Hier presenteren we een protocol om snelle, eenvoudige en betrouwbare alternatieven voor bloedafname te bieden voor het rattenmodel. We beschrijven drie verschillende bloedafnamemethoden, afhankelijk van de context: staartaderpunctie onder anesthesie of op een bewust dier en dorsale penisaderpunctie onder anesthesie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gemodificeerde staartader en penisaderpunctie voor bloedafname in het rattenmodel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bloedmonsters zijn vereist in de meeste proefdierontwerpen om verschillende hematologische parameters te beoordelen. Dit artikel presenteert twee procedures voor bloedafname bij ratten: de laterale staartaderpunctie en de dorsale penisaderpunctie, die aanzienlijke voordelen bieden ten opzichte van andere eerder beschreven technieken. Deze studie toont aan dat deze twee procedures een snelle bemonstering (minder dan 10 min) mogelijk maken en voldoende bloedvolumes opleveren voor de meeste testen (202 μL ± 67,7 μL). De dorsale penisaderpunctie moet onder narcose worden uitgevoerd, terwijl de laterale staartaderpunctie kan worden gedaan op een bewust, ingehouden dier.
Het afwisselen van deze twee technieken maakt daarom bloedafname in elke situatie mogelijk. Hoewel het altijd wordt aanbevolen dat een operator wordt bijgestaan tijdens een procedure om het dierenwelzijn te waarborgen, vereisen deze technieken slechts één operator, in tegenstelling tot de meeste bloedafnamemethoden waarvoor er twee nodig zijn. Bovendien, terwijl deze eerder beschreven methoden (bijv. Jugular stick, subclavia ader bloedafname) uitgebreide voorafgaande training vereisen om schade aan of de dood van het dier te voorkomen, zijn staartader en dorsale penisaderpunctie zelden dodelijk. Om al deze redenen, en afhankelijk van de context (bijvoorbeeld voor studies met mannelijke ratten, tijdens de perioperatieve of onmiddellijke postoperatieve periode, voor dieren met dunne staartaders), kunnen beide technieken afwisselend worden gebruikt om herhaalde bloedafnames mogelijk te maken.
Inleiding
Bloedafname is noodzakelijk voor de meeste dierstudies, zowel in vivo als in vitro. Bij ratten, omdat de frequentie en hoeveelheid bloedafname aanzienlijk kan zijn, is het nuttig om verschillende alternatieven voor verzameling te hebben. Verschillende methoden zijn beschreven in eerdere studies.
De meest gebruikte technieken zijn staartaderpunctie en bloedafname van de venadus saphenus. Staartaderbemonstering is geschikt voor alle rattenstammen. Met de juiste training is de procedure eenvoudig uit te voeren en veroorzaakt het dier minimaal leed1. Evenzo is de bloedafname van de vena saphenus, mits goed gedaan, ook een snelle en eenvoudige verzamelmethode. Geen van beide methoden vereist anesthesie en beide maken herhaalde trekkingen van kleine hoeveelheden bloed mogelijk. De vena-punctie met saphena levert echter meestal een lager bloedvolume1 op en vereist de aanwezigheid van twee mensen om één achterpoot bloot te laten voor punctie2.
Als grote hoeveelheden bloed van een enkel dier moeten worden verzameld, kan hartpunctie of punctie van de vena cava worden gebruikt (tot 10 ml bloed kan worden afgenomen van een rat van 150 g met hartpunctie2). Deze technieken vereisen anesthesie en zijn terminale procedures. Het dier moet worden geëuthanaseerd na een van deze twee technieken2. De jugular stick is een alternatief dat kan worden gebruikt als grote hoeveelheden bloed moeten worden verzameld in een onderzoek dat zijn eindpunt nog niet heeft bereikt. Deze techniek vereist echter ook aanzienlijke technische vaardigheden om schade aan het dier te voorkomen; Daarom moet het gebruik ervan worden beperkt3.
