Ontwikkeling en optimalisatie van een humaan hepatocellulair carcinoom-patiënt-afgeleid organoïdemodel voor potentiële doelidentificatie en ontdekking van geneesmiddelen

Samenvatting

We bieden een uitgebreid overzicht en verfijning van bestaande protocollen voor de vorming van hepatocellulair carcinoom (HCC), die alle stadia van de organoïdeteelt omvatten. Dit systeem dient als een waardevol model voor de identificatie van potentiële therapeutische doelwitten en de beoordeling van de effectiviteit van kandidaat-geneesmiddelen.

Samenvatting

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is wereldwijd een veel voorkomende en dodelijke tumor en de late ontdekking en het gebrek aan effectieve specifieke therapeutische middelen maken verder onderzoek naar de pathogenese en behandeling ervan noodzakelijk. Organoïden, een nieuw model dat sterk lijkt op inheems tumorweefsel en in vitro kan worden gekweekt, hebben de afgelopen jaren veel belangstelling gewekt, met tal van rapporten over de ontwikkeling van organoïdemodellen voor leverkanker. In deze studie hebben we met succes de procedure geoptimaliseerd en een kweekprotocol opgesteld dat de vorming van grotere HCC-organoïden met stabiele passaging en kweekomstandigheden mogelijk maakt. We hebben elke stap van de procedure uitgebreid geschetst, waarbij we het hele proces van HCC-weefseldissociatie, organoïdeplating, kweek, passaging, cryopreservatie en reanimatie hebben behandeld, en in dit artikel gedetailleerde voorzorgsmaatregelen hebben gegeven. Deze organoïden vertonen genetische gelijkenis met de originele HCC-weefsels en kunnen worden gebruikt voor diverse toepassingen, waaronder de identificatie van potentiële therapeutische doelen voor tumoren en de daaropvolgende ontwikkeling van geneesmiddelen.

Inleiding

Hepatocellulair carcinoom (HCC), een veel voorkomende en zeer diverse tumor¹, heeft veel aandacht gekregen binnen de medische gemeenschap. De aanwezigheid van afstammingsplasticiteit en substantiële heterogeniteit in HCC suggereert dat tumorcellen afkomstig van verschillende patiënten en zelfs verschillende laesies binnen dezelfde patiënt ongelijke moleculaire en fenotypische eigenschappen kunnen vertonen, waardoor formidabele obstakels worden gevormd bij de vooruitgang van innovatieve therapeutische benaderingen 2,3,4,5 . Bijgevolg is er een dringende behoefte aan een beter begrip van de biologische kenmerken en mechanismen van geneesmiddelresistentie bij HCC om de formulering van effectievere behandelingsstrategieën te informeren.

In de afgelopen decennia hebben onderzoekers hun inspanningen gewijd aan de ontwikkeling van in vitro modellen met het oog op het bestuderen van HCC ^3,4. Ondanks enkele vorderingen blijven er beperkingen bestaan. Deze modellen omvatten een reeks technieken, zoals het gebruik van cellijnen, primaire cellen en van patiënten afgeleide xenotransplantaten (PDX). Cellijnen dienen als in vitro modellen voor langdurige kweek van tumorcellen verkregen van HCC-patiënten, en bieden de voordelen van gemak en gemakkelijke uitbreiding. Primaire celmodellen omvatten directe isolatie en kweek van primaire tumorcellen uit tumorweefsels van patiënten, waardoor een weergave wordt verkregen van biologische kenmerken die sterk lijken op die van de patiënten zelf. PDX-modellen omvatten de transplantatie van tumorweefsels van patiënten in muizen, met als doel de tumorgroei en -respons getrouwer te simuleren. Deze modellen hebben een belangrijke rol gespeeld in HCC-onderzoek, maar ze hebben bepaalde beperkingen, waaronder de heterogeniteit van cellijnen en het onvermogen om in vivo omstandigheden volledig te repliceren. Bovendien kan langdurige in-vitrokweek leiden tot een verslechtering van de oorspronkelijke kenmerken en functionaliteiten van de cellen, wat een uitdaging vormt bij het nauwkeurig weergeven van de biologische eigenschappen van HCC. Bovendien is het gebruik van PDX-modellen zowel tijdrovend als kostbaar³.

