Methodenartikel

Gemanipuleerde longweefsels bereid uit gedecellulariseerde longplakken

DOI:

10.3791/63151

⸱

21 januari 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Yale School of Medicine, 3Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 4Department of Anesthesiology, Yale School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een methode om reproduceerbare, kleinschalige gemanipuleerde longweefsels te genereren, door gedecellulariseerde precisiegesneden longplakken opnieuw te bevolken met alveolaire epitheliale type 2-cellen, fibroblasten en endotheelcellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is behoefte aan verbeterde 3-dimensionale (3D) longmodellen die de architecturale en cellulaire complexiteit van de inheemse longalveolus ex vivo samenvatten. Recent ontwikkelde organoïde modellen hebben de uitbreiding en studie van longepitheelvoorlopers in vitro vergemakkelijkt, maar deze platforms vertrouwen meestal op van muizentumor afgeleide matrix en / of serum en bevatten slechts één of twee cellulaire afstammingslijnen. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van gemanipuleerde longweefsels (ELTs) op basis van de multi-lineage recellularisatie van gedecellulariseerde precisie-gesneden longplakken (PCLS). ELTs bevatten alveolaire structuren bestaande uit alveolair epitheel, mesenchym en endotheel, binnen een extracellulair matrix (ECM) substraat dat sterk lijkt op dat van de inheemse long. Om de weefsels te genereren, worden rattenlongen opgeblazen met agarose, gesneden in 450 μm dikke plakken, in stroken gesneden en gedecellulariseerd. De resulterende acellulaire ECM-steigers worden vervolgens opnieuw ingezaaid met primaire endotheelcellen, fibroblasten en alveolaire epitheliale type 2-cellen (AEC2s). AEC2s kunnen gedurende ten minste 7 dagen in ELT-cultuur worden gehouden met een serumvrij, chemisch gedefinieerd groeimedium. Tijdens het weefselvoorbereidings- en kweekproces worden de plakjes in een cassettesysteem geknipt dat de verwerking en gestandaardiseerde celzaaiing van meerdere ELT's parallel vergemakkelijkt. Deze ELTs vertegenwoordigen een organotypisch kweekplatform dat onderzoek naar cel-cel- en cel-matrixinteracties binnen de alveolus moet vergemakkelijken, evenals biochemische signalen die AEC2's en hun niche reguleren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longblaasjes zijn de functionele eenheden van de distale long, bestaande uit een maaswerk van gasuitwisselingsruimten omzoomd door alveolaire epitheliale type 1-cellen (AEC1s) en type 2-cellen (AEC2s). Onderliggend aan het epitheel ligt een dicht netwerk van haarvaten en ondersteunend mesenchym, allemaal ondersteund door een extracellulaire matrix (ECM) steiger die zowel sterkte als flexibiliteit biedt aan deze delicate luchtzakken1. De longblaasjes zijn ook de plaats van letsel in tal van longpathologieën, waaronder idiopathische longfibrose2, acute respiratory distress syndrome3 en ernstige coronavirusziekte-19 (COVID-19)4. Hoewel het werk in het afgelopen decennium een opmerkelijke plasticiteit in het longepitheel heeft blootgelegd, blijven de mechanismen die distale longreparatie in sommige omgevingen mogelijk maken - en die reparatie in andere uitsluiten - een gebied van intensief onderzoek5. De ontwikkeling van verbeterde in vitro platforms om de alveolus te modelleren zou studies van alveolaire biologie, regeneratie en therapeutica vergemakkelijken.

AEC2's vernieuwen zichzelf en differentiëren in AEC1's en worden dus beschouwd als de primaire stamcel van de distale long 6,7,8. Deze cellen vormen echter een bijzondere uitdaging voor in vitro studie gezien de moeilijkheden die gepaard gaan met het kweken van primaire AEC2's zonder verlies van fenotype9. In conventionele 2-dimensionale (2D) cultuur vlakken AEC2's af en nemen ze enkele kenmerken van AEC1-achtige cellen10 aan. Daarentegen ondersteunen 3D-kweekstrategieën, meestal organoïden, het behoud van gedifferentieerde kenmerken in primaire AEC2s 6,11,12 en maken langdurige kweek van pluripotente stamcel (PSC) -afgeleide AEC2s13,14 mogelijk. Organoïden zijn gebruikt om distale longontwikkeling15, virale infectie11,15 en AEC2-gerelateerde genetische ziekte 13,16,17 te modelleren, waardoor belangrijke inzichten in AEC2-biologie en regeneratie mogelijk worden. Deze kweekmodellen bestaan echter meestal uit slechts één of twee cellulaire afstammingslijnen en integreren de cellen in gel-type matrices die de architectuur of het ECM-substraat van de inheemse longalveolus niet kunnen samenvatten.

De ECM is een kritische regulator van celfenotype en gedrag via moleculaire, topologische en mechanische signalen; omvat een belangrijk onderdeel van weefselspecifieke niches die het lot van stamcellen reguleren; en dient als een reservoir dat de beschikbaarheid van lokaal uitgescheiden groeifactorenmoduleert 18,19,20,21. Het kweken van cellen op inheemse ECM kan dus het voorspellend vermogen van in vitro systemen vergroten om de biologie van in vivo weefsels te modelleren. Decellularisatie, een proces dat cellulair materiaal uit weefsels verwijdert via detergentia, enzymen of fysieke of andere methoden, kan de ECM-steigers van een inheems orgaan grotendeels behouden, wanneer zorgvuldig uitgevoerd22,23. Dergelijke steigers kunnen opnieuw worden bevolkt met cellen voor 3D-biomimetische cultuur. Hoewel gedecelluliseerde steigers veel worden gebruikt voor weefselmanipulatietoepassingen, is het gebruik ervan voor routinematige celkweek beperkt. Verschillende eerdere studies hebben de decellularisatie en recellularisatie van longplakken of kleine longweefselsegmenten gemeld. Naast proof-of-concept studies 24,25,26, zijn herbevolkte longplakken gebruikt om fibroblast-matrix adhesie 27,28 te bestuderen en om het effect van zieke longmatrices op fibroblastfenotype27,29 te onderzoeken. Met verbeterde technologieën die beschikbaar zijn voor het genereren van nauwkeurig gesneden weefselplakken, kunnen gedecellulariseerde longplakken een handig en kleinschalig platform bieden om cellen te kweken, met behoud van alveolaire, luchtweg- en vasculaire substructuren. Het opnemen van meerdere celtypen zou studies van cel-celinteracties binnen een fysiologisch relevante 3D-omgeving mogelijk maken. Er zijn echter verbeterde strategieën nodig om de behandeling van weefsels tijdens het kweekproces te vergemakkelijken en om te zorgen voor gecontroleerde en reproduceerbare zaaiing van weefsels met bekende aantallen cellen.

Hier presenteren we een protocol om gemanipuleerde longweefsels (ELTs) te genereren door gedecellulariseerde precisiegesneden longplakken (PCLS) opnieuw te bevolken met primaire endotheelcellen, AEC2's en fibroblasten. In een aanpassing van ons eerder beschreven gemanipuleerde hartweefselsysteem30 en hele longdecellularisatie-recellularisatiestrategieën 22,31, beschrijven we procedures om PCLS uit rattenlongen te snijden en de plakjes in herbruikbare weefselkweekcassettes te knippen die downstream-manipulaties vereenvoudigen en standaardiseren. Geknipte plakjes worden gedecellulariseerd om acellulaire ECM-steigers te vormen, die opnieuw worden bevolkt in aangepaste zaaibaden. Long slice scaffolds behouden kritische ECM-componenten en architectuur en ondersteunen de groei van AEC2's binnen multi-lineage alveolaire-achtige structuren gedurende ten minste 7 dagen. ELTs vertegenwoordigen een nieuw alveolair co-kweeksysteem binnen een fysiologisch relevante 3D-matrix, die de ontwikkeling van longweefseltechnologiestrategieën moet ondersteunen en tegelijkertijd fundamentele biologische studies van AEC2s en de alveolus moet vergemakkelijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproefprocedures die in dit artikel worden beschreven, zijn goedgekeurd door het Yale Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Creatie van weefselkweekcassettes en zaaibaden

OPMERKING: Eenmaal gemaakt, kunnen weefselkweekcassettes en zaaibaden worden geautoclaveerd en hergebruikt voor herhaalde rondes ELT-cultuur.

