Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie van organoïden in de menselijke hersenen voor mitochondriale ziektemodellering

6.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62756

⸱

21 juni 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Pediatrics, Neonatology and Pediatric Cardiology, Duesseldorf University Hospital, Medical Faculty, Heinrich Heine University, 2Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University, 3Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC), 4Seaver Autism Center for Research and Treatment, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC)

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik bij het modelleren van mitochondriale ziekten.

Samenvatting

Mitochondriale ziekten vertegenwoordigen de grootste klasse van aangeboren fouten van het metabolisme en zijn momenteel ongeneeslijk. Deze ziekten veroorzaken neurologische ontwikkelingsdefecten waarvan de onderliggende mechanismen nog moeten worden opgehelderd. Een belangrijke wegversperring is het gebrek aan effectieve modellen die de neuronale stoornis met vroege aanvang bij de patiënten samenvatten. Vooruitgang in de technologie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) maakt het mogelijk om driedimensionale (3D) hersenorganoïden te genereren die kunnen worden gebruikt om de impact van ziekten op de ontwikkeling en organisatie van het zenuwstelsel te onderzoeken. Onderzoekers, waaronder deze auteurs, hebben onlangs menselijke hersenorganoïden geïntroduceerd om mitochondriale aandoeningen te modelleren. Dit artikel rapporteert een gedetailleerd protocol voor de robuuste generatie van menselijke iPSC-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik in mitochondriale bio-energetische profilering en beeldvormingsanalyses. Deze experimenten zullen het gebruik van hersenorganoïden mogelijk maken om metabole en ontwikkelingsstoornissen te onderzoeken en kunnen cruciale informatie opleveren om de neuronale pathologie van mitochondriale ziekten te ontleden.

Inleiding

Mitochondriale ziekten vertegenwoordigen de grootste klasse van aangeboren fouten van het metabolisme1. Ze worden veroorzaakt door genetische mutaties die verschillende mitochondriale processen verstoren, waaronder oxidatieve fosforylering (OXPHOS)2, ademhalingsketenassemblage, mitochondriale dynamica en mitochondriale DNA-transcriptie of -replicatie3. Weefsels met energiebehoeften worden in het bijzonder beïnvloed door mitochondriale disfunctie4. Dienovereenkomstig ontwikkelen patiënten met mitochondriale ziekten meestal neurologische manifestaties met vroege aanvang.

Er zijn momenteel geen behandelingen beschikbaar voor kinderen met mitochondriale ziekten5. Een belangrijke belemmering voor de ontwikkeling van mitochondriale ziekten door geneesmiddelen is het gebrek aan effectieve modellen die het verloop van de menselijke ziekte samenvatten6. Verschillende van de momenteel bestudeerde diermodellen vertonen niet de neurologische defecten die bij de patiënten aanwezig zijn7. Vandaar dat de mechanismen die ten grondslag liggen aan de neuronale pathologie van mitochondriale ziekten nog steeds niet volledig worden begrepen.

Recente studies genereerden iPSC's van patiënten met mitochondriale ziekten en gebruikten deze cellen om patiëntspecifieke neuronale cellen te verkrijgen. Genetische defecten geassocieerd met de mitochondriale ziekte, het syndroom van Leigh, blijken bijvoorbeeld afwijkingen te veroorzaken in cellulaire bio-energetica8,9, eiwitsynthese10 en calciumhomeostase9,11. Deze rapporten gaven belangrijke mechanistische aanwijzingen over de neuronale stoornis die optreedt bij mitochondriale ziekten, waardoor de weg werd vrijgemaakt voor de ontdekking van geneesmiddelen voor deze ongeneeslijke ziekten12.

Tweedimensionale (2D) culturen maken het echter niet mogelijk om de architecturale complexiteit en regionale organisatie van 3D-organen te onderzoeken13. Hiertoe kan het gebruik van 3D-hersenorganoïden afgeleid van patiëntspecifieke iPSCs14 onderzoekers in staat stellen aanvullende belangrijke informatie te verkrijgen en daardoor te helpen ontleden hoe mitochondriale ziekten de ontwikkeling en functie van het zenuwstelsel beïnvloeden15. Studies met iPSC-afgeleide hersenorganoïden om mitochondriale ziekten te onderzoeken, beginnen de neurologische ontwikkelingscomponenten van mitochondriale ziekten te ontdekken.

