uitkomsten en complicaties die intraoperatief en postoperatief kunnen optreden tijdens een follow-upperiode van drie weken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dieren kregen humane zorg in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. De Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-protocol 2017N000184) en Animal Care and Use Review Office (ACURO) hebben alle dierprotocollen goedgekeurd. Inteelt mannelijke Lewisratten (250-400 g) werden gebruikt voor alle experimenten.
1. Chirurgie
- Verdoof de Lewis-ratten met behulp van isofluraaninhalatie. Induceer anesthesie met 5% isofluraan in de inductiekamer en handhaaf anesthesie met 1,5-3% isofluraaninhalatie via een ademhalingskegel.
- Breng oogsmeermiddel aan vóór de operatie bij overlevingsprocedures. Scheer de operatieplaats, behandel met ontharingscrème, scrub en drapeer met steriele gordijnen.
- Bevestig de totale anesthesie met een teenknijptest vóór de incisie en regelmatig tijdens de procedure. Controleer de hart- en ademhalingsfrequenties gedurende de hele procedure. Voor alle operaties, onderhoud steriele omstandigheden door steriele instrumenten, benodigdheden, gordijnen en handschoenen te gebruiken. Zie de tabel met materialen voor de lijst van instrumenten die voor de procedures worden gebruikt.
2. Donorrecht gedeeltelijke achterverkwerving
- Maak een omtrekkende incisie van de huid boven de enkel bij het distale derde deel van het been.
- Skeletoniseer en cauteriseer de sapheneuze slagader en de terminale tak van de popliteale slagader met behulp van een bipolaire tang. Cauteriseer en snijd de gastrocnemius, soleus, tibialis anterior en biceps femoris spieren af totdat het tibiale bot is blootgesteld.
- Maak een incisie van 2,5 cm in de rechter liesplooi. Ontleed het inguinale vetkussen en trek het distaal in om de femorale vaten bloot te leggen. Gebruik een fishhook retractor om het liesband vast te pakken en de tang vast te klemmen om het inguinale vetkussen distisch vast te houden.
OPMERKING: Het inguinale vetkussen is opgenomen in de oogst van de gedeeltelijke ledemaat. - Ontleed de femorale vaten, individualiseer Murphy-takken (diepe gespierde collaterale takken bevinden zich meestal halverwege tussen het inguinale ligament en de epigastrische tak) en ligaat met 8-0 nylon banden.
- Hepariniseer de donorrat met 100 IE/kg heparine, geïnjecteerd in de dorsale ader van de penis met behulp van een naald van 27,5 G.
- Voltooi de huidincisie rond de heup.
- Cauterize de biceps femoris en gluteus superficialis spieren met behulp van bipolaire tang. Cauteriseer en snijd de heupzenuw op de middelste dijbeenlengte. Stel het dijbeen proximaal bloot ter hoogte van de achterste femurkam.
OPMERKING: Adductor- en quadricepsspieren worden buiten de verkrijging gelaten. De innominate pedikel is bewaard gebleven. - Ligaat femorale vaten met 8/0 nylon banden ter hoogte van het inguinale ligament. Voer een arteriotomie uit op de dijbeenslagader net onder de ligatuur en verwijd om het inbrengen van een 24 G angiokatheter mogelijk te maken.
- Cauteriseer en snijd de resterende spier onder de pedikel, waardoor de voorste kant van het dijbeen wordt blootgelegd.
- Snijd het scheenbeen en het dijbeen met behulp van een botsnijder zo proximaal en distisch mogelijk ( halverwege de lengte).
- Spoel de gedeeltelijke achterpoot met 2 ml heparine zoutoplossing (100 IE/ml) om een duidelijke veneuze uitstroom te verkrijgen. Bewaren op ijs in een steriel gaas tot microvasculaire overdracht(figuur 1).
- Terwijl het dier onder algemene anesthesie is, voert u euthanasie uit door exsanguinatie totdat het dier geen teken van leven vertoont (geen ademhalingsbeweging en geen hartslag).