Andere technieken, zoals de bloedafname van de subclaviaader, hebben geen anesthetica nodig vóór de bloedafname en maken herhaalde bemonstering van kleine bloedvolumes mogelijk. Voor deze techniek zijn echter ingetogen hantering en passende naaldincisie vereist. Een onjuiste operatie kan leiden tot pijn bij dieren of zelfs sterfte, en de training voor deze methode kan kieskeurig zijn4.
Andere anekdotische procedures omvatten de orbitale punctie en de sublinguale aderpunctie, die beide een verdoving vereisen en geen van beide worden aanbevolen of op grote schaal worden gebruikt. Hoewel eerdere studies een snellere bloedafname door orbitale punctie hebben aangetoond dan door staartaderpunctie, bleek dat orbitale punctie onder diethyletheranesthesie minder goed werd verdragen dan de laatste methode (gebaseerd op de excitatiescores en urineproductie van de dieren)5. Bovendien wordt deze methode sterk beïnvloed door de vaardigheid van de persoon die de procedure uitvoert en wordt deze voornamelijk uitgevoerd door ervaren dierenartsen. Vergelijkbaar is de sublinguale aderpunctie minder verontrustend en wordt aanbevolen voor herhaalde bloedafname6. Deze techniek heeft echter ernstige nadelige effecten, zoals een verminderde voedsel- en waterinname, wat kan leiden tot de dood van het dier7.
Deze studie beschrijft twee methoden die in ons laboratorium worden gebruikt voor herhaalde bloedafname. Staartaderpunctie kan worden uitgevoerd op een bewust dier en de weefselschade en nadelige effecten zijn minimaal. De wijziging van deze techniek in deze studie omvat het stabiliseren van de staart met de wijs- en middelvinger, waardoor een enkele operator de bloedafname kan uitvoeren. De dorsale penisaderpunctie is al beschreven voor eenvoudige intraveneuze injecties. Deze techniek wordt uitgevoerd onder anesthesie en zorgt voor een betrouwbare bloedbron in geval van problemen met andere methoden (bijvoorbeeld tijdens de onmiddellijke postoperatieve periode, met een klein dier, bij het uitvoeren van perioperatieve bloedafname onder anesthesie). Net als bij het nemen van staartaders, zal het letsel op de punctieplaats een klein algemeen effect op het dier hebben in vergelijking met de hierboven genoemde technieken8. Het doel van dit methodedocument is om onervaren onderzoekers eenvoudige en betrouwbare alternatieven voor bloedafname te bieden, afhankelijk van de context (bijvoorbeeld voor procedures die onder anesthesie worden uitgevoerd, voor studies met mannelijke ratten, voor dieren met dunne staartaders).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De procedures werden uitgevoerd op 3 maanden oude mannelijke Lewis-ratten, elk met een gewicht van 300-400 g. In totaal werden 24 dieren geïncludeerd, met drie punctievoorwaarden: 12 ratten ondergingen een staartaderpunctie zonder anesthesie (groep TV zonder anesthesie) en nog eens 12 ratten werden verdoofd om zowel staartaderpunctie (groep TV met anesthesie) als penisaderpunctie (groep PV met anesthesie) te ondergaan. Alle procedures werden goedgekeurd en respecteerden de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle dieren werden aan het einde van het onderzoek (na een follow-up van 1 maand) geëuthanaseerd door een overdosis koolstofdioxide. Zie de Tabel van Materialen voor details met betrekking tot alle materialen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
1. Algemene richtsnoeren
- In overeenstemming met de IACUC-richtlijnen, zorg ervoor dat het maximale bloedvolume dat wordt getrokken niet meer dan 10% van het totale bloedvolume isom de 2 weken 9. Een rat van 300 g moet bijvoorbeeld een totaal bloedvolume van ongeveer 19,2 ml hebben. In het geval van een protocol dat alleen al in de eerste week (dag 0, dag 1, dag 3, dag 7) vier bloedafnames vereist, beperk de afname tot maximaal 250 μL bloed per monster.