Ruggenmergorganoïden met mutaties geassocieerd met de mitochondriale ziekte, mitochondriale encefalopathie, lactaatacidose en beroerte-achtige episodes syndroom (MELAS), vertoonden defecte neurogenese en vertraagde differentiatie van motorneuronen16. Corticale organoïden afgeleid van patiënten met de mitochondriale ziekte, Leigh-syndroom, vertoonden verminderde omvang, defecten in neurale epitheliale knopgeneratie en verlies van corticale architectuur17. Hersenorganoïden van patiënten met het Leigh-syndroom toonden aan dat de ziektedefecten initiëren op het niveau van neurale voorlopercellen, die zich niet kunnen binden aan mitochondriaal metabolisme, waardoor afwijkende neuronale vertakkingen en morfogenese18 ontstaan. Neurale voorlopers kunnen dus een cellulair therapeutisch doelwit vormen voor mitochondriale ziekten, en strategieën die hun mitochondriale functie bevorderen, kunnen de functionele ontwikkeling van het zenuwstelsel ondersteunen.

Het gebruik van hersenorganoïden kan helpen bij het blootleggen van de neurologische ontwikkelingscomponenten van mitochondriale ziekten. Mitochondriale ziekten worden voornamelijk beschouwd als neurodegeneratie met vroege aanvang5. Neurologische ontwikkelingsstoornissen zijn echter ook aanwezig bij patiënten die worden getroffen door mitochondriale ziekten, waaronder ontwikkelingsachterstand en cognitieve stoornissen19. Patiëntspecifieke hersenorganoïden kunnen helpen deze aspecten aan te pakken en op te helderen hoe mitochondriale ziekten de ontwikkeling van de menselijke hersenen kunnen beïnvloeden. Mitochondriale disfunctie kan ook een pathogenetische rol spelen bij andere, meer voorkomende neurologische ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington4. Vandaar dat het ophelderen van de impact van mitochondriale defecten in de neurologische ontwikkeling met behulp van hersenorganoïden ook instrumenteel kan zijn voor de studie van die ziekten. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren van reproduceerbare hersenorganoïden die kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van ziektemodellering van mitochondriale ziekten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Voor het gebruik van menselijke iPSC's kan een ethische goedkeuring vereist zijn. iPSC's die in deze studie werden gebruikt, werden afgeleid van gezonde controlepersonen na lokale ethische goedkeuring (# 2019-681). Alle celkweekprocedures moeten worden uitgevoerd onder een steriele celkweekkap, waarbij alle reagentia en verbruiksartikelen zorgvuldig worden gedesinfecteerd voordat ze onder de motorkap worden overgebracht. Menselijke iPSC's die voor differentiatie worden gebruikt, moeten een passagegetal hebben van minder dan 50 om mogelijke genomische afwijkingen te voorkomen die kunnen optreden bij uitgebreide kweek. De pluripotente toestand van de cellen moet vóór organoïdegeneratie worden gevalideerd, bijvoorbeeld door de expressie van pluripotentie-geassocieerde markers zoals NANOG of OCT4 te monitoren. Mycoplasma-tests moeten wekelijks worden uitgevoerd om mycoplasmavrije culturen te garanderen.