Figuur 1: Rat gedeeltelijk achterpoot geoogst. Een 24 G angiocath wordt ingebracht in de femorale slagader, klaar voor heterotope microvasculaire overdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Recipiente operatie
- Scheer vóór de incisie de achterkant van de nek en dien buprenorfine 0,01-0,05 mg/kg subcutaan toe. Plaats de rat in rugligging op een verwarmingskussen.
- Maak een incisie van 2,5 cm in de rechter liesplooi. Ontleed het inguinale vetkussen en leun het distaal om de femorale vaten bloot te leggen. Gebruik een haak om het liesband in te trekken en klemtang om het inguinale vetkussen distisch vast te houden.
- Ontleed de femorale vaten, individualiseer de Murphy-takken en ligaat met 8/0 nylon banden.
- Ligate beide vaten boven de epigastrische vaten met behulp van 8/0 nylon banden. Plaats approximatorklemmen proximaal en verwijd de uiteinden van het vat; spoelen met heparine zoutoplossing.
- Maak een incisie op de linkerflank boven de heup en maak een onderhuidse pocket met een onderhuidse tunnel naar de liesplooi.
OPMERKING: De inzetincisie wordt gemaakt boven het bewegingsbereik van de heup om ervoor te zorgen dat het dier een normale achterbeweging behoudt. Bovendien zorgt het houden van een huidbrug tussen de transplantaatinzet en de microvasculaire transferplaats voor een betere fixatie van het transplantaat(figuur 2). - Plaats het proximale deel van de gedeeltelijke ledemaat en het inguinale vetkussen door de onderhuidse tunnel voor microvasculaire overdracht. Voer veneuze en arteriële anastomosen uit met behulp van 10/0 nylon hechtingen. Verwijder beide approximatorklemmen en observeer revascularisatie van de ledemaat. Voer een "melktest" uit op beide vaten om de doorgankelijkheid van elke anastomose te beoordelen.
OPMERKING: Acht tot negen hechtingen zijn meestal nodig voor veneuze anastomose, gemiddeld 6 hechtingen voor arteriële anastomose. - Maak een longitudinale huidincisie aan de mediale kant van de getransplanteerde ledemaat en breng het transplantaat in. Verwijder overtollige huid van het transplantaat en sluit de wond met afzonderlijke hechtingen en een lopende hechting met absorbeerbare 4/0 hechtingen.
- Hecht de inguinale vetkussens van de getransplanteerde ledemaat en de ontvanger aan elkaar met behulp van twee afzonderlijke absorbeerbare hechtingen en sluit de inguinale plooi helemaal aan het einde na een laatste controle van de microvasculaire anastomosen.
OPMERKING: Inguinale vetkussens worden stevig gehecht om een beschermende laag vet boven de anastomosen toe te voegen en zorgen voor een veilige positie van het transplantaat en de pedikel. Een zorgvuldige sluiting is beter voor wondgenezing; het voorkomt ook resterende bloedingen uit de wond en vermindert het risico op zelfverminking. - Compenseer vochtverlies subcutaan met 1-3 ml zoutoplossing volgens de hoeveelheid perioperatieve bloedingen.
- Plaats een Elizabethaanse kraag om de nek van het dier en breng 2 losse hechtingen aan op de huid om deze in de juiste positie te houden.
- Stop de inademing van isofluraan en controleer het dier continu op een opwarmpad totdat het volledig bij bewustzijn en ambulant is.
Figuur 2: Perioperatief beeld vóór aanvang van de osteomyocutane ledemaat. Een huidbrug van ongeveer 1 cm blijft bewaard tussen de inguinale plooiincisie en de inzet van het transplantaat boven de heup. Het transplantaat wordt onder de brug geplaatst, waarbij het stabiel blijft voor microvasculaire overdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Postoperatieve zorg
- Controleer het dier tweemaal daags gedurende 72 uur, vervolgens eenmaal daags tot postoperatieve dag (POD) 7 en vervolgens twee keer per week.
