Methodenartikel

Longitudinale intravitale beeldvorming door heldere siliconenvensters

3.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62757

⸱

5 januari 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een benadering gepresenteerd voor intravitale beeldvorming op lange termijn met behulp van optisch heldere, siliconen vensters die rechtstreeks op het weefsel / orgaan van belang en de huid kunnen worden gelijmd. Deze ramen zijn goedkoper en veelzijdiger dan andere die momenteel in het veld worden gebruikt, en de chirurgische inbrenging veroorzaakt beperkte ontsteking en leed voor de dieren.

Samenvatting

Intravitale microscopie (IVM) maakt visualisatie van celbeweging, deling en dood mogelijk bij eencellige resolutie. IVM via chirurgisch ingebrachte beeldvormingsvensters is bijzonder krachtig omdat het longitudinale observatie van hetzelfde weefsel gedurende dagen tot weken mogelijk maakt. Typische beeldvormingsvensters bestaan uit een glazen afdekplaat in een biocompatibel metalen frame dat aan de huid van de muis is gehecht. Deze vensters kunnen de vrije beweging van de muizen verstoren, een sterke ontstekingsreactie uitlokken en falen als gevolg van gebroken glas of gescheurde hechtingen, die allemaal euthanasie kunnen vereisen. Om deze problemen aan te pakken, werden vensters voor beeldvorming van buikorganen en borstklieren op lange termijn ontwikkeld uit een dunne film van polydimethylsiloxaan (PDMS), een optisch helder siliconenpolymeer dat eerder werd gebruikt voor craniale beeldvormingsvensters. Deze vensters kunnen rechtstreeks op de weefsels worden gelijmd, waardoor de tijd die nodig is voor het inbrengen wordt verkort. PDMS is flexibel en draagt bij aan de duurzaamheid bij muizen in de loop van de tijd - tot 35 dagen zijn getest. Longitudinale beeldvorming is beeldvorming van hetzelfde weefselgebied tijdens afzonderlijke sessies. Een roestvrijstalen rooster werd ingebed in de ramen om hetzelfde gebied te lokaliseren, waardoor dynamische processen (zoals involutie van de melkklier) op dezelfde locaties, dagen na elkaar, konden worden gevisualiseerd. Dit siliconenvenster maakte het ook mogelijk om afzonderlijke verspreide kankercellen te volgen die zich in de loop van de tijd ontwikkelen tot micrometastasen. De siliconen ramen die in deze studie worden gebruikt, zijn eenvoudiger in te brengen dan glazen ramen met een metalen frame en veroorzaken een beperkte ontsteking van de afgebeelde weefsels. Bovendien maken ingebedde rasters het mogelijk om hetzelfde weefselgebied eenvoudig te volgen in herhaalde beeldvormingssessies.