  1. Tissue KweekCassettes
    1. Gebruik een lasersnijder om weefselkweekcassetteframes en clips uit 3/32 inch dik polytetrafluorethyleen (PTFE) te snijden volgens de ontwerpen in respectievelijk aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2. Gebruik een lasersnijder om weefselkweekcassettetabs uit 1/16 inch dikke PTFE te snijden volgens aanvullend bestand 3. Snijlijnen 3x met 80% vermogen en 15% snelheid (voor een 30 W lasersnijder).
  2. Zaaibaden
    1. Gebruik de CAD-bestanden van het zaaibad (aanvullend bestand 4 en aanvullend bestand 5) om de basis en ring van de zaaibadvorm respectievelijk 3D te printen met behulp van heldere hars.
    2. Week de mallen in een oplossing van 10% poloxameer 407 in gedestilleerd water 's nachts voor gebruik om te helpen bij het vrijgeven van PDMS. Laat aan de lucht drogen, plaats de ring vervolgens over de basis van de mal en wikkel in flexibele plastic folie om lekken te voorkomen.
    3. Bereid ten minste 60 g per mal polydimethylsiloxaan (PDMS) door PDMS-elastomeer in een verhouding van 10: 1 te mengen met uithardingsmiddel en giet in de 3D-geprinte mal. Ontgas het PDMS gedurende 30 minuten in een vacuümdesiccator om eventuele luchtbellen te verwijderen.
    4. Bak zaaibaden op 60 °C gedurende 8 uur.

2. Bereiding van nauwkeurig gesneden longplakken van rattenlongen

  1. Orgaanoogst
    1. Bereid een gesplitst perfusiesysteem voor dat bestaat uit door zwaartekracht en pomp aangedreven ledematen, zoals afgebeeld in figuur 1. Sluit een longslagader (PA) canule aan op het einde van de buis, bestaande uit een 1/16 inch prikkeldraad Y-connector bevestigd aan een 1/2 inch lengte van LS 14 siliconen slang en een 3/32 inch vrouwelijke luer-lock connector (zie figuur 1). Bevestig op dit moment geen terugslagklep aan de canule.
    2. Prime de lijnen met PBS met respectievelijk 100 U/ml heparine en 0,01 mg/ml natrium nitroprusside (SNP) voor antistolling en vaatverwijding. Stel de perfusiepomp vooraf in op 30 ml/min.
      OPMERKING: Voeg SNP vers toe aan de heparine-oplossing en bescherm het tegen licht.
    3. Doseer een volwassen (8-12 weken oude, ongeveer 300-350 g) Sprague-Dawley rat met een intraperitoneale (IP) injectie van 400 U/kg heparine voor anti-stolling, gevolgd door een IP-injectie van ketamine (75 mg/kg) en xylazine (5 mg/kg) voor anesthesie. Bevestig een chirurgisch niveau van anesthesie via een gebrek aan reactie op schadelijke stimulus (teenknijpen).
    4. Trim de borst en buik van bont met behulp van tondeuses. Spray vervolgens met 70% ethanol en veeg 3x af met 10% povidon-jodium.
    5. Pak de huid onder het niveau van het diafragma met een rattentandtang. Maak vervolgens een 1/2 inch dwarse incisie in de huid met een fijnpuntige schaar. Pak de blootgestelde abdominale fascia vast met de tang, maak een 1/2 inch transversale incisie in de fascia en verleng vervolgens de incisie door de huid en fascia over de breedte van de bovenbuik.
    6. Gebruik de punt van de fijne schaar om een kleine incisie (niet meer dan 1/8 inch) in het midden van het voorste diafragma te maken, waardoor de longen zich terugtrekken in de thorax. Verleng de incisie in het diafragma over de volledige breedte van de borst.
    7. Maak twee verticale incisies door de volledige hoogte van de ribbenkast naar de nek, waarbij u voorzichtig bent om de longen niet te beschadigen. Verleng de incisie door de linkerribben om door het sleutelbeen en langs de zijkant van de nek te snijden tot het niveau van het strottenhoofd, waardoor de luchtpijp wordt blootgesteld.
    8. Ontleed de luchtpijp vrij van omringend bindweefsel en van de slokdarm. Maak een transversale incisie over de voorste helft van de luchtpijp tussen twee kraakbeenringen, dicht bij het strottenhoofd. Rijg een 4-0 polypropyleen hechting achter de luchtpijp, onder het niveau van de incisie, en knoop de eerste helft van de knoop van een chirurg losjes voor met twee draaiingen.
    9. Plaats een canule bestaande uit een 1/16 inch prikkeldraad Y-connecter aangesloten op een eenrichtingsterugslagklep en een 1/2 inch lengte LS 14 siliconen slang met een 3/32 inch vrouwelijke luer-lock connector (zie figuur 1) in de luchtpijp door één ledemaat van de Y-connector in de tracheale incisie in de richting van de longen te steken.
    10. Plaats de voorgebonden hechtlus rond de luchtpijp ter hoogte van de ingebrachte canule en draai rond de ingebrachte Y-connector om de canule op zijn plaats te houden. Voeg twee single-twist worpen van de hechting toe om de knoop te voltooien.
    11. Vul een spuit van 10 ml met lucht en sluit deze aan op de luervergrendeling van de tracheale canule.
    12. Klem de inferieure vena cava dicht bij het diafragma met behulp van een gebogen hemostat en injecteer het hart vervolgens met 150 U heparine (1000 U / ml) via de rechter ventrikel (RV).
    13. Open de zwaartekrachtlijnstopkraan gedeeltelijk om een langzame maar gestage druppeling van PBS/heparine/SNP uit de PA-canule te produceren, bereid in stap 2.1.1.
    14. Rijg de naald van een 4-0 polypropyleen hechting achter de basis van de PA waar deze de RV verlaat. Gebruik de eerste helft van de knoop van een chirurg om een losse lus van hechting rond de basis van de PA voor te binden.
    15. Maak een kleine incisie (niet meer dan 1/8 inch) in de RV net onder en loodrecht op de PA met behulp van een fijne schaar en steek vervolgens een ledemaat van de PA-canule Y-connector in de basis van de PA. Bevestig de hechting rond de PA en de ingebrachte connector en voeg een enkele draaiworp toe om de knoop van de chirurg te voltooien.
      OPMERKING: Het cannuleren van de PA-onderstroom voorkomt de introductie van luchtbellen in de vasculatuur die een adequate reiniging van de longen kunnen voorkomen.
    16. Bevestig een eenrichtingsklep aan het andere uiteinde van de PA-katheter Y-connector en snijd vervolgens de top van het hart af om de bloedstroomefflux via de linker ventrikel mogelijk te maken.
      OPMERKING: Het niet afsnijden van de top van het hart voorafgaand aan het perfuseren via de pomp kan schade aan de bloedgasbarrière veroorzaken, wat leidt tot lekkage van vloeistof in de luchtruimen.
    17. Schakel de perfusieleiding naar de pompzijde met behulp van de stopkraan die de twee leidingen verbindt en schakel vervolgens de pomp in op 30 ml / min. Tijdens het perfuseren van de longen via de PA, ventileer de longen handmatig via de 10 ml tracheale spuit bij ongeveer 10-15 ademhalingen / min, om het opruimen van de longen van bloed te vergemakkelijken. Perfuseer de longen totdat ze meestal wit worden, meestal met 40 ml PBS / heparine / SNP of minder.
      OPMERKING: Onvoldoende reiniging van de longen van bloed kan de downstream decellularisatie belemmeren.
    18. Snijd de achterste luchtpijp net boven het niveau van de tracheale canule en ontleed vervolgens de longen en het hart vrij van al het resterende bindweefsel en haal de longen en het hart en bloc eruit.
    19. Vul een spuit van 10 ml met 2% laag smeltpunt agarose in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) zonder fenolrood, voorgewarmd tot 42 °C.
      OPMERKING: Het exacte volume van agarose dat nodig is, varieert per longgrootte. Grotere longen (d.w.z. van ratten groter dan 400 g) hebben meer dan 10 ml agarose nodig.
    20. Blaas de geëxtraheerde longen 3x handmatig op met 10 ml lucht (d.w.z. tot ongeveer de totale longcapaciteit) via de luchtpijpcanule om ingeklapt parenchym te helpen rekruteren.
    21. Blaas de longen onmiddellijk op met de voorbereide spuit van agarose door de agarose handmatig te injecteren via de luchtpijpcanule met een snelheid van ongeveer 40 ml / min, net totdat de meest distale uiteinden van de longlobben zijn opgeblazen. Als distale delen van de longen ingeklapt blijven, injecteer dan een extra 1-2 ml agarose.
    22. Sluit de luchtpijp af door de witte dop van een 4-weg stophaan aan het vrouwelijke luerslot van de tracheale canule te bevestigen. Plaats de long in een petrischaaltje van 150 mm op ijs om de agarose te laten stollen.
      OPMERKING: Inflatie van de long kort na extractie is van cruciaal belang om een uniforme vulling van het longparenchym en daaropvolgende succesvolle weefselsnijdeling te garanderen. Als de long zeer ongelijkmatig opblaast, ga dan niet verder met longsnijden, omdat de kwaliteit van de plakjes slecht zal zijn.
  2. Longsnijwerk
    OPMERKING: De exacte snijprocedure moet mogelijk worden aangepast op basis van de trilmicrotoom (vibratome) die wordt gebruikt; aanvullende voorbeelden van PCLS-bereiding met verschillende weefselsnijders zijn eerder gepubliceerd 32,33,34.
    1. Koel het metalen koelblok voor op -20 °C en houd het ijs aan wanneer het niet wordt gebruikt tijdens de snijprocedure.
    2. Gebruik een kleine druppel cyanoacrylaatlijm om een mes aan de meshouder te bevestigen. Bevestig de meshouder voorzichtig aan het vibratoom met behulp van een inbussleutel, zodat deze gewoon in lijn komt met het uiteinde van een monsterbuis die in de bufferbak is geplaatst.
    3. Bereid 6-well borden met 3 ml per goed steriele ijskoude HBSS zonder fenolrood om de plakjes te verzamelen.
    4. Snijd met behulp van een scalpel een stuk longweefsel van ongeveer 1-1,5 cm3.
      OPMERKING: Longweefsel uit de onderste en middelste delen van de linkerkwab, evenals uit de rechter midden- en onderkwabben, levert het gemakkelijkst grotere weefselplakken op die het alveolaire gebied maximaliseren. Als er niet-opgeblazen weefselgebieden of gebieden van bindweefsel aanwezig zijn, knipt u dit weefsel af met een schaar of richt u zich naar beneden in de richting van de zuiger; dergelijk weefsel heeft de neiging om niet schoon te snijden.
    5. Plaats een klein druppeltje cyanoacrylaatlijm op de zuiger van de monsterbuis. Dep longweefsel op een papieren doekje om overtollig vocht te verwijderen en plaats het longweefsel onmiddellijk op de zuiger met behulp van een tang.
    6. Schuif de metalen buis van de monsterbuis tot het niveau van de bovenkant van het weefsel en houd deze op zijn plaats, met de zuiger teruggetrokken. Pipet voorverwarmd 2% agarose in HBSS in de bovenkant van de buis om het weefsel volledig te omringen.
    7. Plaats het ijskoude koelblok ongeveer 1 min rond het weefsel om de agarose te laten stollen.
    8. Plaats de monsterbuis in de bufferlade. Vul de bak met ijskoude PBS tot halverwege het weefselblok. Draai de schakelaar van de motorkast naar fast forward (FF) om de motorboxzuiger vooruit te helpen, zodat deze alleen de basis van de monsterbuis raakt.
    9. Stel de gewenste instellingen in voor plakdikte, snijsnelheid en oscillatiefrequentie, bijvoorbeeld 450 μm dikte, snelheid 4 en oscillatiefrequentie 5. Selecteer Continue modus en zet de schakelaar op Aan om te beginnen met snijden.
    10. Als plakjes weefsel in de bufferbak vallen, breng ze dan over naar de bereide 6-wells platen met behulp van een entende lus of spatel.
    11. Stop met snijden wanneer ~ 2 mm dikte van weefsel in de monsterbuis achterblijft, om te voorkomen dat het mes wordt beschadigd of weefsel met lijm wordt gesneden.
    12. Herhaal de bovenstaande stappen om extra longweefsel te snijden, zoals gewenst.
    13. Decellulariseer plakjes onmiddellijk voor steigerbereiding, of vries ze in en bewaar ze maximaal 2 maanden bij -80 °C. Om in te vriezen, breng 4-6 plakjes over naar een petrischaaltje van 35 mm en zuig voorzichtig overtollig vocht uit de plakjes. Plaats de gerechten in een bad van droogijs en 100% ethanol om in te vriezen, wikkel ze in folie, sluit ze af in een plastic zak en breng ze over op -80 °C.
      OPMERKING: Plaats verse plakjes niet rechtstreeks in een vriezer van -80 °C, omdat de relatief langzame bevriezingssnelheid ijskristallen kan veroorzaken die het weefsel kunnen beschadigen.