- Voor procedures die onder anesthesie worden uitgevoerd, dient u isofluraan toe via een precisieverdamper om het dier te verdoven. Induceer anesthesie in een kamer met een dosis van 3% -5% isofluraan gedurende 5 minuten en handhaaf het gebruik van een dosis van 1% -3% isofluraan door een neuskegel tijdens de procedure. Pas het isofluraanniveau aan op basis van continue monitoring van de ademhalingsfrequentie. Controleer of sedatie voldoende is door teenknijpen voordat u de procedure start.
- Laat het dier niet onbeheerd achter tijdens de procedure of totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om sternale lighouding te behouden.
- Controleer na de bloedafname het dier tot volledig herstel voordat u het terugbrengt naar zijn kooi en breng het niet in het gezelschap van andere dieren totdat het volledig is hersteld.
OPMERKING: In overleg met veterinaire diensten was er geen pijnmedicatie na de procedure nodig na de staartader of de penisaderpunctie.
2. Bloedafname uit de penisader
- Voorbereiding
- Bereid de volgende apparatuur voor: steriel gaas, handschoenen, alcoholdoekjes, een microcapillaire bloedafname EDTA-buis (paarse dop) en een 30 G insulinespuit (30 U of 50 U).
- Haal de rat uit zijn kooi en zet hem in een kamer voor inductie met isofluraan via een precisieverdamper (dosis: 3%-5%). Zodra het dier is verdoofd, brengt u het over naar de proceduretafel en legt u het dier op zijn rug met zijn neus in de neuskegel geplaatst om de anesthesie te behouden. Controleer de ademhalingsfrequentie en pas het isofluraanniveau dienovereenkomstig aan (onderhoudsdosis: 1% -3%). Controleer of het dier voldoende is verdoofd door teenknijpen voordat u met de procedure begint.
- Bloedafname
- Beweeg de zuiger meerdere keren heen en weer in de spuit om de terugtrekking glad te strijken. Creëer negatieve druk in de spuit door aan de zuiger te trekken om een paar microliter te verwijderen.
- Trek met behulp van de niet-dominante hand de voorhuid van het uiteinde van de penis terug en houd de eikel tussen de wijs- en duim en trek zachtjes. De dorsale penisader zal verschijnen als een oppervlakkig blauw koord. Zie figuur 1 en figuur 2.
- Met het oog van de naald naar boven gericht, steekt u de insulinespuit in de ader onder een hoek van 35°. Zodra de naald in de ader is gekomen, stroomt er bloed in de spuit.
- Trek de zuiger van de spuit langzaam en gestaag op om het gewenste volume te verzamelen.
OPMERKING: Trek de zuiger niet te snel terug, omdat dit ervoor zorgt dat de ader instort en de bloedstroom stopt. - Als de bloedstroom afneemt, draai de naald dan iets met de klok mee of tegen de klok in.
- Verwijder de spuit. Een bloeddruppel zal zich vormen op de punctieplaats, waarvan de aspiratie het mogelijk maakt om nog een paar microliter bloed te verzamelen in het geval van een niet-steriele procedure.
- Als de eerste punctie mislukt, plaatst u de naald meer proximaal op de ader.
OPMERKING: In tegenstelling tot het nemen van staartadermonsters, is de iteratieve punctie van de dorsale penisader meestal niet succesvol. - Oefen lichte druk uit op de prikplaats om het bloeden te stoppen en veeg het gebied af met een nieuw alcoholdoekje.
- Plaats de penis terug in de neutrale positie.
- Schakel de isofluraan uit en controleer de rat tot volledig herstel. Breng de rat terug naar zijn kooi.
3. Staartaderpunctie
- Voorbereiding
- Bereid de volgende apparatuur voor: een plastic fixatiehouder, steriel gaas, handschoenen, alcoholdoekjes, een microcapillaire bloedafname EDTA-buis (paarse dop) en een 28 G 1/2 insulinespuit (30 U of 50 U).
- Haal de rat uit zijn kooi en zet hem snel vast in een plastic fixatiekegel. Sluit het grote uiteinde van de kegel rond de basis van de staart. Zorg ervoor dat het dier zich comfortabel voelt en dat de ademhaling gedurende de hele procedure onbeperkt is.