Inleiding

Intravitale microscopie (IVM), de beeldvorming van weefsels bij verdoofde dieren, biedt inzicht in de dynamiek van fysiologische en pathologische gebeurtenissen bij cellulaire resolutie in intacte weefsels. De toepassingen van deze techniek variëren sterk, maar IVM heeft een belangrijke rol gespeeld op het gebied van kankerbiologie om te helpen ophelderen hoe kankercellen weefsels binnendringen en uitzaaien, interageren met de omliggende micro-omgeving en reageren op geneesmiddelen 1,2,3. Bovendien is IVM de sleutel geweest tot het bevorderen van het begrip van de complexe mechanismen die immuunresponsen beheersen door inzichten te bieden die complementair zijn aan ex vivo profileringsbenaderingen (bijv. Flowcytometrie). Intravitale beeldvormingsexperimenten hebben bijvoorbeeld details onthuld over immuunfuncties als ze betrekking hebben op celmigratie en cel-celcontact en hebben een platform geboden om spatiotemporale dynamica te kwantificeren als reactie op letsel of infectie 4,5,6,7. Veel van deze processen kunnen ook worden bestudeerd door histologische kleuring, maar alleen IVM maakt het mogelijk om dynamische veranderingen te volgen. In feite, terwijl een histologische sectie een momentopname van het weefsel op een bepaald moment biedt, kan intravitale beeldvorming intercellulaire en subcellulaire gebeurtenissen in hetzelfde weefsel in de loop van de tijd volgen. Met name de vooruitgang in fluorescentielabeling en de ontwikkeling van moleculaire reporters hebben het mogelijk gemaakt moleculaire gebeurtenissen te correleren met cellulair gedrag, zoals proliferatie, dood, beweeglijkheid en interactie met andere cellen of de extracellulaire matrix. De meeste IVM-technieken zijn gebaseerd op fluorescentiemicroscopie, wat vanwege lichtverstrooiing het afbeelden van diepere weefsels een uitdaging maakt. Het weefsel van belang moet daarom vaak chirurgisch worden blootgesteld met een vaak invasieve en terminale procedure. Afhankelijk van de plaats van het orgaan kan het weefsel dus continu worden afgebeeld gedurende een periode variërend van enkele tot 40 h8. Als alternatief maakt het chirurgisch inbrengen van een permanent beeldvormingsvenster de beeldvorming van hetzelfde weefsel sequentieel mogelijk gedurende een periode van dagen tot week 7,9.

De ontwikkeling van nieuwe beeldvormingsvensters is benadrukt als een technologische noodzaak om intravitale beeldvormingsbenaderingen verder te verbeteren10. Het prototypische intravitale beeldvormingsvenster is een metalen ring met een glazen dekplaat die met hechtingen aan de huid is bevestigd11. Interferentie met vrije beweging, de accumulatie van exsudaat en schade aan de glazen afdekkingslip zijn veel voorkomende problemen bij het gebruik van dergelijke ramen. Bovendien vereist het prototypische venster gespecialiseerde productie en kan de chirurgische procedure uitgebreide training vereisen. Om deze problemen aan te pakken, werd polydimethylsiloxaan (PDMS), een siliconenpolymeer, dat eerder is gebruikt in schedelvensters voor langetermijnbeeldvorming in de hersenen12, aangepast voor gebruik in beeldvorming van buikorganen en borstklieren. Hier wordt een gedetailleerde methode gepresenteerd voor het genereren van op PDMS gebaseerde siliconenvensters, inclusief hoe het venster rond een roestvrijstalen raster kan worden gegoten om oriëntatiepunten te bieden voor herhaalde beeldvorming van dezelfde weefselgebieden. Verder wordt een eenvoudige, steekvrije chirurgische ingreep beschreven voor het inbrengen van het venster boven buikorganen of de borstklier. Deze nieuwe aanpak overwint enkele van de meest voorkomende problemen met momenteel gebruikte beeldvormingsvensters en verhoogt de toegankelijkheid van longitudinale intravitale beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle beschreven procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de chirurgische richtlijnen van het Cold Spring Harbor Laboratory en waren goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Cold Spring Harbor Laboratory.

1. Het siliconen venster gieten

  1. Bereid het siliconenpolymeer (PDMS) door het basiselastomeer en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 (v/v) te mengen.
  2. Giet een raam door een kleine hoeveelheid PDMS op een steriel, glad oppervlak te deponeren en pas de verhouding tussen volume en oppervlakte aan op de gewenste dikte.
    OPMERKING: Het gebruik van 200 mg polymeeroplossing voor een cirkel met een diameter van 22 mm op het deksel van een 24 goed geplaatst deksel resulteert in een goed compromis tussen raam stevigheid en optische helderheid.
  3. Optioneel: Om oriëntatiepunten te bieden voor herhaalde beeldvorming van dezelfde weefselgebieden, drukt u lichtjes een roestvrijstalen rooster in de siliconen nadat het PDMS zich op het gewenste gietoppervlak bevindt.
  4. Om luchtbellen te verwijderen, plaatst u het gecoate oppervlak gedurende 45 minuten in een vacuümsiccator om het polymeer te ontgassen.
  5. Laat de siliconen ramen in een oven op 80 °C gedurende 45 min uitharden.
  6. Scoor het polymeer aan de randen van de mal en pel de uitgeharde ramen voorzichtig van het oppervlak dat wordt gebruikt voor het gieten met een tang.
  7. Steriliseer vóór de operatie de ramen door autoclaveren.