3. Voorbereiding van longweefselsteigers

  1. Voorbereiding van materialen en decellularisatieoplossingen
    1. Autoclaaf frames, clips en tabbladen.
    2. Bereid decellulaire oplossingen voor zoals beschreven in tabel 1.
      OPMERKING: Voeg benzonasenuclease toe aan de voorverwarmde buffer onmiddellijk voor gebruik en steriel filter. Bereid Triton X-100 en natriumdeoxycholaat (SDC) oplossingen binnen 24-48 uur na de decellularisatieprocedure. Bereid antibiotica/antimycotische oplossingen en benzonasebuffer tot 30 d van tevoren en bewaar bij 4 °C.
  2. Longplakken snijden en knippen
    OPMERKING: Hoewel het snijden en knippen niet-steriel op het tafelblad kan worden gedaan, moeten de decellulaire stappen in paragraaf 3.3 en alle daaropvolgende hantering van de weefselsteigers worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap.
    1. Vul een petrischaaltje van 100 mm ongeveer een derde vol met PBS. Breng cassettes (frames met elk twee clips) en lipjes over naar de schotel met behulp van een tang.
    2. Als u bevroren plakjes gebruikt, ontdooit u één gerecht per keer door PBS op kamertemperatuur in het gerecht te gieten om de plakjes te bedekken. Bewaar de resterende gerechten op droogijs.
    3. Breng een ontdooide plak over in een petrischaaltje van 150 mm. Vouw het plakje voorzichtig uit met behulp van een fijne tang, indien nodig, zodat het plat ligt, en zuig vervolgens voorzichtig overtollige PBS uit rond het weefsel.
    4. Gebruik een scheermesje, met een liniaal als leidraad, om een strook van 3 mm breed uit de plak te snijden door de volledige lengte van het mes stevig tegen de schaal te drukken en het iets van links naar rechts te wiegen met de mesrand op zijn plaats gehouden. U kunt ook een roterende snijder gebruiken die achteraf is uitgerust met 2 parallelle messen, gescheiden door een op maat gemaakte afstandhouder van 3 mm (bijv. gemaakt van acetaal [polyoxymethyleen]) om weefselstroken te snijden. Vermijd scheuren, gaten, grote luchtwegen of bloedvaten of dik bindweefsel.
      OPMERKING: Voor succesvol knippen moet de strip minstens 9 mm lang zijn.
    5. Breng de weefselstrip met behulp van een tang over op de voorbereide petrischaal van 100 mm.
    6. Knip de tissue strip in de cassette: drijf het weefsel boven de cassette en centreer het weefsel om de gaten in de clips aan beide uiteinden te overhangen. Plaats met een fijne tang een lipje gedeeltelijk in het gat aan het ene uiteinde, maak het weefsel voorzichtig recht en plaats vervolgens het tweede lipje. Gebruik een tang in elke hand en druk elk lipje volledig in om het weefsel vast te zetten.
      OPMERKING: Als u moeite heeft om het weefsel op zijn plaats te houden voordat u gaat knippen, zuig dan wat PBS uit de schaal om het vloeistofniveau te verlagen. Zorg ervoor dat u het weefsel niet uitrekt bij het plaatsen van de tweede clip, omdat dit kan leiden tot scheuren.
    7. Herhaal de ontdooi-, snij- en knipprocedure in stap 3.2.2-3.2.6 voor zoveel weefsels als gewenst.
  3. Decellularisatie van segmenten
    1. Zodra alle plakjes zijn geknipt, brengt u de schotel van 100 mm met de cassettes over op een laminaire stromingskap.
    2. Begin met stap 1 van het decellularisatieprotocol (zie tabel 2): gebruik een gebogen hemostaat om de ingekerfde zijden van elke cassette vast te pakken, breng cassettes over naar 6-well platen (2 weefsels / put) gevuld met 3 ml PBS + ionen + antibiotica / antimycotica per put (zie oplossingsrecept in tabel 1).
    3. Plaats putplaten op een orbitale shaker bij 30 rpm gedurende 10 min.
    4. Ga verder met stap 2 van het decellularisatieprotocol (zie tabel 2): aspirateer de vloeistof uit elke put, vervang deze door 3 ml / put PBS + ionen, plaats de plaat op orbitale shaker bij 30 tpm en incubeer gedurende 5 minuten.
    5. Herhaal stap 3.3.4 voor elk van de oplossingen en de overeenkomstige duur zoals beschreven in het decellularisatieprotocol in tabel 2.
    6. Breng na de laatste spoelstap met PBS + antibiotica/antimycotica (stap 20 van tabel 2) weefsels over naar steriele 6-wells platen met verse PBS + antibiotica/antimycotica en incubeer bij 37 °C gedurende 48 uur.
      OPMERKING: Na sterilisatie met antibiotica/antimycotica kunnen longweefselsteigers onmiddellijk worden gezaaid of bij 4 °C worden bewaard gedurende maximaal 30 d.