OPMERKING: De controle moet worden aangepast aan de toestand van het dier en het transplantaat (bleke ogen kunnen aanvullende vloeistoffen vereisen, porfyrinekleuring als indicator van dierlijke pijn, abnormale transplantaatkleur / temperatuur) en verdere zorg moet met de dierenarts worden besproken. Gedurende de gehele onderzoeksperiode is een enkele huisvesting vereist voor de ontvangende ratten om schade aan het transplantaat te voorkomen. - Voer analgesie uit met subcutane injectie van buprenorfine en / of niet-steroïde anti-inflammatoir geneesmiddel volgens de IACUC-richtlijnen.
- Evalueer het transplantaat en voer dagelijks lichamelijk onderzoek uit met foto's met hetzelfde apparaat.
OPMERKING: Het gebruik van ontharingscrème op de huid van het transplantaat is nuttig om de huidskleur van de transplantatie beter te beoordelen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In deze single-operator studie werden 30 syngenegene heterotope partiële ledemaattransplantaties uitgevoerd. Succes werd op postoperatieve dag 21 gedefinieerd als de afwezigheid van VCA-falen of complicaties die euthanasie vereisen. De normale evolutie van het transplantaat is weergegeven in figuur 3. De gemiddelde duur voor gedeeltelijke ledemaatverwerving en transplantaatinstel bij de ontvanger was respectievelijk 35 en 105 min; de gemiddelde ischemietijd was 105 min. Tijdens de follow-up ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Orthotopische ledemaattransplantatiemodellen bij knaagdieren zijn beschreven in de literatuur15,16,17; ze vereisen echter een zenuwherstel, spierherbevestiging en een perfecte osteosynthese van het dijbeen, wat een zeer moeilijke stap kan zijn. Deze modellen zijn ook geassocieerd met een hogere morbiditeit en mortaliteit bij knaagdieren14, vooral in de follow-up op korte termijn, omdat het herstel van een...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen onthullingen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het Bureau van de Assistent-minister van Defensie voor Gezondheidszaken via het Congressionally Directed Medical Research Program onder Award No. W81XWH-17-1-0680. Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteurs en worden niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het ministerie van Defensie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 24 GA angiocatheter | BD Insyte Autoguard | 381412 | |
| 4-0 suture Black monofilament non absorbable suture | Ethicon | 1667 | Wordt gebruikt om de E-kraag aan de achterkant van de nek te hechten |
| 4-0 suture Coated Vicryl Plus Antibacterial | Ethicon | VCP496 | |
| Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform | ASSI | ASSI.ATK26426 | |
| Bipolar cords | ASSI | 228000C | |
| Black Polyamide Monofilament USP 10-0, 4 mm 3/8c | AROSurgical | T04A10N07-13 | Wordt gebruikt om de microvasculaire anastomosen uit te voeren |
| Buprenorphine HCl | Pharmaceutical, Inc | 42023-179-01 | |
| Dilating Forceps | Fine science tools (FST) | 18131-12 | |
| Dissecting Scissors 15 cm, Round Handle 8 mm diameter, Straight Slender Tapered Blade 7 mm, Lipshultz Pattern | ASSI | ASSI.SAS15RVL | |
| Double Micro Clamps 5.5 x 1.5 mm | Fine science tools (FST) | 18040-22 | |
| Elizabethan collar | Braintree Scientific | EC-R1 | |
| Forceps 13.5 cm long, Flat Handle, 9 mm wide Straight Tips 0.1 mm diameter (x2) | ASSI | ASSI.JFL31 | |
| Halsey Micro Needle Holder | Fine science tools (FST) | 12500-12 | |
| Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL | BD PosiFlush | 306424 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-704-06 | |
| Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter | ASSI | ASSI.BPNS11223 | |
| Lone Star Elastic Stays | CooperSurgical | 3314-8G | Wordt gebruikt om het inguinale ligament terug te trekken voor dissectie van de femorale vaten |
| Lone Star Self-Retaining Retractors | CooperSurgical | 3301G | |
| Micro-Mosquito Hemostats | Fine science tools (FST) | 13010-12 | Wordt gebruikt om het inguinale vetkussen distaal terug te trekken |
| Needle Holder, 15 cm Round Handle, 8 mm diameter, Superfine Curved Jaw 0.2 mm tip diameter, without lock | ASSI | ASSI.B1582 | |
| Nylon Suture Black Monolfilament 8-0, 6.5 mm 3/8c | Ethilon | 2808G | Wordt gebruikt om collaterale takken op de femorale vaten te ligatureren |
| Offset Bone Nippers | Fine science tools (FST) | 16101-10 | |
| S&T Vascular Clamps 5.5 x 1.5 mm | Fine science tools (FST) | 00398-02 | |
| Walton scissors | Fine science tools (FST) | 14077-09 |
Referenties
- Lanteiri, L., et al. Feasibility, reproducibility, risks and benefits of face transplantation: a prospective study of outcomes. American Journal of Transplantation. 11 (2), 367-378 (2011).