2. De muis voorbereiden voor het inbrengen van het siliconenvenster

  1. Verdoof de muis in een inductiekamer met 4% (v/v) isofluraan. Verplaats de muis naar een warmhoudkussen op de operatietafel, plaats de muis in het anesthesieneusmasker en verlaag de isofluraanconcentratie tot 2% voor onderhoud tijdens de operatie.
  2. Controleer de diepte van de anesthesie door in de tenen van de achterpoten te knijpen. Ga niet verder totdat de muis inactief is en geen teenknijpreflexreactie vertoont.
  3. Breng oogheelkundig glijmiddel aan op de ogen om te voorkomen dat ze uitdrogen en trauma voorkomen.
  4. Dien preventieve analgesie (buprenorfine 0,05 mg/kg) subcutaan toe.
  5. Scheer de operatieplaats en verwijder het haar volledig met een ontharingscrème.
  6. Breng povidon-jodiumoplossing (10% v /v) en ethanol (70% v / v) achtereenvolgens 3x aan om de infectie van de operatieplaats te voorkomen.

3. Het inbrengen van een ventraal venster voor beeldvorming in de lever; aanpasbaar voor andere buikorganen (figuur 1)

  1. Plaats de muis in rugligging.
  2. Maak een incisie van 10 mm vanaf 3 mm van het xiphoid-proces met behulp van een steriele schaar en tang.
  3. Verwijder een 1-1,5 cm2 deel van de huid langs de middellijn.
  4. Gebruik een tweede steriele schaar en tang om een deel van het peritoneum te verwijderen dat iets kleiner is dan het deel van de huid.
  5. Optioneel: Om een groter deel van de lever te visualiseren, gebruikt u steriele wattenstaafjes bevochtigd met steriele zoutoplossing om de lever van het diafragma naar beneden te duwen en het falciforme ligament te onthullen dat de lever met het diafragma verbindt. Breek het ligament af en zorg ervoor dat de inferieure vena cava niet wordt doorgesneden.
  6. Trek chirurgische lijm op met een spuit van 31 G, breng een kleine hoeveelheid ervan aan op het oppervlak van de lever rond de randen van het in beeld te brengen gebied. Deze lijm creëert een cirkelvormige afdichting, waardoor het middengebied intact blijft voor beeldvorming.
    LET OP: Beperk de lijm tot kleine druppeltjes die een cirkelvormig patroon vormen rond het beeldvormingsgebied. Weefsel dat onmiddellijk in contact komt met de lijm kan niet worden afgebeeld. Het is niet nodig om het weefsel te drogen voordat u de lijm aanbrengt.
    OPMERKING: Alle lijmen op basis van cyanoacrylaat kunnen met succes worden gebruikt voor deze procedure. Chirurgische lijm zorgt voor steriliteit. Voor terminale procedures leveren universele superlijmen goede resultaten op.
  7. Plaats het raam met een tang en houd het stevig tegen de lever totdat de lijm is opgedroogd (~ 2 min).
  8. Vouw de randen van het raam onder het buikvlies.
  9. Deponeer met een spuit een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op de randen van het venster die zich nu onder het peritoneum bevinden. Druk met een tang op het peritoneum om het aan het raam vast te zetten.
  10. Zet op dezelfde manier een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op het peritoneum voordat u met een tang op de huid drukt om deze aan het peritoneum vast te zetten.
    OPMERKING: Indien correct uitgevoerd, moet een cirkelvormig gebied van leverweefsel nu zichtbaar zijn door het venster.
  11. Breng lijm aan rond de randen van het venster om een rand te creëren die helpt voorkomen dat de huid teruggroeit over het raam.
    LET OP: Als de procedure wordt uitgevoerd met behulp van steriele chirurgische technieken en het venster wordt gesteriliseerd voordat het wordt ingebracht, is het afdichten van de wond met chirurgische lijm voldoende om infecties te voorkomen. Het niet volgen van de juiste aseptische technieken tijdens chirurgische inbrenging of onvolmaakte sluiting kan echter leiden tot openlijke of subklinische infectie en uitdroging van het weefsel.