4. Slice Recellularization en Cultuur

OPMERKING: Figuur 2 toont een voorgestelde tijdlijn voor weefselzaaien en -cultuur, waarin plakjes eerst worden gezaaid met microvasculaire endotheelcellen van rattenlongen en gekweekt in endotheelmedium met een laag serum; vervolgens bezaaid met ratten-AEC2's en rattenlongfibroblasten met een serumvrij AEC2-groeimedium (aangepast van Jacob et al.13 en You et al.35); zie aanvullende opmerkingen over celbronnen die worden gebruikt in Resultaten en cultuurmediagegevens in tabel 3. Deze strategie levert alveolaire-achtige structuren op die AEC2-monolagen bevatten.

  1. Tissuesteigers voorbereiden voor het zaaien (dag -4 of -3)
    1. Als u weefselsteigers gebruikt die bij 4 °C zijn opgeslagen, incubeer de scaffolds dan 's nachts bij 37 °C met verse PBS + antibiotica/antimycotica (10% penicilline/streptomycine, 4% amfotericine B, 0,4% gentamicine in PBS) voorafgaand aan het zaaien.
    2. Spoelsteigers 3x met steriele PBS (5 ml/put), elk 5 min.
    3. Onderzoek steigers onder een fasecontrastmicroscoop bij 5x vergroting om weefsels te selecteren voor zaaien.
      OPMERKING: De beste steigers voor het zaaien hebben geen scheuren of gaten en bevatten geen grote luchtwegen of bloedvaten. Hoewel steigers met de kenmerken met succes kunnen worden gezaaid, kunnen herbevolkingspatronen verschillen van die waargenomen in alveolaire gebieden.
  2. Endotheelcel zaaien (dag -3)
    1. Tel endotheelcellen met behulp van een hemocytometer en bereid de endotheelcelsuspensie voor in endotheelmedium (zie tabel 3) bij 5 x 106 cellen / ml, met voldoende cellen om 500.000 endotheelcellen per plak te zaaien (bijv. Voor 12 plakjes resuspendeer 6 x 106 cellen in 1,2 ml medium).
    2. Plaats geautoclaveerde zaaibaden in petrischalen van 100 mm. Breng gespoelde steigers ondersteboven over naar zaaibaden: gebruik een fijne gebogen hemostaat om een cassette aan de ingekerfde zijden te grijpen, gebruik een rechte hemostaat of tang om het ene uiteinde van de cassette vast te pakken (pas op dat u het weefsel zelf niet aanraakt) en draai om, en pak de cassette vervolgens opnieuw vast met de uiteinden van de fijne gebogen hemostaat via de gaten langs de ingekerfde zijden, en plaats in een zaaibad goed. Herhaal dit voor de resterende cassettes.
      OPMERKING: Wanneer correct geplaatst, zullen steigers ondersteboven in de bodem van elke put worden gecentreerd. Druk indien nodig zachtjes op de hoek van de cassette met de uiteinden van een hemostat om ervoor te zorgen dat de cassette plat in de put zit. Onjuiste plaatsing van de cassette kan leiden tot slechte weefselzaaiing. Het is acceptabel als de put een kleine hoeveelheid PBS bevat.
    3. Draai de voorbereide celsuspensie voorzichtig om te mengen en gebruik vervolgens een handmatige pipet om 100 μL-cellen direct bovenop elk weefsel aan de basis van het putje te pipetteren, waarbij u voorzichtig bent om het weefsel niet te beschadigen met de pipetpunt.
    4. Breng gezaaide weefsels over naar de celkweekincubator bij 37 °C/5% CO2.
    5. Voeg na 2 uur 900 μL voorverwarmd kweekmedium toe aan elke put met behulp van een handmatige pipet en keer terug naar de incubator. Als een cassette bij het toevoegen van medium wordt losgemaakt (drijft), druk dan voorzichtig met de pipetpunt op de hoek van de cassette zodat deze plat in de put ligt.
    6. Verander medium op dag -2. Verwijder medium door de petrischaal te kantelen en handmatig te pipetteren met een pipetpunt die licht in de hoek van de put is geplaatst, om de cassette niet te verstoren. Vervang door 1 ml vers endotheelmedium per put.
  3. AEC2 en Fibroblast Zaaien en Weefselkweek (Dag 0)
    1. Tel AEC2's en fibroblasten met behulp van een hemocytometer. Bereid een 1:1 celsuspensie van AEC2's en fibroblasten in AEC2-groeimedium (epitheelbasismedium + AEC2-supplementen; zie tabel 3) bij 5 x 106 totale cellen / ml, met voldoende cellen om 500.000 cellen (250.000 AEC2's en 250.000 fibroblasten) per plak te zaaien (bijv. Voor 12 plakjes resuspendeer 3 x 106 AEC2's + 3 x 106 fibroblasten samen in 1,2 ml medium).
    2. Pipetteer het medium uit elke put van het zaaibad zoals beschreven in stap 4.2.6. Draai de voorbereide celsuspensie voorzichtig om te mengen en pipetteer vervolgens 100 μL-cellen direct bovenop elk weefsel aan de basis van de put.
      OPMERKING: Het is acceptabel als een kleine hoeveelheid endotheelmedium in de put blijft voorafgaand aan het zaaien van AEC2 / fibroblast.
    3. Breng gezaaide weefsels over naar de celkweekincubator bij 37 °C/5% CO2.
    4. Voeg na 2 uur 900 μL voorverwarmd AEC2-groeimedium toe aan elke put en keer terug naar de incubator.
    5. Bereid na 24 uur cultuur (dag 1) een 12-wells plaat met 1 ml voorverwarmd AEC2-groeimedium per putje per cassette.
    6. Pipetteer 800 μL medium uit elke put van het zaaibad. Verwijder cassettes uit het zaaibad: pak elk met een fijne gebogen hemostaat via de gaten langs de ingekerfde zijden, breng over op een rechte hemostat of tang om de cassette aan het ene uiteinde vast te pakken en om te draaien, gebruik vervolgens de gebogen hemostaat om de cassette via de gekerfde zijden vast te pakken en breng rechtsboven, één per put, over op de voorbereide 12-well plaat.
    7. Verander het kweekmedium in de 12-wellsplaat om de andere dag tot dag 7 of voor de gewenste lengte van de cultuur: gebruik een glazen Pasteur-pipet om het medium uit elke put te zuigen, voorzichtig om het weefsel niet aan te raken; pipet in 1 ml vers AEC2 groeimedium per put.
      OPMERKING: De mate van weefselherbevolking kan worden gecontroleerd via fasecontrastmicroscopie bij 5x vergroting gedurende de duur van de kweek.