- Dompel de staart ongeveer 1 minuut in warm water (37 °C) om de ader te verwijden. Droog de staart af met keukenpapier. Plaats het dier (in zijn fixator) met het gezicht naar beneden, met de staart liggend op een verwarmingskussen.
- Selecteer de rechter- of linkerstaartader (blauwe lijn) voor bemonstering door het hele dier naar beide zijden te draaien (dit voorkomt het draaien van de staart). Gebruik het terminale derde deel van de staart voor het doorprikken van bloedvaten, omdat de bloedvaten in deze zone oppervlakkiger worden. De slagader is ventraal en de twee aderen zijn lateraal10.
- Veeg de staart af met 70% ethanoldoekjes op de prikplaats.
- Plaats de staart op de rand van het verwarmingskussen om een hoek te creëren in het terminale derde deel van de staart. Dit brengt de ader naar de oppervlakte en creëert meer ruimte voor het nemen van het monster.
- Bloedafname
- Beweeg de zuiger meerdere keren heen en weer in de spuit om de terugtrekking glad te strijken. Creëer negatieve druk in de spuit door aan de zuiger te trekken om een paar microliter te verwijderen.
- Met behulp van de niet-dominante wijs- en middelvinger zet u de staart plat op het verwarmingskussen. Plaats de middelvinger proximaal en de wijsvinger distaal, met de prikplaats tussen deze twee vingers. Oefen meer druk uit op de middelvinger dan op de wijsvinger om de staart vast te zetten, waarbij het vat alleen proximaal wordt afgesloten en het bloed zich kan verzamelen. Zie figuur 1 en figuur 3.
- Met het oog van de naald naar boven gericht, schuift u de insulinespuit tegen de wijsvinger totdat deze in de ader wordt ingebracht (dit creëert een hoek van 35° tussen de naald en de staart). Zodra de naald in de ader is gekomen, stroomt er bloed in de spuit. Laat op dit punt de druk op de wijs- en middelvinger los om ervoor te zorgen dat de bloedstroom niet wordt afgesloten.
- Trek de zuiger van de spuit langzaam op met een constante snelheid om het gewenste volume te verzamelen.
OPMERKING: Trek de zuiger niet te snel terug; Dit zal ervoor zorgen dat de ader instort en de bloedstroom stopt. - Als de bloedstroom afneemt, draai de naald dan iets in beide richtingen.
- Verwijder de spuit van de staart. Een bloeddruppel vormt zich op de punctieplaats van de staart. De aspiratie van dit bloed maakt het mogelijk om nog een paar microliter bloed te verzamelen in het geval van een niet-steriele procedure.
- Als de eerste punctie mislukt, plaatst u de naald meer proximaal op de ader.
OPMERKING: De ader wordt steeds dieper naarmate deze de staartbasis nadert. Als er geen bloedstroom in de spuit is, vergroot u de hoek tussen de spuit en de staart of draait u de naald. - Oefen druk uit op de prikplaats om het bloeden te stoppen en veeg het gebied af met een nieuw alcoholdoekje. Verwijder de rat uit de plastic kegel en breng hem terug naar zijn kooi.
- Staartaderpunctie onder narcose
- Voer stap 2.1.1 en stap 2.1.2 uit voor het induceren en onderhouden van anesthesie.
- Voer stap 3.1.3-3.2.7 uit voor bloedafname; zie figuur 1.
- Voer stap 2.2.10 uit voor het herstel van dieren.