4. Het inbrengen van een lateraal venster voor beeldvorming in de lever; compatibel met de gelijktijdige injectie van kankercellen in de poortader (figuur 2)

  1. Plaats de muis op de linker zijwaartse decubituspositie
  2. Maak een incisie van 10 mm op de rechterflank 3 mm onder de ribbenboog met behulp van een steriele schaar en tang.
  3. Verwijder een 1 cm2 deel van de huid.
  4. Gebruik een tweede steriele schaar en tang om een deel van het peritoneum te verwijderen dat iets kleiner is dan het deel van de huid.
  5. Trek chirurgische lijm op met een spuit van 31 G, breng een kleine hoeveelheid ervan aan op het oppervlak van de lever rond de randen van het in beeld te brengen gebied.
    LET OP: Beperk de lijm tot kleine druppeltjes die een cirkelvormig patroon vormen rond het beeldvormingsgebied. Weefsel dat onmiddellijk in contact komt met de lijm kan niet worden afgebeeld.
    OPMERKING: Alle lijmen op basis van cyanoacrylaat kunnen met succes worden gebruikt voor deze procedure. Chirurgische lijm zorgt voor steriliteit. Voor terminale procedures leveren universele superlijmen goede resultaten op.
  6. Plaats het raam met een tang en houd het stevig tegen de lever totdat de lijm is opgedroogd (~ 2 min).
  7. Vouw de randen van het raam onder het buikvlies.
  8. Deponeer met een spuit een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op de randen van het venster die zich nu onder het peritoneum bevinden. Druk met een tang op het peritoneum om het aan het raam vast te zetten.
  9. Zet op dezelfde manier een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op het peritoneum voordat u met een tang op de huid drukt om deze aan het peritoneum vast te zetten.
    OPMERKING: Indien correct uitgevoerd, moet een cirkelvormig gebied van leverweefsel nu zichtbaar zijn door het venster.
  10. Breng lijm aan rond de randen van het venster om een rand te creëren die helpt voorkomen dat de huid teruggroeit over het raam.
  11. Als een poortaderinjectie nodig is:
    1. Plaats de muis in rugligging.
    2. Maak een incisie van 10 mm vanaf het xiphoid-proces in de huid.
    3. Maak met een tweede steriele schaar en tang een incisie van 10 mm in het peritoneum.
    4. Doop twee wattenstaafjes in steriele zoutoplossing.
    5. Gebruik de wattenstaafjes om de darm voorzichtig op steriel gaas te trekken dat is bevochtigd met steriele zoutoplossing, waarbij u ervoor zorgt dat de oriëntatie niet wordt verdraaid of anderszins wordt verstoord.
    6. Blijf de darm uit de buikholte verplaatsen totdat de poortader zichtbaar is aan de rechterkant van de buik.
    7. Breng een naald van 31-33 G 5-7 mm caudaal in op het punt van binnenkomst van de poortader in de lever, zorg ervoor dat u in het bloedvat gaat en niet er doorheen.
    8. Injecteer de kankercellen langzaam (geresuspendeerd in 100 μL steriel PBS).
      OPMERKING: Voor dit experiment kan de cellijn van amurine alvleesklierkanker (bijv. KPC-BL/6-1199) worden gekweekt in volledige DMEM-media en 1 x 105 cellen geïnjecteerd in 100 μL steriel PBS.
    9. Om bloedingen te voorkomen, oefent u onmiddellijk na het terugtrekken van de naald gedurende 1-2 minuten zachte druk uit op de injectieplaats met een klein stukje chirurgische spons.
    10. Nadat de druk is vrijgegeven, controleert u de site gedurende 1-2 minuten om hemostase te garanderen.
    11. Met behulp van bevochtigde wattenstaafjes, breng de darm terug in de buikholte volgens de fysiologische oriëntatie van het orgaan.
    12. Plaats met behulp van een steriele tang het venster direct onder het peritoneum, aan de linkerkant van de buikholte van de muis.
    13. Hecht met 4-0 zijden hechtingen en niet de middellijnincisie met 7 mm roestvrijstalen wondclips.
    14. Beweeg de muis naar de linker zijwaartse decubituspositie
    15. Maak een incisie van 10 mm op de rechterflank 3 mm onder de ribbenboog door de huid met behulp van een steriele schaar en tang.
    16. Verwijder een 1 cm2 deel van de huid rond de incisie.
    17. Gebruik een tweede steriele schaar en tang om een deel van het peritoneum te verwijderen dat iets kleiner is dan het deel van de huid.
    18. Trek het venster op zijn plaats over de lever voordat u het op zijn plaats lijmt, zoals beschreven in de stappen 4.8-4.10.

