Hier presenteren we een protocol om metabolieten in zeldzame celtypen nauwkeurig en betrouwbaar te meten. Technische verbeteringen, waaronder een gemodificeerde mantelvloeistof voor het sorteren van cellen en het genereren van relevante blanco monsters, maken een uitgebreide kwantificering van metabolieten mogelijk met een input van slechts 5000 cellen per monster.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gerichte metabolomics op zeldzame primaire cellen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De cellulaire functie hangt in belangrijke mate af van het metabolisme, en de functie van de onderliggende metabole netwerken kan worden bestudeerd door intermediairen met kleine moleculen te meten. Het verkrijgen van nauwkeurige en betrouwbare metingen van het cellulaire metabolisme, met name in zeldzame celtypen zoals hematopoëtische stamcellen, vereist echter van oudsher het poolen van cellen van meerdere dieren. Een protocol stelt onderzoekers nu in staat om metabolieten in zeldzame celtypen te meten met slechts één muis per monster, terwijl ze meerdere replicaten genereren voor meer voorkomende celtypen. Dit vermindert het aantal dieren dat nodig is voor een bepaald project. Het hier gepresenteerde protocol omvat verschillende belangrijke verschillen ten opzichte van traditionele metabolomics-protocollen, zoals het gebruik van 5 g/L NaCl als omhulselvloeistof, het rechtstreeks sorteren in acetonitril en het gebruik van gerichte kwantificering met rigoureus gebruik van interne normen, waardoor nauwkeurigere en uitgebreidere metingen van het cellulaire metabolisme mogelijk zijn. Ondanks de tijd die nodig is voor het isoleren van afzonderlijke cellen, fluorescerende kleuring en sortering, kan het protocol de verschillen tussen celtypen en medicamenteuze behandelingen voor een groot deel behouden.
Inleiding
Metabolisme is een essentieel biologisch proces dat in alle levende cellen voorkomt. Metabolische processen omvatten een uitgebreid netwerk van biochemische reacties die strak worden gereguleerd en met elkaar verbonden zijn, waardoor cellen energie kunnen produceren en essentiële biomoleculen kunnen synthetiseren. Om de functie van metabole netwerken te begrijpen, meten onderzoekers de niveaus van intermediairen van kleine moleculen in cellen. Deze tussenproducten dienen als belangrijke indicatoren van metabole activiteit en kunnen kritische inzichten in de cellulaire functie onthullen.
Massaspectrometrie (MS) is de ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het fokken en houden van alle muizen die voor dit protocol werden gebruikt, werd uitgevoerd in een conventionele dierenfaciliteit in het Max Planck Instituut voor Immunobiologie en Epigenetica (MPI-IE) volgens de voorschriften van de lokale autoriteiten (Regierungspräsidium Freiburg). Muizen werden geëuthanaseerd met CO2 en cervicale dislocatie door FELASA B-opgeleid personeel volgens richtlijnen en voorschriften die zijn goedgekeurd door de dierenwelzijnscommissie van de MPI-IE en de lokale autoriteiten. Er werden geen dierproeven uitgevoerd en muizen hadden geen last van hun gezondheid.
OPMERKING: Zeer gevoelige analysemethoden....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
FACS-sortering maakt het mogelijk om schone populaties van verschillende celtypen uit dezelfde celsuspensie te isoleren (Figuur 2 en Figuur 3). De specificiteit van deze methode berust op de kleuring van de verschillende celtypen met specifieke oppervlaktemarkers (bijvoorbeeld B-cellen en T-cellen uit de milt) of specifieke combinaties van oppervlaktemarkers (bijvoorbeeld HSC's en MPP's). Kleuring van intracellulaire markers vereist doorgaans permeabilisatie van.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meest kritische stappen voor een succesvolle implementatie van gerichte metabolomics met behulp van dit protocol zijn 1) een robuuste kleurings- en gatingstrategie die schone celpopulaties zal opleveren 2) nauwkeurige behandeling van vloeistofvolumes, 3) reproduceerbare timing van alle experimentele stappen, in het bijzonder alle stappen voorafgaand aan metabolietextractie. Idealiter zouden alle monsters die tot één experiment behoren, in één batch moeten worden verwerkt en gemeten om batcheffecten te minimaliseren
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de dierenfaciliteit van het Max Planck Instituut voor Immunobiologie en Epigenetica bedanken voor het leveren van de dieren die in deze studie zijn gebruikt.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 13C gistextract | Isotoop oplossingen | ISO-1 | |
| 40 µm cel zeef | Corning | 352340 | |
| Acetonitril, LC-MS graad | VWR | 83640.32 | |
| ACK lyse buffer | Gibco | 104921 | Alternatief: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine difosfaat (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monofosfaat (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine trifosfaat (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonaat, HPLC graad | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC kolom (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Warmtesluitfolie | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronzuur | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS graad | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Massaspectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 wel LoBind gerand | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Kolom Thermostaat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pomp | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostaat | Agilent | G4761A |
Referenties
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 27....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