1. Generatie van hersenorganoïden

  1. Cultuur van menselijke iPSC's
    1. Kweek menselijke iPSC's onder feedervrije omstandigheden in iPSC-medium (zie de tabel met materialen) op gecoate 6-putplaten en bewaar ze in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
      OPMERKING: De overdracht van feedercellen kan de organoïde differentiatie belemmeren. Passeer de cellen minstens één keer in feedervrije omstandigheden.
    2. Passeer de iPSC's bij 80% confluentie met behulp van enzymvrij loslatingsmedium in verhoudingen variërend van 1: 4 tot 1: 12. Om de celoverleving te verhogen, voegt u na elke splitsing 10 μM Rho-associated protein kinase (ROCK)-remmer (Y27632) toe.
  2. Dissociëer de iPSC's (80% confluency)-Dag 0.
    1. Bereid corticale differentiatie medium I (CDMI) voor (tabel 1). Verwarm CDMI medium voor bij kamertemperatuur (22-25 °C) voordat u het aan de cellen toevoegt.
    2. Was de putjes met de iPSC's met fosfaatbuffered saline (PBS) om dode cellen en puin te verwijderen.
    3. Voeg 500 μL voorgewarmd reagens A (materiaaltabel) toe aan elke put en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Controleer onder de microscoop om celloslating te garanderen.
    4. Voeg 1 ml iPSC-medium toe aan het verdunningsmiddel A om de activiteit ervan te neutraliseren.
    5. Gebruik een pipet van 1000 μL om de cellen te dissociëren door op en neer te pipetteren en breng de celsuspensie over naar een centrifugebuis van 15 ml.
    6. Centrifugeer de iPSC's voorzichtig bij 125 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (22-25 °C).
    7. Zuig het supernatant voorzichtig op om te voorkomen dat de celkorrel wordt verstoord.
    8. Resuspend de pellet met 1 ml CDMI om een eencellige suspensie te verkrijgen en tel het celnummer.
    9. Bereid het zaaimedium voor met 9.000 iPSC's per 100 μL in CDMI aangevuld met 20 μM ROCK-remmer, 3 μM WNT-catenineremmer (IWR1) en 5 μM SB431542.
    10. Voeg 100 μL zaaimedium per put toe aan een 96-well v-bottom plaat.
    11. Bewaar de plaat in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
  3. Neurosfeer generatie
    1. Merk op dag 1 op dat ronde celaggregaten (neurosferen) met gedefinieerde gladde randen zich vormen. Let op de dode cellen rond de aggregaten. Blijf in de couveuse kweken bij 37 °C en 5% CO2.
    2. Op dag 3 roer je de plaat door drie keer op de zijkanten te tikken om dode cellen los te maken.
    3. Voeg 100 μL CDMI aangevuld met 20 μM ROCK-remmer, 3 μM IWR1 en 5 μM SB431542 toe aan elke put.
    4. Breng de plaat terug naar de couveuse bij 37 °C en 5% CO2.
    5. Verwijder op dag 6 voorzichtig 80 μL van het supernatant medium uit elke put. Vermijd het aanraken van de bodem van de put.
    6. Voeg 100 μL CDMI aangevuld met 3 μM IWR1 en 5 μM SB431542 toe aan elke put. Breng de plaat terug naar de couveuse bij 37 °C en 5% CO2.
    7. Herhaal stap 5 en 6 elke 3 dagen tot dag 18.
  4. Overdracht van neurosferen
    1. Bereid op dag 18 Cortical Differentiation Medium II (CDMII) (tabel 1) voor en voeg 10 ml toe aan een celkweekplaat van 100 mm met ultralaage aanhechting.
    2. Gebruik een pipet van 200 μL met de punt afgesneden om de ronde neurosferen van de 96-well plaat over te brengen naar de 100 mm ultra-low attachment celkweekplaat.
      OPMERKING: Wees voorzichtig om te voorkomen dat de neurosferen worden beschadigd door ervoor te zorgen dat de opening van de punt breed genoeg is en dat de aggregaten niet te snel worden aangezogen.
    3. Verwijder 5 ml medium uit de plaat met de neurosferen en voeg 5 ml verse CDMII toe.
      OPMERKING: Deze procedure helpt om de hoeveelheid CDMI-medium te verminderen die mogelijk is overgedragen van de overdracht van neurosferen.
    4. Plaats de plaat op een orbitale shaker bij 70 tpm in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
      OPMERKING: Inspecteer de neurosferen de volgende dag visueel. Verhoog de snelheid van de orbitale shaker als de neurosferen samengeklonterd zijn of aan de onderkant van de plaat zijn bevestigd.
    5. Aspirateer het supernatant medium elke 3 dagen zorgvuldig en vervang het door verse CDMII. Laat een kleine hoeveelheid van het medium achter om te voorkomen dat de neurosferen uitdrogen.
    6. Bereid op dag 35 Corticale Differentiatie Medium III (CDMIII) voor (Tabel 1).
      OPMERKING: De matrixcomponent moet worden opgelost in koude CDMIII.
    7. Zuig het medium uit de plaat en voeg 10 ml koude CDMIII toe.
      OPMERKING: Het is effectiever om koud medium te gebruiken, zodat de matrixcomponent de organoïden kan coaten zonder klonten te vormen.
    8. Plaats de plaat na het verwisselen van het medium terug op een orbitale shaker bij 70 tpm in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
    9. Verander het medium elke 3-5 dagen, afhankelijk van de groeisnelheid, zoals aangegeven door de kleur van het medium.
    10. Bereid op dag 70 Corticale Differentiatie Medium IV (CDMIV) voor (Tabel 1). Gebruik CDMIV-medium totdat de gewenste leeftijd van organoïden is bereikt. Houd de plaat gedurende deze periode op een orbitale shaker bij 70 tpm in een bevochtigde weefselkweekincubator (37 °C en 5% CO2).
    11. Verander het medium elke 3-5 dagen, afhankelijk van de groeisnelheid.