5. Het venster voor beeldvorming in de alvleesklier invoegen (figuur 3)

  1. Plaats de muis op de rechter laterale decubituspositie.
  2. Maak een incisie van 10 mm op de linkerflank 3 mm onder de ribbenboog met behulp van een steriele schaar en tang.
  3. Verwijder een 1 cm2 deel van de huid rond de incisie.
  4. Gebruik een tweede steriele schaar en tang om een deel van het peritoneum te verwijderen dat iets kleiner is dan het deel van de huid.
  5. Gebruik steriele wattenstaafjes gedrenkt in steriele zoutoplossing en trek voorzichtig aan de milt om de alvleesklier te visualiseren. Ga verder met het herpositioneren van de alvleesklier met de bevochtigde wattenstaafjes om meer oppervlak zichtbaar te maken door de incisie.
    OPMERKING: Op dit punt kunnen alvleesklierkankercellen orthotopisch in de alvleesklier worden geïnjecteerd als het deel uitmaakt van het experimentele ontwerp.
  6. Trek chirurgische lijm op met een spuit van 31 G, breng een kleine hoeveelheid ervan aan op het oppervlak van de alvleesklier rond de randen van het in beeld te brengen gebied.
    LET OP: Beperk de lijm tot kleine druppeltjes die een cirkelvormig patroon vormen rond het beeldvormingsgebied. Weefsel dat onmiddellijk in contact komt met de lijm kan niet worden afgebeeld.
  7. Plaats het raam met een tang en houd het stevig tegen de alvleesklier totdat de lijm is opgedroogd (~ 2 min).
  8. Vouw de randen van het raam onder het buikvlies.
  9. Deponeer met een spuit een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op de randen van het venster die zich nu onder het peritoneum bevinden. Druk met een tang op het peritoneum om het aan het raam vast te zetten.
  10. Zet op dezelfde manier een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op het peritoneum voordat u met een tang op de huid drukt om deze aan het peritoneum vast te zetten.
    OPMERKING: Indien correct uitgevoerd, moet een cirkelvormig gebied van pancreasweefsel nu zichtbaar zijn door het venster.
  11. Breng lijm aan rond de randen van het venster om een rand te creëren die helpt voorkomen dat de huid teruggroeit over het raam.