5. Weefseloogst en monsteranalyse

  1. Om ELT's voor histologie en immunofluorescente kleuring te fixeren, brengt u weefselkweekcassettes over naar 10% neutraal gebufferd formaline en incubeert u gedurende 3-4 uur bij kamertemperatuur op een rocker. Verwijder tissues van cassettes door de punt van een fijnpuntige tang te gebruiken om het weefsel te snijden waar het de lipjes ontmoet. Verwerk weefsel volgens routinemethoden voor paraffine-inbedding en histologie; er zijn geen gespecialiseerde technieken vereist.
  2. Om ELT's voor qRT-PCR te verwerken, spoelt u weefsels in cassettes in PBS 2x, verwijdert u vervolgens weefsels en klikt u invriezen of gaat u verder met lysis voor RNA-extractie.
    OPMERKING: Het poolen van ten minste 2 plakjes gezaaid met 1 x 106 cellen en gekweekt gedurende 7 dagen moet voldoende RNA opleveren voor downstream PCR-analyse.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een overzicht van het proces om ELT's te genereren - bestaande uit longslicing, slice clipping en decellularization, en scaffold repopulatie - is weergegeven in figuur 3. De HIER GEPRESENTEERDE ELTs werden gekweekt met behulp van primaire microvasculaire endotheelcellen van rattenlongen (zie Materiaaltabel), neonatale ratten-AEC2's en lipofibroblast-verrijkte neonatale rattenlongfibroblasten36. AEC2's werden vers geïsoleerd via magnetische op kralen gebaseerde sortering zoals eerder beschreven37; alternatieve isolatieprotocollen zijn gedetailleerd en elders besproken 38,39,40. De zuiverheid van geïsoleerde AEC2's bij ratten kan worden beoordeeld via flowcytometrie voor ratspecifieke AEC2-oppervlaktemarker RTII-7041, of via kleuring van een cytocentrifugeerd celmonster voor RTII-70 of pro-oppervlakteactieve eiwit C (pSPC). Rattenlongfibroblasten werden geïsoleerd van postnatale dag 7-9 rattenpups volgens een aanpassing van een gepubliceerd protocol42 en gebruikt bij passage 1-2; alternatieve isolatieprotocollen zijn elders beschreven 43,44. De zuiverheid van geïsoleerde fibroblasten kan worden beoordeeld via kleuring van gekweekte of cytocentrifuged cellen voor mesenchymale marker vimentine, en lipofibroblastverrijking kan worden beoordeeld via kleuring voor Oil Red O45.

Wanneer het longweefsel gelijkmatig wordt opgeblazen met agarose en weefselstukken strategisch zijn geselecteerd en georiënteerd voor het snijden om het totale en parenchymale weefseloppervlak te maximaliseren, kan één rattenlong weefsel opleveren voor >100 alveolaire ELTs. Stroken PCLS vertonen voldoende mechanische integriteit om in weefselcassettes te worden geknipt met weinig (<5%) gevallen van scheuren (figuur 3B).

Het protocol voor het decellulariseren van longplakken is nauw gebaseerd op ons eerder gepubliceerde hele longdecellularisatieprotocol, waarvan door kwantitatieve proteomics werd aangetoond dat het veel ECM-componenten behoudt op niveaus die niet significant verschillen van die in de inheemse long22. Gedecellulariseerde plaksteigers behouden de inheemse architectuur van de longblaasjes, zoals gezien door hematoxyline en eosine (H &E) kleuring (figuur 4A, B) en door fasecontrastmicroscopie (figuur 4C). We sluiten meestal steigers uit met grote luchtwegen of bloedvaten (figuur 4D) of scheuren, hoewel de eerste kunnen worden opgenomen als ze van belang zijn voor de onderzoeker. Decellularisatie leidt tot een vermindering van het WEEFSEL-DNA-gehalte met 96%, gemeten door een test voor dubbelstrengs DNA (zie Materiaaltabel; 0,50 μg/mg ± 0,073 μg/mg vs 0,018 μg/mg ± 0,0035 μg/mg in respectievelijk inheems versus gedecellulariseerd weefsel, gemiddelde ± SEM) (Figuur 5A), zonder DNA zichtbaar door hematoxylinekleuring (figuur 4B). Histologische en immunofluorescente kleuring van gedecellulariseerde steigers onthult onderhoud van ECM-eiwitten collageen, elastine, collageen IV en laminine met architectuur en hoeveelheid vergelijkbaar met die in inheemse longplakken (figuur 5B-E). Merk op dat de kernen van inheemse weefsels blauw / zwart kleuren met trichoom (voor collageen) en EVG (voor elastine) vlekken. Immunofluorescente kleuring werd uitgevoerd zoals eerder beschreven, met behulp van standaardmethoden voor het kleuren van weefsels37. De gebruikte antilichamen en hun respectieve concentraties zijn vermeld in tabel 4.

Succesvolle herbevolking van steigers leidt na 7 dagen tot zeer cellulaire ELT's, met een alveolair-achtig herbevolkingspatroon zichtbaar door lichtmicroscopie (figuur 6A-C). In sommige gevallen, met een zeer hoge cellulariteit, kunnen organoïde-type structuren zichtbaar zijn (figuur 6A,B). Mislukte weefselzaaiing kan worden gevisualiseerd door fasecontrastmicroscopie tijdens het kweken (figuur 6C). Na het kweken van weefselsteigers met AEC2's, fibroblasten en endotheelcellen, worden ELTs dicht herbevolkt met alveolaire structuren die alle drie de cellijnlijnen omvatten (figuur 6D, E). Op dag 7 of 8 behouden AEC2's een kubusvormige morfologie en drukken ze oppervlakteactieve eiwitten-B (SPB) en lamellair lichaamseiwit ABCA3 uit, zonder bewijs van significante differentiatie naar AEC1's (figuur 6E, F). AEC2's zijn zeer proliferatief in ELTs, zoals aangetoond door 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) incorporatie na een puls van 2 uur bij 10 μM (figuur 6G).

figure-results-1
Figuur 1: Schematische weergave van het perfusiesysteem voor longextractie en -clearing. (A) Het perfusiesysteem bestaat uit een door de zwaartekracht aangedreven ledemaat, gebruikt voor de initiële cannulatie van de longslagader onder stroming; en een pompaangedreven ledemaat, gebruikt om de longen efficiënt te reinigen na de eerste cannulatie. De pompleiding bevat een "pulsdemper" die de pieken in druk veroorzaakt door de pomp dempt. Het ontwerp van de tracheale en pulmonale arteriële canules is links gedetailleerd. SNP = natrium nitroprusside. (B) Details van de assemblage van de pulsdemper. BPT en siliconen verwijzen naar soorten slangen. (C) Posities van tracheale en pulmonale arteriële canules geplaatst tijdens longextractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Cultuurtijdlijn voor tri-lineage recellularisatie. Voorgestelde tijdlijn voor tri-lineage ELT-zaaien en -cultuur, inclusief timing van tweefasig zaaien. Celnummers voor het zaaien en kweekmedium voor elke fase worden aangegeven. Zie de details van de cultuurmedia in tabel 3. AEC2 = alveolaire epitheliale type 2 cel. EC = endotheelcel. FB = fibroblast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Schematische samenstelling van de voorbereiding van het longweefsel. (A) Inheems longweefsel wordt in plakjes gesneden met behulp van een vibratoom. (B) Nauwkeurig gesneden longplakken worden gesneden in gestandaardiseerde stroken van 3 mm breed, geknipt in polytetrafluorethyleen (PTFE) weefselkweekcassettes en detergent-gedecellulariseerd om acellulaire extracellulaire matrixsteigers te verkrijgen. (C) Steigers worden opnieuw ingezaaid in gespecialiseerde zaaibaden die het zaaigebied beperken tot het gebied van het weefsel en vervolgens gekweekt in een standaard putplaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Structuur van gedecelluliseerde longsteigers. H&E-kleuring van inheemse (A) en gedecellulariseerde (B) longplakken met behoud van alveolaire architectuur na decellularisatie. (C,D) Voorbeelden van gedecelluliseerde ECM-steigers bekeken bij 5x vergroting door fasecontrastmicroscopie, voornamelijk bestaande uit alveolair weefsel (C) of met grote vertakkende luchtwegen en bloedvaten (D, zwarte en rode pijlpunten). Schaalstaven, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: DNA-verwijdering en matrixconservering in gedecellulariseerde longsteigers. (A) Kwantificering van DNA in inheemse en gedecellulariseerde longplakken (gemiddelde ± SEM, n = 5). Welch's t test, **P < 0,01. Decell = gedecellulariseerd. (B,C) Histologische kleuring van inheemse en gedecellulariseerde longplakken voor collageen (B) en elastine (C). Pijlpunten, elastine bewaard in alveolaire ingangsringen van gedecelluliseerd weefsel. (D,E) Immunofluorescente kleuring van inheemse en gedecellulariseerde longplakken voor collageen IV (D) en laminine (E). Schaalbalken, 50 μm. In alle deelvensters schetsen gestippelde vakken het afbeeldingsgebied dat in elk deelvenster rechts wordt vergroot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Cellulaire herbevolking van gemanipuleerde longweefsels. (A-C) Voorbeelden van gerecellulariseerde ELT's op dag 7 van de kweek, zoals gevisualiseerd tijdens kweek door fasecontrastmicroscopie. Het recellularisatiepatroon weerspiegelt de alveolaire structuur van het weefsel. In sommige gebieden met een hoge cellulariteit kunnen organoïde-achtige structuren zich vormen (pijlpunten). (A) en (B) vertegenwoordigen succesvolle celherbevolking, terwijl (C) een slecht niveau van recellularisatie vertegenwoordigt na 7 dagen cultuur. (D-G) Kleuring van gerecelluliseerde ELT's op dag 7 of 8 van de cultuur. (D) H&E-kleuring die cellulaire herbevolking van de alveolaire septa laat zien. (E) Immunofluorescente kleuringsetiketten getransplanteerde proCollagenIα1+ fibroblasten, ABCA3+ AEC2's en CD31+ endotheelcellen. (F) Weefsels bevatten overvloedige SPB+ AEC2's, maar weinig RTI-40 (podoplanine)+ AEC1's onder deze omstandigheden. (G) Veel AEC2's vermenigvuldigen zich in ELTs, zoals gemeten door EdU-integratie. Schaalstaven, 500 μm (A-C); 25 μm (D-G). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Decellularisatie oplossingen. Voorbereidingsdetails voor decellularisatieoplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Decellularisatieprotocol. Details van het protocol voor het decellulariseren van longplakken. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Cultuurmedia. Voorbereidingsdetails voor endotheel- en AEC2-groeimedia. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Antilichamen die worden gebruikt voor immunostaining. Details van antilichamen en hun concentraties die worden gebruikt voor immunostaining. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Ontwerp voor het lasersnijden van weefselkweekcassetteframes. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: Ontwerp voor het lasersnijden van weefselkweekcassetteclips. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3: Ontwerp voor het lasersnijden van weefselkweekcassettetabs. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 4: CAD-bestand voor het zaaien van badschimmelbasis. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 5: CAD-bestand voor het zaaien van badvormring. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft het gebruik van gedecellulariseerde precisiegesneden longplakken als een platform om in vitro gemanipuleerde longweefsels te genereren, die alveolaire structuren met meerdere afstammingslijnen bevatten. Door strategieën te combineren die we eerder hebben ontwikkeld om high-fidelity acellulaire ECM-longsteigers voor hele longtechnologie22,31 opnieuw te bevolken met ons robuuste systeem voor het kweken van kleinschalige gemanipuleerde hartweefsels30, maakt dit protocol het gebruik van fysiologisch relevante long-ECM als weefselkweeksubstraat mogelijk, op een herhaalbare en matige doorvoer.