2. Immunostaining van hersenorganoïden

  1. Weefselvoorbereiding
    1. Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing en plaats deze onder een veiligheidskap.
      OPMERKING: Draag persoonlijke veiligheidsuitrusting bij het hanteren van PFA.
    2. Verzamel hersenorganoïden en breng ze voorzichtig over met een stompe plastic Pasteur-pipet van 3 ml naar een 6-well plaat gevuld met PFA.
      OPMERKING: Gebruik organoïden ouder dan 40 dagen om de visualisatie van structuren met een hogere cellulaire complexiteit mogelijk te maken.
    3. Bewaar de organoïden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in de PFA-oplossing.
    4. Verwijder de PFA voorzichtig met een plastic Pasteur-pipet van 3 ml en was de vaste organoïden drie keer met PBS.
    5. Bewaar de vaste organoïden bij 4 °C in PBS tot verder gebruik.
  2. Bereiding van hersenorganoïde plakjes
    1. Bereid een 3% agar-oplossing en verwarm langzaam tot het vloeibaar is.
    2. Plaats de vorm (het gesneden uiteinde van een spuit van 10 ml) op een stuk absorberend filterpapier (gladde kant naar boven). Leg er een druppeltje agar op.
    3. Haal snel een enkele organoïde uit de 6-putplaat met een spatel en verwijder overtollige PBS met filterpapier.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de organoïde niet rechtstreeks met filterpapier aanraakt.
    4. Plaats de organoïde op de agardruppel.
    5. Herhaal deze procedure met maximaal drie organoïden.
      OPMERKING: Werk snel om stolling van de agar tijdens deze stap te voorkomen.
    6. Vul de mal opnieuw met agar totdat alle organoïden volledig bedekt zijn.
    7. Wacht tot de agar begint te stollen en breng dan voorzichtig de hele mal met de organoïden, inclusief het absorberende filterpapier, over op een koelelement.
      OPMERKING: Als een koelelement niet beschikbaar is, bewaar de organoïden dan enkele minuten in een koelkast bij 4 °C.
    8. Bereid je in de tussentijd voor op de snijprocedure: plaats een scheermesje (gereinigd met aceton en gewassen met dubbel gedestilleerd water) in de houder van de vibratome, monteer het op het bad en vul het met PBS.
    9. Verwijder de vorm van (gestolde) agar en gebruik een scalpel om het te trimmen tot een kubus.
    10. Bevestig de agarkubus met de organoïden op de dragerplaat van de vibratome met kleefgel (zie de tabel met materialen) en plaats deze in het bad met PBS.
    11. Pas de trilling aan (zie de tabel met materialen) om plakjes met een dikte van 150 μm te snijden.
      OPMERKING: Vibratome-instellingen (juiste hoek, amplitude, frequentie en snelheid van het blad) kunnen vergelijkbaar zijn met die welke worden gebruikt voor het snijden van vast hersenweefsel afkomstig van vroege postnatale dieren. De ideale instellingen zijn echter sterk afhankelijk van het type vibratome en moeten in een eerste stap worden bepaald om vervorming of zelfs scheuren van het weefsel tijdens het snijden te voorkomen.
    12. Start de snijprocedure. Gebruik een glazen pipet of een spatel om elk vers gesneden plakje voorzichtig over te brengen in een 24-wells plaat gevuld met PBS.
    13. Bewaar de plaat met plakjes bij 4 °C (tot enkele dagen) tot verdere verwerking.
    14. Breng de plakjes uit de plaat met een glazen pipet of een spatel over op microscoopglaasjes. Gebruik minimaal 2 segmenten per dia.
    15. Verwijder voorzichtig de agar en overtollige PBS met een spuit.