6. Het venster voor beeldvorming in de borstklier inbrengen (figuur 4)

  1. Plaats de muis op de rugligging.
  2. Maak een 10 mm incisie mediaal naar een van de inguinale tepels met behulp van een steriele schaar en tang.
  3. Verwijder een 0,5 cm2 deel van de huid boven de borstklier.
  4. Gebruik een tweede steriele schaar om de borstklier zorgvuldig van de huid te scheiden door de schaar tussen de twee oppervlakken te spreiden om de hechting te verstoren.
    OPMERKING: Om het beeld van het inguinale borstkliergebied te vergemakkelijken, moet u voorzichtig zijn met het ontleden van een deel van de huid boven de borstklier, maar superieur aan het achterbeen, zodat het venster de mobiliteit van de muis niet beperkt.
  5. Trek chirurgische lijm op met een spuit van 31 G, breng een kleine hoeveelheid ervan aan op het oppervlak van de borstklier rond de randen van het in beeld te brengen gebied.
    LET OP: Beperk de lijm tot kleine druppeltjes die een cirkelvormig patroon vormen rond het beeldvormingsgebied. Weefsel dat onmiddellijk in contact komt met de lijm kan niet worden afgebeeld.
  6. Plaats het raam met een tang en houd het stevig tegen de borstklier totdat de lijm is opgedroogd (~ 2 min).
    OPMERKING: Een cirkelvormig gebied van borstklierweefsel moet nu zichtbaar zijn door het venster als het correct wordt uitgevoerd.
  7. Vouw de randen van het venster onder de huid.
  8. Deponeer met een spuit een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op de randen van het venster die zich nu onder de huid bevinden. Druk met een tang op de huid om de huid aan het raam vast te zetten.
  9. Breng lijm aan rond de randen van het venster om een rand te creëren die helpt voorkomen dat de huid teruggroeit over het raam.

7. Postoperatief herstel

  1. Plaats de muis in een schone herstelkooi met voldoende nestmateriaal en zorg ervoor dat een deel van de kooi op een verwarmingskussen rust.
  2. Houd de muis continu in de gaten totdat deze bewust en mobiel is.
  3. Geef indien nodig een extra dosis pijnstillend middel 12 uur na de preventieve dosis.
    OPMERKING: Extra analgesie is over het algemeen niet nodig, maar raadpleeg een dierenarts als de muis tekenen van nood vertoont (zoals gebogen rug, onverzorgde vacht of verloren interesse in voedsel). Controleer de muis dagelijks gedurende de eerste 3 dagen na de operatie op tekenen van infectie of andere bijwerkingen. Minder dan 2% van de muizen heeft veterinaire aandacht of euthanasie nodig, meestal als gevolg van gedeeltelijke loslating van het raam. Het is belangrijk op te merken dat voor mannelijke muizen met ventrale leverbeeldvormingsvensters, vechten tussen muizen kan resulteren in loslating van ramen. Dit wordt voorkomen door de muizen apart te huisvesten.