- Park, S. H., Eun, S. C., Kwon, S. T. Hand transplantation: current status and immunologic obstacles. Experimental and Clinical Transplantation. 17 (1), 97-104 (2019).
- Cetrulo, C. L., et al. Penis transplantation: first US experience. Annals of Surgery. 267 (5), 983-988 (2018).
- Grajek, M., et al. First complex allotransplantation of neck organs: larynx, trachea, pharynx, esophagus, thyroid, parathyroid glands, and anterior cervical wall: a case report. Annals of Surgery. 266 (2), 19-24 (2017).
- Pribaz, J. J., Caterson, E. J. Evolution and limitations of conventional autologous reconstruction of the head and neck. Journal of Craniofacial Surgery. 24 (1), 99-107 (2013).
- Lipson, R. A., et al. Vascularized limb transplantation in the rat. I. Results with syngeneic grafts. Transplantation. 35 (4), 293-299 (1983).
- Lipson, R. A., et al. Vascularized limb transplantation in the rat. II. Results with allogeneic grafts. Transplantation. 35 (4), 300-304 (1983).
- Adamson, L. A., et al. A modified model of hindlimb osteomyocutaneous flap for the study of tolerance to composite tissue allografts. Microsurgery. 27 (7), 630-636 (2007).
- Arav, A., Friedman, O., Natan, Y., Gur, E., Shani, N. Rat hindlimb cryopreservation and transplantation: a step toward "organ banking". American Journal of Transplantation. 17 (11), 2820-2828 (2017).
- Gok, E., et al. Development of an ex-situ limb perfusion system for a rodent model. ASAIO Journal. 65 (2), 167-172 (2019).
- Gok, E., Rojas-Pena, A., Bartlett, R. H., Ozer, K. Rodent skeletal muscle metabolomic changes associated with static cold storage. Transplantation Proceedings. 51 (3), 979-986 (2019).
- Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).
- Fleissig, Y., et al. Modified heterotopic hindlimb osteomyocutaneous flap model in the rat for translational vascularized composite allotransplantation research. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59458(2019).
- Ulusal, A. E., Ulusal, B. G., Hung, L. M., Wei, F. C. Heterotopic hindlimb allotransplantation in rats: an alternative model for immunological research in composite-tissue allotransplantation. Microsurgery. 25 (5), 410-414 (2005).
- Jang, Y., Park, Y. E., Yun, C. W., Kim, D. H., Chung, H. The vest-collar as a rodent collar to prevent licking and scratching during experiments. Lab Anim. 50 (4), 296-304 (2016).
- Kern, B., et al. A novel rodent orthotopic forelimb transplantation model that allows for reliable assessment of functional recovery resulting from nerve regeneration. American Journal of Transplantation. 17 (3), 622-634 (2017).
- Perez-Abadia, G., et al. Low-dose immunosuppression in a rat hind-limb transplantation model. Transplant International. 16 (12), 835-842 (2003).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (41), e2022(2010).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 2050312120968721(2020).
- Lindboe, C. F., Presthus, J. Effects of denervation, immobilization and cachexia on fibre size in the anterior tibial muscle of the rat. Acta Neuropathologica. 66 (1), 42-51 (1985).
- Nazzal, J. A., Johnson, T. S., Gordon, C. R., Randolph, M. A., Lee, W. P. Heterotopic limb allotransplantation model to study skin rejection in the rat. Microsurgery. 24 (6), 448-453 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