    16. Laat de plakjes drogen tot ze zich aan de dia's hechten.
      OPMERKING: Hoewel microscoopglaasjes kunnen worden opgeslagen in plastic kamers gevuld met PBS bij 4 °C, moeten ze zo snel mogelijk na de snijprocedure worden gekleurd.
  3. Immunohistochemische kleuring
    1. Bereid de blokkeringsoplossing voor (tabel 1).
    2. Gebruik een PAP-pen om een hydrofobe rand rond de plakjes op de dia te tekenen om alle oplossingen op de dia's te houden.
    3. Voeg voorzichtig de blokkeringsoplossing toe op de dia en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (22-25 °C). Om te voorkomen dat het weefsel wordt vernietigd, moet u de oplossing niet direct op de plakjes toevoegen.
    4. Zuig de blokkerende oplossing op en breng het gewenste primaire antilichaam verdund in de blokkerende oplossing aan.
    5. Incubeer de glijbaan een nacht in een bevochtigde kamer bij 4 °C.
    6. Spoel de dia drie keer af met 1x PBS gedurende 10 minuten elk.
    7. Incubeer de plakjes met het specifieke secundaire antilichaam verdund in de blokkerende oplossing en voer Hoechst-kleuring (1:2.500) uit gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
      OPMERKING: Vergeet niet om negatieve controles uit te voeren om te bevestigen dat er geen niet-specifieke binding of autofluorescentie is.
    8. Spoel drie keer met 1x PBS gedurende 10 minuten elk in het donker.
    9. Voeg een druppel bevestigingsmedium toe aan de plak, plaats een deklap op de rand van de druppel en leg de deksels langzaam naar beneden in de richting van de plak om luchtbellen te voorkomen.
    10. Laat de glijbaan een nacht rusten bij kamertemperatuur. Breng nagellak aan op de rand van de coverslip om de slide verder af te dichten. Voor langdurige opslag, bewaren bij 4 °C.
  4. Documentatie van kleuring
    1. Om grote afbeeldingen te scannen op stiksels, gebruikt u een gemotoriseerde rechtopstaande breedveldmicroscoop die is uitgerust met (zie de tabel met materialen voor details) een objectief van hoge kwaliteit; DAPI-filterset (bijv. excitatie (EX): 340-380 nm, dichroïsche spiegel (DM): 400 nm, barrièrefilter (BA): 435-485 nm); fluoresceïne-isothiocyanaatfilterset (bijv. EX: 465-495 nm, DM: 505 nm, BA: 515-555 nm); Alexa594 filterset (bijv. ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); digitale camera; krachtige acquisitiesoftware die geautomatiseerde steken en stapelbewerkingen mogelijk maakt.
    2. Gebruik voor beeldverwerking een beeldverwerkingsprogramma dat 8-bits tif-bestanden kan genereren, steken kan bijsnijden, contrast en helderheid kan aanpassen, de kanalen kan samenvoegen (bijvoorbeeld blauw, groen en rood) en schaalbalken kan toevoegen.
    3. Gebruik voor het scannen van details een gemotoriseerde confocale laserscanmicroscoop uitgerust met een hoogwaardig objectief, een UV-laser (EX: 408 nm), een Argon-laser (EX: 488 nm), een Helium-Neon-laser (EX: 543), beeldvormingssoftware voor een confocale microscoop.
    4. Gebruik voor beeldverwerking van details een beeldverwerkingsprogramma dat in staat is om projecties met maximale intensiteit van confocale z-stacks te genereren (bijvoorbeeld optische secties van elk 0,6 μm), 8-bits tif-bestanden te genereren, contrast en helderheid aan te passen, de kanalen samen te voegen (bijvoorbeeld blauw, groen en rood), schaalbalken toe te voegen.
    5. Gebruik een grafische editor om de cijfers te rangschikken.