Figuur 1: Schema's van de verschillende punctiemethoden in dit protocol. (A) Gewijzigde staartaderpunctie bij een bewust, ingehouden dier; (B) gemodificeerde staartaderpunctie en penisaderpunctie onder anesthesie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Succes werd gedefinieerd als een bloedafname die ten minste 100 μL bloed opleverde in minder dan 10 minuten (van de punctietijd tot het einde van de bloedafname), en falen werd gedefinieerd als een bloedafname die minder dan 100 μL bloed opleverde of meer dan 10 minuten duurde om het vereiste bloedvolume op te halen. Maximaal 250 μL bloed per monster was toegestaan. De statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een eenrichtings ANOVA-test voor meerdere vergelijkingen en de chi-kwadraattest. De gegevens werden...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De staartaderpunctie is een efficiënte methode om bloed te verkrijgen van een bewuste rat. Wanneer een dier echter onder narcose is, kan het effect van isofluraan leiden tot vaatspasmen en staartaderpunctie ongeschikt maken11. Zoals aangetoond in deze studie, is een alternatief in deze situatie om bloed uit de penisader te verzamelen, wat succesvoller is en een aanzienlijk groter volume bloed oplevert in minder tijd. Het is belangrijk om te onthouden dat in het geval van falen met deze methode bij...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door Shriners Children's Boston (B. E. U., K.U., C.L.C.). L.C. wordt gefinancierd door "La Bourse des Gueules Cassées", "La Bourse Année Recherche" en "La Bourse de l'Amicale des Anciens Internes des Hôpitaux de Paris". Y.B. wordt gefinancierd door "La Bourse des Gueules Cassées". Y.B. en I.F.v.R. worden gefinancierd door de Shriners Hospitals for Children (Fellowships ID is respectievelijk #84308-BOS-22 #84302-BOS-21). Dit materiaal is gedeeltelijk gebaseerd op werk dat wordt ondersteund door de National Science Foundation onder Grant No. EEG 1941543. Gedeeltelijke steun van de Amerikaanse National Institutes of Health (R01EB028782, R56AI171958 en R01DK114506) wordt dankbaar erkend. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.5 mL | 28 G ½ Insulin Syringe | BD | 329424 | voor staartvenepunctie |
| 0.5 mL | 30 G x 5/16 Insulin Syringe | BD | 320468 | voor venepunctie van de penis |
| 250 L Microtainer bloedopnamebuisjes met K2EDTA | BD | 365974 | |
| Gaaszwammen | Curity | 6939 | |
| Isofluraangeauto-flow anesthesieapparaat | E-Z Systems | EZ-190F | voor venepunctie van de penis |
| Isofluraan, USP | Patterson Veterinary | 1403-704-06 | voor venepunctie van de penis |
| Nosecone voor anesthesie | World Precision Instruments | EZ-112 | voor venepunctie van de penis |
| Kegel voor knaagdierbevestiging | Harvard Apparatus | ST2 52-95-86 | voor staartvenepunctie |
| Verwarmde operatietafel voor kleine dieren (instelbaar) | Peco Services Ltd | 69023 | |
| Webcol alcohol prep pads | Simply Medical | 5110 |
Referenties
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766(2015).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), 266(2007).
- Luzzi, M., et al. Collecting blood from rodents: A discussion by the Laboratory Animal Refinement and Enrichment Forum. Animal Technology and Welfare. 4 (2), 99-102 (2005).
- Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439(2022).
- Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: Comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory Animals. 35 (2), 131-139 (2001).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
- Nightingale, C. H., Mouravieff, M. Reliable and simple method of intravenous injection into the laboratory rat. Journal of Pharmaceutical Sciences. 62 (5), 860-861 (1973).
- Blood collection: The rat. IACUC Guideline. UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. , Available from: https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/guidelines%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
- Staszyk, C., Bohnet, W., Gasse, H., Hackbarth, H. Blood vessels of the rat tail: A histological re-examination with respect to blood vessel puncture methods. Laboratory Animals. 37 (2), 121-125 (2003).
- Constantinides, C., Mean, R., Janssen, B. J. Effects of isoflurane anesthesia on the cardiovascular function of the C57BL/6 mouse. ILAR Journal. 52 (3), e21-e31 (2011).
- Hernaningsih, Y., Akualing, J. S. The effects of hemolysis on plasma prothrombin time and activated partial thromboplastin time tests using photo-optical method. Medicine. 96 (38), 7976(2017).
- Powles-Glover, N., Kirk, S., Jardine, L., Clubb, S., Stewart, J. Assessment of haematological and clinical pathology effects of blood microsampling in suckling and weaned juvenile rats. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69 (3), 425-433 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