8. Beeldvorming door het raam

  1. Verdoof de muis in een inductiekamer met 4% (v/v) isofluraan.
  2. Breng oogheelkundig glijmiddel aan op de ogen om te voorkomen dat ze uitdrogen en trauma voorkomen.
  3. Beweeg de muis van de inductiekamer naar de microscoopfase. Plaats de muis in het anesthesieneusmasker en verlaag de isofluraanconcentratie tot ongeveer 1-1,5% voor onderhoudsanesthesie tijdens de beeldvormingsprocedure.
  4. Plaats een drukkussensensor onder de muis om de ademsnelheid te controleren en bevestig de muis aan het podium met behulp van zachte chirurgische tape.
  5. Plaats een rectale thermometer om de lichaamstemperatuur tijdens de beeldvormingssessie te controleren.
  6. Schakel de verwarmde pad in en houd de muis nauwlettend in de gaten om ervoor te zorgen dat de lichaamstemperatuur niet hoger is dan 37 °C.
  7. Gebruik software om de ademsnelheid van de muis te controleren. De optimale snelheid is ~ 1 ademhaling / seconde. Pas de anesthesie indien nodig aan.
  8. Reinig het raam vóór elke beeldsessie van elk achtergebleven onderdompelingsmedium en vuil van de lens door het voorzichtig af te vegen met een wattenstaafje gedompeld in 70% ethanol (v / v).
  9. Wanneer u een onderdompelingslens in water gebruikt, breng dan ultrasone gel aan op het raam en vermijd bubbels.
    OPMERKING: Gedestilleerd water kan ook worden gebruikt, maar moet mogelijk opnieuw worden aangebracht tijdens het afbeelden.
  10. Om de optimale diepte voor beeldvorming te vinden, zoekt u eerst het raster en plaatst u het in focus.
  11. Bepaal de geschatte weefselbeeldvormingsdiepte door de onderkant van het raster op 0 in te stellen. Deze informatie is nodig om het overeenkomstige z-vlak in volgende beeldvormingssessies te lokaliseren.
  12. Als u dezelfde locatie wilt identificeren tijdens meerdere beeldbewerkingssessies, gebruikt u de vierkanten op het raster als referentiepunt. Let tijdens het fotograferen op de oriëntatie van het raster en de locatie binnen het raster van elk beeldveld (bijvoorbeeld de2e rij bovenaan, het4e vierkant vanaf de linkerkant).
  13. Gebruik tijdens opeenvolgende beeldvormingssessies het raster om terug te navigeren naar specifieke rastergebieden - en dus beeldvormende velden.
  14. Verwijder na elke beeldsessie het resterende onderdompelingsmedium en vuil van de lens door het raam voorzichtig af te vegen met een wattenstaafje gedompeld in 70% ethanol (v / v).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Intravitale beeldvorming door middel van beeldvormingsvensters kan worden gebruikt om een breed scala aan cellulaire en moleculaire gebeurtenissen met eencellige resolutie over een periode van uren tot weken te observeren, te volgen en te kwantificeren. Ideale kenmerken voor een beeldvormingsvenster zijn: a) beperkte impact op het welzijn van de muis en de fysiologie van het weefsel; b) duurzaamheid; c) eenvoud van inbrengen; en d) duidelijke oriëntatiepunten voor herhaalde beeldvorming van hetzelfde gebied. Het resultaa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Intravitale beeldvormingsvensters zijn belangrijke hulpmiddelen voor het direct visualiseren van fysiologische en pathologische processen met cellulaire resolutie terwijl ze zich in de loop van de tijd ontvouwen. De nieuwe procedure die wordt beschreven voor het gieten en invoegen van flexibele, siliconenbeeldvormingsvensters bij muizen overwint enkele van de meest voorkomende problemen met momenteel gebruikte afbeeldingsvensters (exsudaat, breken en interferentie met normale mobiliteit), biedt extra veiligheid voor de m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

M.E. is lid van de onderzoeksadviesraad voor brensocatib voor Insmed, Inc.; lid van de wetenschappelijke adviesraad voor Vividion Therapeutics, Inc.; een consultant voor Protalix, Inc.; en houdt aandelen in Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T. is mede-oprichter van Mestag Therapeutics, zit in de wetenschappelijke adviesraad en houdt aandelen in Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology en Cygnal Therapeutics. De andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dankbetuigingen