3. Bio-energetische profilering van hersenorganoïden

  1. Voorbereiding van organoïden voor bio-energetische profilering
    1. Bereid de papaïne en DNase-oplossing volgens het protocol van de fabrikant.
    2. Breng 3-5 organoïden over in een plaat met 6 putten. Was ze twee keer met voorverwarmde PBS.
    3. Voeg 2 ml voorgewarmde geactiveerde papaïneoplossing toe die DNase bevat. Snijd met een mes de organoïden in kleine stukjes.
    4. Plaats de plaat op een orbitale shaker met 27 tpm in een celkweekincubator (bij 37 °C, 5% CO2) en incubeer gedurende 15-20 minuten.
      OPMERKING: De tijd van incubatie is afhankelijk van het organoïde stadium. Organoïden in een vroeg stadium kunnen worden gebruikt zoals ze zijn. Voor organoïden ouder dan 3 maanden wordt aanbevolen om de organoïden vóór dissociatie in 2-3 stukken te snijden en de stukken te incuberen met een schommelsnelheid die is ingesteld op 27 tpm gedurende 15-20 minuten bij 37 °C. Deze procedure kan helpen bij het verwijderen van necrotisch weefsel dat aanwezig kan zijn in de organoïden in een later stadium.
    5. Verzamel de verteerde weefsels in een buis van 15 ml en voeg 5 ml organoïde kweekmedium CDMIV toe (tabel 1).
    6. Trituraer het weefsel met een plastic pipet van 10 ml door 10-15 keer op en neer te pipetteren. Laat het niet-gedissoceerde weefsel tot op de bodem van de buis bezinken.
    7. Breng de celsuspensie voorzichtig over naar een buis van 15 ml en vermijd stukjes onversost weefsel. Filtreer de oplossing door een celzeef van 40 μm (bijv. polystyreenbuizen met ronde bodem met celzeefdoppen).
    8. Pellet de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    9. Beoordeel het celnummer en de kwaliteit met trypan blue.
    10. Plaats het gewenste aantal (~ 20.000 / put) cellen op gecoate 96-well microplaten. Verander het medium 6-8 uur na plating in Neuronal Medium (tabel 1).
    11. Incubeer de gecoate 96-well microplaat gedurende 4 dagen in een CO2-incubator (37 °C, 5% CO2).
  2. Bio-energetische profilering
    1. Voeg op dag 3 na het afstoten van de gedissocieerde cellen 200 μL kalibratieoplossing toe aan elk putje van het onderste deel van de 96-well microplaat en plaats de bovenste groene sensorcartridge op de gehydrateerde microplaat.
      OPMERKING: Plaats de sensorcartridge bovenop de microplaat in de juiste richting en zorg ervoor dat de kalibrantoplossing alle sensoren bedekt.
    2. Incubeer de gehydrateerde 96-well microplaat 's nachts in een niet-CO2-incubator bij 37 °C.
    3. Schakel de analysator in om het instrument 's nachts bij 37 °C te laten stabiliseren.
    4. Inspecteer op dag 4 na het opnieuw afspelen de gedisassocieerde organoïde cultuur op de 96-well microplaat onder de microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen verschijnen als een confluente monolaag.
    5. Bereid het testmedium voor (tabel 1).
    6. Verwijder Neuronal Medium uit alle putten met een pipet zonder de bodem van de put aan te raken om celbeschadiging te voorkomen. U kunt ook voorzichtig het hele bord omkeren en vervolgens drogen op schoon papier. Werk snel om celdood te voorkomen.
    7. Was de cellen tweemaal met voorgewarmd 200 μL assaymedium. Voeg assay medium toe aan een eindvolume van 180 μL per put. Incubeer de 96-well microplaat in een niet-CO2-incubator bij 37 °C gedurende 1 uur.