De hier gepresenteerde methoden beschrijven ELT-steigerpreparaat uit rattenlongen, die gemakkelijk haalbaar zijn, kunnen worden geëxtraheerd met directe toegang tot intacte luchtwegen voor agarose-inflatie en zijn van grotere omvang dan muizenlong. Elk longweefsel dat kan worden opgeblazen met agarose en plakjes van ten minste 9 mm lang, mag echter binnen dit systeem worden gebruikt. Ongeacht de weefselbron is uniforme inflatie van het longweefsel met agarose de meest kritieke stap om het succes van downstream weefselsnijden, knippen en weefselbehandeling te garanderen. Ondergepompt longweefsel heeft de neiging om niet schoon te snijden, terwijl overgepompt weefsel kan scheuren tijdens het knippen. Na agarose-gelatatie zijn op de juiste opgeblazen weefselgebieden stevig, maar geven ze een beetje wanneer ze zachtjes met een tang worden ingedrukt. Voor intacte rattenlongen ontdekten we dat het meerdere keren opblazen van de geëxtraheerde longen met lucht, gevolgd door agarose-inflatie zo snel mogelijk na extractie, resulteert in de beste snijresultaten en de beste kwaliteit van de resulterende weefselsteigers. Het juiste volume agarose moet empirisch worden geoptimaliseerd; voor een rattenlong is het volume dat nodig is om de long op te blazen tot de totale longcapaciteit ongeveer 30 ml/kg dierlijke massa (bijv. 10,5 ml agarose voor longen van een rat van 350 g). Voor grotere gereseceerde longweefsels met minder eenvoudige toegang tot de luchtwegen (zoals die van menselijke donoren), kan enige aanvullende probleemoplossing nodig zijn om het weefsel op te blazen via een bronchus32. Tijdens het daaropvolgende longsnijden is de selectie en oriëntatie van het weefsel op de zuiger een andere belangrijke stap om 1) ervoor te zorgen dat de plakjes groot genoeg zijn om weefselstroken te genereren die in weefselkweekcassettes kunnen worden geknipt en 2) parenchymaal (alveolair) weefselgebied te maximaliseren, met uitzondering van grote luchtwegen of bloedvaten.

Het knippen van de PCLS in weefselkweekcassettes kan in eerste instantie een uitdagende stap zijn, maar de cassettes vereenvoudigen de weefselverwerking tijdens decellularisatie en zaaien aanzienlijk. Twee mogelijke problemen die zich kunnen voordoen zijn weefselscheuren (tijdens het proces van knippen of tijdens decellularisatie), of weefselpositionering in de clips die resulteert in slecht stroomafwaarts zaaien (bijvoorbeeld geen zaaien of zaaien alleen aan de uiteinden). Scheuren kan het gevolg zijn van agarose overinflatie, overbelasting van het weefsel tijdens het inbrengen van tabs of het achterlaten van te weinig overhang om voldoende weefselgreep te bieden bij het inbrengen van de lipjes. Merk op dat plakjes die aan één clipuiteinde scheuren met succes kunnen worden gezaaid, maar ze zijn moeilijk te visualiseren onder de microscoop tijdens het kweken omdat het weefsel niet plat is. Slechte weefselzaaiing (zoals die in figuur 6C) is waarschijnlijk het gevolg van het feit dat het plakje niet plat tussen de twee clips ligt en dus slecht contact maakt met de basis van het zaaibad wanneer het ondersteboven wordt gekeerd. Een andere mogelijke oorzaak is het onjuist plaatsen van de cassette in de bodem van het zaaibadput. In termen van knippen, breng iets meer spanning in het weefsel aan bij het plaatsen van de tweede clip om het plat te laten liggen. Sommige plakjes hebben een lichte concaviteit; knip in deze gevallen het plakje met de bolle kant naar boven. Met oefening ervaren we meestal mislukt zaaien met minder dan 2% van de plakjes.

Een beperking van dit protocol is de vereiste voor sommige gespecialiseerde apparatuur - een lasersnijder en een 3D-printer - om de eerste materialen voor ELT-voorbereiding te genereren. Zodra de weefselkweekcassettes en zaaibaden zijn gemaakt, zijn er echter geen extra speciale materialen nodig. De longsnij- en decellularisatiestappen van ELT-steigervoorbereiding zijn matig tijdrovend; deze stappen kunnen echter van tevoren worden uitgevoerd, of in aantallen die voldoende zijn om zich voor te bereiden op meerdere experimenten tegelijkertijd. Veel PCLS (>100 als optimaliseren voor parenchymale regio's) kunnen uit een enkele long worden gesneden en worden ingevroren voor later gebruik. Hoewel een enkele vries-dooicyclus kleine ultrastructurele schade aan de ECU46 kan veroorzaken, is aangetoond dat zelfs meerdere vries-dooicycli geen significant verlies in ECU23,47 veroorzaken. PCLS kan ook worden geknipt en gedecellulariseerd voorafgaand aan een experiment, om binnen een maand te worden gebruikt. (Met name kan het beschreven decellularisatieprotocol in ongeveer 6 uur worden bereikt, wat een aanzienlijk voordeel vertegenwoordigt ten opzichte van eerder beschreven methoden die een dag of meervereisen 27,28.) Zodra de steigers zijn voorbereid, is het celzaaiproces eenvoudig en snel en vereist de cultuur van ELTs geen gespecialiseerde technieken.