Wij danken Rob Eifert voor zijn hulp bij het ontwerpen en optimaliseren van de lasergesneden rvs roosters. Dit werk werd ondersteund door het CSHL Cancer Center (P30-CA045508) en fondsen voor ME van de National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 en 5P01CA013106-49); CSHL en Northwell Health; de Thompson Family Foundation; Zwem door Amerika; en een subsidie van de Simons Foundation aan CSHL. MS werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) en het National Cancer Institute van de NIH onder toekenningsnummer 1F30CA253993-01. L.M. wordt ondersteund door een James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship. J.M.A. is de ontvanger van een Cancer Research Institute/Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. wordt ondersteund door de Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research en de Thompson Family Foundation. Cartoons werden gemaakt met Biorender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape3M70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2Ethicon N267H
ACTB-ECFP muizenJackson Laboratory22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)Vector Laboratories SK-4200
AlcoholdoekjesBD 326895
AnesthesiesysteemMolecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software en sensoren BIOPACACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray LORIS109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) muizenJackson Laboratory18549
C57BL/6J muizenJackson Laboratory664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)Invitrogen14-0451-82
CD68 AntilichaamAbcamab125212
Curity gaasjes Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) Abcamab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) Abcamab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) Abcamab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant ClearElectron Microscopy Sciences24236-10Twee componenten, 10:1 mengverhouding
Ronde afdekglas, 8mm Diameter, #1.5 Dikte Electron Microscopy Sciences72296-08
Ender-3 Pro 3D printerShenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Ver verwarmde dekenKent ScientificRT-0520
Fc Receptor BlockerInnovex BiosciencesNB309
Fiji beeldverwerkingspakkethttps://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylaat, 0.04µm, geel-groen (505/515)InvitrogenF8795
Gating systeem:BIOPAC Systems Inc.De componenten maken het mogelijk om de vitale functies van de muis tijdens beeldvorming te controleren en de beeldacquisitie op de ademhaling van de muis af te stemmen. Alles werd verkregen van BIOPAC-systemen.
Acqknowledge software ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series DA100C
Dual Gating Sys kleine dierenDTU200 
MP160 voor Windows - Analyse systeemMP160WSW 
MouseOx Plus 120V MOX-120V;015000 
Drukpad TSD110 
GelfoamPfizer9031508Absorbeerbare gelatinespons
Verharde fijne schaarFine Science Tools14090-11Twee paren; roestvrij staal, scherp-scherp
uiteinden, rechte punt, 26 mm
snijkant, 11 cm lengte
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO AntilichaamR&D SystemsAF3667
Hete kistender sterilisatorFine Science Tools18000-45Ongeveer 30 min
voor gebruik aanzetten; gereedschap steriliseren op >200
°C gedurende 30 s
Imaris Bitplanewww.bitplane.com
Immersieve medium Immersol W 2010Zeiss444969-0000-000 
Insuline spuiten met BD Ultra-Fine naald 6mm x 31G 1 mL/ccBD324912
Isofluraan (Fluriso)VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (Tomaat) Lectine (LEL, TL), DyLight® 594Vector Laboratories DL-1177-1
LysM-eGFP muizenwww.mmrrc.org012039-MU
Micro dissecteertangRobozRS-5135Geribbeld, licht gebogen, 0,8 mm tipbreedte; 4" lengte
Micro dissecteertangRobozRS-51531 x 2 tanden, licht gebogen, 0,8 mm tip
breedte, 4" lengte
MTS MiniBionix II 808MTS SystemsServohydraulische materiaaltestmachine
Neutrofiel Elastase 680 FAST probePerkinElmerNEV11169
StiekstofGeneral Welding Supply Corp.
ZuurstofGeneral Welding Supply Corp.
Polymelkzuur filamentHatchbox1,75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36970
Puralube oogzalfDechra NDC17033-211-38
Reflex 7 wondclipsRoboz SurgicalRS-9255
Roestvrij stalen roosterFotofabEen rooster is 0,200 inch in diameter, met een totaal van 52 afzonderlijke roostervierkantjes die 0,016 x 0,016 inch zijn. Er is 0,003 inch ruimte tussen elk vierkant.  
Op het oppervlak behandelde steriele weefselcultuurplatenFisher ScientificFB012929Deksel gebruikt als uithardingsoppervlak voor beeldvormingsvensters
TriM Scope Multiphoton Microscoop LaVision BioTecBeeldvorming werd gedaan op een rechtopstaande 2-foton microscoop (Trimscope, LaVision Bio

Referenties

  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184(2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917(2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  13. Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088(2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562(2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Intravitale microscopiesiliconen beeldvensterlongitudinale beeldvormingpolydimethylsiloxaanvensterbeeldvorming van de melkklierbeeldvorming van abdominale organentracking van immuuncellenbeeldvorming van kankercellenchirurgische inbreng van het vensterweefselvisualisatie

Gerelateerde artikelen