    8. Bereid 10 μM-oplossingen van mitochondriale remmers in assaymedium. Merk op dat de uiteindelijke concentratie na injectie 1 μM is.
    9. Laad de sensorcartridge die in de gehydrateerde microplaat is geplaatst met 10x-oplossingen van de mitochondriale remmers.
      1. Voeg 18 μL mitochondriale remmer 1 toe aan poort A.
      2. Voeg 19,8 μL mitochondriale remmer 2 toe aan poort B.
      3. Voeg 21,6 μL mitochondriale remmer 2 toe aan poort C.
      4. Voeg 23,4 μL mitochondriale remmer 3 toe aan poort D.
    10. Plaats de geladen patroon in de gehydrateerde microplaat in een niet-CO2-incubator bij 37 °C tot het begin van de test.
    11. Stel een hardloopprotocol in de software van het instrument in (tabel 2).
    12. Druk op START. Neem de geladen cartridge uit de niet-CO2-incubator en plaats deze in de analysator voor kalibratie.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de plaat in de juiste richting en zonder deksel is geplaatst.
    13. Zodra de kalibratiestap is voltooid, verwijdert u de kalibratieplaat. Neem de 96-well microplaat uit de niet-CO2-incubator en plaats deze in de analyzer. Klik op DOORGAAN om de metingen te starten.
    14. Wanneer de run is voltooid, verwijdert u de 96-well celkweekmicroplaat uit de analyzer en verzamelt u het medium uit alle putten zonder de cellen te storen.
      OPMERKING: Het medium kan worden bewaard bij -20 °C en later worden gebruikt voor het meten van de hoeveelheid lactaat die door de cellen in het medium wordt vrijgegeven met behulp van een geschikte lactaattestkit.
    15. Was de cellen met 200 μL 1x PBS in elke put.
    16. Na het verwijderen van de PBS vriest u de plaat in bij -20 °C.
      OPMERKING: De bevroren plaat kan worden gebruikt om cellen, eiwitten of DNA in elke put van de microplaat te kwantificeren. Deze kwantificering zal nodig zijn voor het normaliseren van de verkregen bio-energetische snelheden. Volg de instructies van de fabrikant voor cel-, eiwit- of DNA-kwantificeringstests.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het hier beschreven protocol vergemakkelijkt de robuuste generatie van ronde organoïden (figuur 1A). De gegenereerde organoïden bevatten volwassen neuronen die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van eiwitmarkers die specifiek zijn voor axonen (SMI312) en dendrieten (microtubule-geassocieerd eiwit 2 (MAP2)) (Figuur 1B). Volwassen organoïden bevatten niet alleen neuronale cellen (MAP2-positief), maar ook glia...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel beschrijft de reproduceerbare generatie van menselijke iPSC-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik voor mitochondriale ziektemodellering. Het hier beschreven protocol is aangepast op basis van een eerder gepubliceerd werk20. Een groot voordeel van het huidige protocol is dat het niet vereist dat elke organoïde handmatig in een steigermatrix wordt ingesloten. In feite wordt de matrixoplossing eenvoudig opgelost in het celkweekmedium. Bovendien is het niet nodig om dure bioreactoren t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële of niet-financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