Een voorbehoud bij de beschreven ELT-methode is het ontbreken van regiospecifieke zaaiing, d.w.z. de levering van AEC2's specifiek aan de alveolaire ruimte, of endotheelcellen specifiek aan de vasculaire ruimte. Niettemin, hoewel cellen eenvoudig bovenop de weefselsteigers worden gezaaid, is het patroon van recellularisatie niet-willekeurig, met enige schijn van alveolaire organisatie, inclusief epitheliale ringen. We vermoeden dat cel-celinteracties, evenals lokale verschillen in ECM-samenstelling en geometrie20,21, waarschijnlijk bijdragen aan de waargenomen recellularisatiepatronen. Ter ondersteuning van deze hypothese toonde een eerder gepubliceerde studie, waarin fibroblasten niet-specifiek op gedecellulariseerde longplakken werden gezaaid, aan dat het patroon van weefselherbevolking en geassocieerde cellulaire fenotypen significant varieerde per microscopisch weefselgebied en ECM-steigerbron (bijv. Gezond versus ziek)27. Fibroblasten werden ook waargenomen om binnen te dringen in het interstitium - de locatie waar ze zich in het inheemse longweefsel bevinden 1,27. De primaire alternatieve methode die we ons kunnen voorstellen om cellen op longplakken op een echt regiospecifieke manier te kweken, zou inhouden dat intacte gedecellulariseerde longen via de luchtwegen31,48 en vasculaire compartimenten 49,50 wordengezaaid en vervolgens het gerecellulariseerde weefsel wordt gesneden. Dit alternatief 1) is echter aanzienlijk kosten-, tijd- en middelenintensiever; 2) is lagere doorvoer; 3) vereist een groter aantal dieren; en 4) wordt geassocieerd met een verhoogd risico op besmetting als gevolg van de uitdagingen van de hele longkweek en het daaropvolgende snijden van de gezaaide long. Hoewel het ELT-platform niet alle aspecten van native cellulaire organisatie samenvat, maakt het longcelkweek mogelijk op een fysiologisch relevant ECM-substraat, op een manier die toegankelijk is voor veel meer laboratoria.

De flexibiliteit van het ELT-systeem is een groot voordeel van dit platform en zou kleinschalige longweefselkweek met een willekeurig aantal weefselsteigers, cellen of kweekmedia van belang moeten maken. Het gebruik van steigers afgeleid van ziek weefsel of van verwondingsmodellen kan de studie van cel-cel- of cel-matrixinteracties in de setting van ziekteveranderde ECM 27,29,51 mogelijk maken. Houd er echter rekening mee dat het decellularisatieprotocol mogelijk moet worden aangepast om rekening te houden met matrixverschillen tussen soorten52. De beschreven zaaistrategie kan voor elk celtype worden gebruikt en de kweektijdlijn kan worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker. Als uitgangspunt geldt dat 1 x 106 cellen per steiger binnen 7 dagen na kweek een zeer cellulair weefsel moeten opleveren, terwijl 1 x 105 totale cellen resulteren in een slechte cellulariteit. Bij elke aanpassing van de tijdlijn moeten de weefselkweekcassettes 24 uur na het laatste zaaien uit het zaaibad worden verwijderd. Hier, met het doel om een deel van de cellulaire complexiteit van de longalveolus te modelleren, beschrijven we een tri-cultuur recellularisatiestrategie die het onderhoud van goed gedifferentieerde neonatale AEC2's in alveolaire structuren gedurende ten minste 7 dagen ondersteunt. Onze resultaten tonen ook de succesvolle engraftment van zowel fibroblasten als endotheelcellen binnen ELTs, waarbij de brede toepasbaarheid van het kweeksubstraat en de geschiktheid ervan voor co-kweekstudies wordt benadrukt. Het zaaien van volwassen cellen in ELTs kan de modellering van meer rustige alveolaire structuren vergemakkelijken, terwijl het zaaien van van menselijke PSC afgeleide AEC2's, inclusief die met genetische modificaties, translationele studies van menselijke ziekten zou kunnen vergemakkelijken13,53. Over het algemeen biedt de bottom-upbenadering die mogelijk wordt gemaakt door het ELT-platform de mogelijkheid om de bijdragen van bepaalde celtypen aan uitlezingen van belang te onderzoeken - zoals AEC2-proliferatie of differentiatietoestand.

Samenvattend schetst dit protocol een robuust systeem voor het genereren van gemanipuleerde longweefsels voor co-kweekstudies van AEC2's, fibroblasten en endotheelcellen in acellulaire ECM-longschijfsteigers. ELTs vertegenwoordigen een nieuwe 3D-cultuurstrategie voor primaire AEC2's, die tot nu toe meestal hebben vertrouwd op minder fysiologische gel-type matrices om een goed gedifferentieerd fenotype 6,11,12 te behouden. Het huidige platform bouwt voort op eerder werk in de herbevolking van gedecellulariseerde longplakken 24,25,26,27,28,29, maar biedt verschillende voordelen: 1) een weefselkweekcassettesysteem om ELT-behandeling tijdens decellularisatie, zaaien en kweken te vergemakkelijken; 2) een aangepast zaaibad om nauwkeurig een bekend aantal cellen op elke plaksteiger te zaaien; en 3) een tri-kweek herzaaistrategie die alveolaire weefselherbevolking met epitheliale, mesenchymale en endotheelcellen mogelijk maakt. ELTs vertegenwoordigen dus een belangrijke stap voorwaarts in de richting van het creëren van reproduceerbare in vitro modellen die de cellulaire en substraatcomplexiteit van de inheemse alveolus en de AEC2-stamcelniche vastleggen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L.E.N. is een oprichter en aandeelhouder van Humacyte, Inc, een bedrijf in regeneratieve geneeskunde. Humacyte produceert gemanipuleerde bloedvaten uit allogene gladde spiercellen voor vasculaire chirurgie. De echtgenoot van L.E.N. heeft aandelen in Humacyte en L.E.N. is lid van de Raad van Bestuur van Humacyte. L.E.N. is uitvinder van patenten die in licentie zijn gegeven aan Humacyte en die royalty's opleveren voor L.E.N. L.E.N. heeft een onbeperkte onderzoeksgift ontvangen om onderzoek in haar laboratorium aan Yale te ondersteunen. Humacyte heeft geen invloed gehad op het gedrag, de beschrijving of de interpretatie van de bevindingen in dit rapport.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Lorenzo Sewanan en Jorge Nunez bedanken voor hun werk bij het ontwikkelen van het weefselkweekcassetteontwerp dat in dit protocol wordt gebruikt, het Kaminski-lab voor het gebruik van hun vibratome, Maurizio Chioccioli en Jessica Nouws voor hulp bij het snijden van longen, Allie LaRocco voor hulp bij de eerste pilootexperimenten en Hong Qian voor het zorgvuldig lezen van het protocol. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies F30HL143880 (K.L.L.), de Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.) en U01HL145567 (L.E.N.); en door een onbeperkte onderzoeksgift van Humacyte Inc. (L.E.N.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3D Printer: Form 2Formlabs
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)SigmaI5879
8-Bromo cAMPSigmaB7880
Agarose, UltraPure LMPInvitrogen15517-014
Amphotericin BSigmaA2942
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inchMcMaster-Carr5121K271
Benzonase nucleaseSigmaE1014
Bovine serum albumin (BSA) Fraction VGemini700-104PVoor AEC2 groeimedium
Bovine serum albumin (BSA), standard gradeGemini700-100PVoor benzonase buffer
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barbCole-ParmerSK-98553-10
CHIR99021PeproTech2520691
Clear Resin, 1 LFormlabsRS-F2-GPCL-04
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent GlueAny hardware, craft, or drug storeKG483 of vergelijkbaar
DexamethasoneSigmaD4902
DMEM (low glucose)Gibco11885-084
DMEM (high glucose)Gibco11965-092
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)InvitrogenP7589
EDTA, 0.5 M, pH 8.0AmericanBioAB00502-01000
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)InvitrogenC10340Gebruikt volgens de aanwijzingen van de fabrikant
Elbow fitting, 3/8 inchMcMaster-Carr5121K907
F12Gibco11765-054
Fetal bovine serum (FBS), characterizedHycloneSH30071.03
Gentamicin sulfateGemini400-100POpgelost in diH2O voor een stamoplossing van 50 mg/mL
Hair clippersWahlMiniArco
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red FreeGibco14175-095
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mLSagentNDC: 25021-400-30Voor intraperitoneale en intracardiale injectie
Heparin sodium saltSigmaH4784Voor longslagaderperfusie; bereid een stamoplossing van 100 U/mL in PBS
HEPES BufferCorning25-060-Cl
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inchMcMaster-Carr5121K851
Inoculating loop, disposableFisherbrand22-363-600
Insulin from bovine pancreasSigmaI6634
Ketamine injection, 100 mg/mLCovetrus (Butler Animal Health)010177
KGF, recombinant humanPeproTech100-19
Laser cutter, VLS 3.50 30 wattUniversal Laser Systems
L-glutamineGibco25030-081
Luer-lock, female, 3/32 inchCole-Parmer45508-02
Luer-lock, male, 1/8 inchCole-Parmer30800-24
Luer-lock, male, 1/4 inchMcMaster-Carr51525K146
MCDB-131 Complete without serumVEC TechnologiesMCDB-131 WOFBS
Magnesium chloride (MgCl2), 1 MAmericanBioAB09006-00100
NaClAmerican BioananalyticalAB01915
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10XSigmaD1408Herstel tot 1X met diH2O
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+Gibco21300-058
PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDow Corning Corporation4019862
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin)Gibco15140-122
Petri dish, 150 mmFalcon351058
Plastic film (parafilm)BemisPM-996
Pharmed BPT tubing, LS 16Masterflex06508-16
Pharmed BPT tubing, LS 17Masterflex06508-17
Platinum-cured silicone tubing, LS 14Masterflex96420-14
Platinum-cured silicone tubing, LS 16Masterflex96420-16
Platinum-cured silicone tubing, LS 36Masterflex96410-36
Poloxamer 407 (Pluronic F-127)SigmaP2443
Povidone/iodine prep pads, 10%Dynarex Corporation1108
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thickePlasticsPTFENAT0.060X12X12Voor tabs van weefselkweekcassettes
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thickePlasticsPTFENAT0.093X12X12Voor frames en clips van weefselkweekcassettes
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital DriveCole-ParmerZM-07528-30
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump HeadCole-ParmerEW-77202-60
Rat, Sprague DawleyCharles RiverStrain Code: 400
Razor bladeAny hardware or craft storePersonna 94-120-71 of ver