Wij danken Miriam Bünning voor de technische ondersteuning. We erkennen de steun van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 aan A.P.), Spark en Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), de United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.) en het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) (e: Bio jonge onderzoeker subsidie AZ 031L0211 aan A.P.). Het werk in het laboratorium van C.R.R. werd ondersteund door de DFG (FOR 2795 "Synapsen under stress", Ro 2327/13-1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-mercaptoethanolGibco31350-010
Affinity DesignerSerif (Europe) LtdLayout software; Vector graphics editor
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pigSigma AldrichSAB4600033-250UL1:300
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouseThermo Fisher ScientificA-315711:300
Antimycin ASigma Aldrich1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1)Sigma AldrichT85781:2000
Argon LaserMelles GriotAny other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too
Ascorbic acidSigmaA92902
B-27 with Vitamin AGibco17504044
Bacto AgarBecton Dickinson3% in PBS, store solution at -20 °C
BDNFMiltenyi Biotec130-093-0811
cAMPSigmaD0627
Cell Star cell culture 6 well plateGreiner-Bio-One657160
Chemically Defined Lipid ConcentrateGibco11905031
Confocal laser scanning microscope C1Nikon Microscope SolutionsModular confocal microscope system
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-freeCorning356231Matrix component
CyQUANT Cell Proliferation Assay KitThermo FisherC7026
DMEM/F12ThermoFisher31330038
DMSOSigmaD2660-100ML
Donkey anti-goat Cy3Merck MilliporeAP180C1:300
Donkey anti-mouse Cy3Merck MilliporeAP192C1:300
Donkey anti-rabbit Cy3Merck MilliporeAP182C1:300
DPBSGibco14190250
DS-Q1Mc cameraNikon Microscope Solutions
Eclipse 90i upright widefield microscopeNikon Microscope Solutions
Eclipse E 600FN upright microscopeNikon Microscope Solutions
Eclipse Ts2 Inverted MicroscopeNikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91Nikon Microscope SolutionsImaging software for confocal microscope
FCCPSigma Aldrich370-86-5
Fetal Bovine SerumGibco10270-106
GDNFMiltenyi Biotec130-096-291
Glasgow MEMGibco11710-035
Glass Pasteur pipetteBrand747715Inverted
GlutamaxGibco35050-061
Helium-Neon LaserMelles GriotEvery other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too
HeparinMerckH3149-25KU
HERACell 240i CO2 IncubatorThermo Scientific51026331
Hoechst 33342InvitrogenH35701:2500
Image J 1.53cWayne Rasband National Institute of HealthImage processing Software
Injekt Solo 10 mL/ LuerBraun4606108V
Knockout Serum ReplacementGibco10828010
Laser (407 nm)CoherentAny other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too
Map2Synaptic SystemsNo. 1880041:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAAGibco11140-050
mTeSR PlusStemcell Technology85850iPSC medium
Multifuge X3R CentrifugeThermo Scientific10325804
MycoAlert Mycoplasma Detection KitLonza# LT07-218
N2 SupplementGibco17502-048
Needle for single usage (23G x 1” TW)Neoject10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2NikonImaging software
Oligomycin ASigma Aldrich75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010Heidolph543-12310-00
PAP PenSigmaZ377821-1EATo draw hydrophobic barrier on slides.
Papain Dissociation System kitWorthingtonLK003150
ParaformaldehydeMerck8187154% in PBS, store solution at -20 °C
Pasteur pipette 7mLVWR612-1681Graduated up to 3 mL
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0Nikon Microscope SolutionsDry Microscope Objective
Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13Nikon Microscope SolutionsOil Immersion Microscope Objective
Polystyrene Petri dish (100 mm)Greiner Bio-One664161
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)Falcon352235
Potassium chlorideRoth6781.1
ProLong Glass Antifade MoutantInvitrogenP36980
Qualitative filter paperVWR516-0813
Rock InhibitiorMerckSCM075
RotenoneSigma83-794
S100βAbcamAb111781:600
SB-431542Cayman Chemical Company

Referenties

  1. Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
  2. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).
  3. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
  4. Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
  5. Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
  6. Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
  7. Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
  8. Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
  9. Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191(2020).
  10. Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378(2016).
  11. Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  12. Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
  13. Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
  14. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  15. Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
  16. Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182(2020).
  17. Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
  18. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929(2021).
  19. Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
  22. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386(2021).
  23. Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760(2020).
  24. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

menselijke iPSCsgeneratie van organoïdencorticale differentiatievorming van neurosferebio-energetische profileringconfocale beeldvormingzuurstofconsumptiesnelheidmitochondriaal metabolisme
Generatie van organoïden in de menselijke hersenen voor mitochondriale ziektemodellering
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.