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burri, P. H. Morphology and respiratory function of the alveolar unit. International Archives of Allergy and Applied Immunology. 76, Suppl 1 2-12 (1985).
  2. Barkauskas, C. E., Noble, P. W. Cellular Mechanisms of Tissue Fibrosis. 7. New insights into the cellular mechanisms of pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (11), 987-996 (2014).
  3. Taylor, M. S., et al. A Conserved Distal Lung Regenerative Pathway in Acute Lung Injury. American Journal of Pathology. 188 (5), 1149-1160 (2018).
  4. Carsana, L., et al. Pulmonary post-mortem findings in a series of COVID-19 cases from northern Italy: a two-centre descriptive study. Lancet Infectious Diseases. 20 (10), 1135-1140 (2020).
  5. Basil, M. C., et al. The Cellular and Physiological Basis for Lung Repair and Regeneration: Past, Present, and Future. Cell Stem Cell. 26 (4), 482-502 (2020).
  6. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
  7. Desai, T. J., Brownfield, D. G., Krasnow, M. A. Alveolar progenitor and stem cells in lung development, renewal and cancer. Nature. 507 (7491), 190-194 (2014).
  8. Evans, M. J., Cabral, L. J., Stephens, R. J., Freeman, G. Renewal of alveolar epithelium in the rat following exposure to NO2. The American Journal of Pathology. 70 (2), 1-24 (1973).
  9. Beers, M. F., Moodley, Y. When is an alveolar type 2 cell an alveolar type 2 cell? A conundrum for lung stem cell biology and regenerative medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 18-27 (2017).
  10. Borok, Z., et al. Keratinocyte growth factor modulates alveolar epithelial cell phenotype in vitro: expression of aquaporin 5. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 18 (4), 554-561 (1998).
  11. Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
  12. Sucre, J. M. S., et al. Successful establishment of primary Type 2 alveolar epithelium with 3D organotypic co-culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 158-166 (2018).
  13. Jacob, A., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelial cells. Stem Cell. 21 (4), 472-488 (2017).
  14. Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
  15. Chen, Y. W., et al. A three-dimensional model of human lung development and disease from pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 19 (5), 542-549 (2017).
  16. Korogi, Y., et al. In vitro disease modeling of hermansky-pudlak syndrome Type 2 using human induced pluripotent stem cell-derived alveolar organoids. Stem Cell Reports. 12 (3), 431-440 (2019).
  17. Strikoudis, A., et al. Modeling of fibrotic lung disease using 3D organoids derived from human pluripotent stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3709-3723 (2019).
  18. Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. How does the extracellular matrix direct gene expression. Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).
  19. Chapman, H. A. Epithelial responses to lung injury: Role of the extracellular matrix. Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (3), 89-95 (2012).
  20. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  21. Zhou, Y., et al. Extracellular matrix in lung development, homeostasis and disease. Matrix Biology. 73, 77-104 (2018).
  22. Calle, E. A., et al. Targeted proteomics effectively quantifies differences between native lung and detergent-decellularized lung extracellular matrices. Acta Biomaterialia. 46, 91-100 (2016).
  23. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  24. Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: Detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
  25. O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1055(2013).
  26. Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
  27. Burgstaller, G., et al. Distinct niches within the extracellular matrix dictate fibroblast function in (cell free) 3D lung tissue cultures. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (5), 708-723 (2018).
  28. Sun, H., et al. Fibroblast engraftment in the decellularized mouse lung occurs via a β1-integrin-dependent, FAK-dependent pathway that is mediated by ERK and opposed by AKT. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (6), 463-475 (2014).
  29. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  30. Schwan, J., et al. Anisotropic engineered heart tissue made from laser-cut decellularized myocardium. Scientific Reports. 6, 32068(2016).
  31. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
  32. Gerckens, M., et al. Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
  33. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465(2017).
  34. Neuhaus, V., et al. Assessment of the cytotoxic and immunomodulatory effects of substances in human precision-cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (135), e57042(2018).
  35. You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 283 (6), 1315-1321 (2002).
  36. Vaccaro, C., Brody, J. S. Ultrastructure of developing alveoli. I. The role of the interstitial fibroblast. The Anatomical Record. 192 (4), 467-479 (1978).
  37. Calle, E. A., et al. Fate of distal lung epithelium cultured in a decellularized lung extracellular matrix. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1916-1928 (2015).
  38. Dobbs, L. G., Gonzalez, R., Williams, M. C. An improved method for isolating type II cells in high yield and purity. American Review of Respiratory Disease. 134 (1), 141-145 (1986).
  39. Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. American Journal of Physiology. 258, 134-147 (1990).
  40. Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
  41. Dobbs, L. G., Pian, M. S., Maglio, M., Dumars, S., Allen, L. Maintenance of the differentiated type II cell phenotype by culture with an apical air surface. The American Journal of Physiology. 273 (2), 347-354 (1997).
  42. Bruce, M. C., Honaker, C. E. Transcriptional regulation of tropoelastin expression in rat lung fibroblasts: changes with age and hyperoxia. American Journal of Physiology. 274 (6), 940-950 (1998).
  43. Berk, J. L., Franzblau, C., Goldstein, R. H. Recombinant interleukin-1 beta inhibits elastin formation by a neonatal rat lung fibroblast subtype. Journal of Biological Chemistry. 266 (5), 3192-3197 (1991).
  44. Schultz, C. J., Torres, E., Londos, C., Torday, J. S. Role of adipocyte differentiation-related protein in surfactant phospholipid synthesis by type II cells. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 283 (2), 288-296 (2002).
  45. Maksvytis, H. J., et al. In vitro characteristics of the lipid-filled interstitial cell associated with postnatal lung growth: evidence for fibroblast heterogeneity. Journal of Cellular Physiology. 118, 113-123 (1984).
  46. Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
  47. Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933(2019).
  48. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nature medicine. 16 (8), 927-933 (2010).
  49. Le, A. V., et al. Efficient and Functional Endothelial Repopulation of Whole Lung Organ Scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (9), 2000-2010 (2017).
  50. Ren, X., et al. Engineering pulmonary vasculature in decellularized rat and human lungs. Nature Biotechnology. 33 (10), 1097-1102 (2015).
  51. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  52. Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
  53. Alysandratos, K. D., et al. Patient-specific iPSCs carrying an SFTPC mutation reveal the intrinsic alveolar epithelial dysfunction at the inception of interstitial lung disease. Cell Reports. 36 (9), 109636(2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Engineered Lung TissuesDecellularized Lung SlicesExtracellular MatrixLung Tissue EngineeringAlveolar EpitheliumEndothelial CellsFibroblast SeedingPrecision Cut Lung SlicesRecellularization ProtocolPhase Contrast Microscopy

Gerelateerde artikelen