Om deze beperkingen aan te pakken en de fysiologische eigenschappen van HCC nauwkeuriger te repliceren, is het gebruik van organoïdetechnologie geïntroduceerd als een veelbelovend onderzoeksplatform dat in staat is om eerdere beperkingen te overtreffen. Organoïden, driedimensionale celmodellen die in vitro worden gekweekt, hebben het vermogen om de structuur en functionaliteit van echte organen na te bootsen. In de context van HCC bestaan er echter bepaalde uitdagingen bij het opstellen van organoïdemodellen. Deze uitdagingen omvatten onvoldoende gedetailleerde beschrijvingen van HCC-organoïdeconstructieprocedures, een gebrek aan uitgebreide protocollen voor het hele proces van HCC-organoïdeconstructie en de typisch kleine omvang van gekweekte organoïden ^6,7,8. In het licht van de doorgaans beperkte afmetingen van gekweekte organoïden, hebben we geprobeerd deze uitdagingen aan te pakken door de ontwikkeling van een uitgebreid protocol dat de volledige HCC-organoïdenconstructie omvat⁶. Dit protocol omvat weefseldissociatie, organoïdeplating, kweek, passaging, cryopreservatie en reanimatie. Door de procedurele stappen te optimaliseren en de samenstelling van het kweekmedium te verfijnen, hebben we met succes HCC-organoïdemodellen ontwikkeld die in staat zijn tot duurzame groei en langdurige passaging ^6,8. In de volgende paragrafen zal een uitgebreid verslag worden gegeven van de operationele fijne kneepjes en relevante factoren die betrokken zijn bij de constructie van HCC-organoïden.

Protocol

Menselijke biopsieweefsels werden verkregen van de betreffende patiënt in het Affiliated Cancer Hospital and Institute van de Guangzhou Medical University, en geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.

1. Het vaststellen van HCC-organoïden van patiënten uit chirurgische monsters

OPMERKING: De oprichting van HCC-organoïden omvat verschillende stadia, namelijk weefseldissociatie, organoïdeplating, kweek, passaging, cryopreservatie en reanimatie. Het proces van weefseldissociatie duurt 2 uur, terwijl het zaaien van organoïden op een plaat ongeveer 40 minuten duurt. Hierna ondergaat de eerste generatie HCC-organoïden een kweekperiode van 10-14 dagen met behulp van HCC-isolatiemedium. Zodra een bevredigende dichtheid is bereikt, worden organoïdepassages uitgevoerd, wat 1 uur duurt. De volgende culturen van de organoïden worden vervolgens gedurende 7-10 dagen in stand gehouden met behulp van HCC-expansiemedium, wat kan variëren afhankelijk van de groeisnelheid en conditie van de organoïden.

1. Weefsel dissociatie
   1. Voorbereiding van benodigdheden en materialen
      1. Verzamel 1-2^cm3 HCC-weefsel van patiënten die vóór de operatie geen eerdere lokale of systemische behandeling hebben ondergaan. Houd het weefsel na chirurgische resectie bij 4 °C in weefselconserveringsoplossing (tabel 1) tot verwerking.
         OPMERKING: Verse weefselmonsters van hoge kwaliteit zijn essentieel voor het succesvol opzetten van organoïden. Het is belangrijk om monsters snel te verwerken, idealiter binnen 1-4 uur na chirurgische resectie om de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden. Voer alle volgende procedures uit in een aseptische omgeving met behulp van steriele materialen en reagentia.
      2. Verwarm ultralage oppervlaktecelkweekplaten (24 putjes) gedurende 1 uur voor in een incubator bij 37 °C. Ontdooi het bevroren basaalmembraanextract (BME) een nacht bij 4 °C tot vlak voor gebruik.
         NOTITIE: Om ervoor te zorgen dat de BME volledig ontdooit, moet deze minimaal 3 uur op ijs worden geplaatst. Het volledig smelten van de BME is essentieel voor een succesvolle organoïdekweek in de volgende stappen.
      3. Zorg er vóór gebruik voor dat de digestieoplossing (tabel 1) is opgewarmd tot een temperatuur van 37 °C.
         NOTITIE: Bereid de digestieoplossing vers in een aseptische omgeving en gebruik deze onmiddellijk.
   2. Organisatorische verwerkingsstroom
      1. Knip in een laminaire flowkast het tumorweefsel in kleine stukjes (0,5-1^mm3) met een chirurgische schaar op een petrischaaltje. Breng het geknipte weefsel over in een conische buis van 15 ml en voeg 5-10 ml basaal medium toe (tabel 1).
         OPMERKING: Het basale medium (tabel 1) kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
      2. Gebruik een barotrope pipet om zoveel mogelijk bloed weg te spoelen en laat het 1-2 minuten staan om een deel van het supernatant te verwijderen, inclusief eventuele bloedcellen en zwevende vetstolsels. Herhaal deze procedure twee keer.
      3. Centrifugeer het mengsel bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig het supernatant. Voeg 5 ml van de voorverwarmde digestieoplossing (tabel 1) toe aan het bijgesneden weefsel.
      4. Draai de buis op 37 °C voor de spijsvertering.
      5. Zoek na 30 minuten van de eerste vertering naar kleine clusters van cellen onder de microscoop. Controleer elke 5-10 minuten om overdigestie te voorkomen.
         OPMERKING: De tijd die nodig is voor weefselvertering is afhankelijk van de grootte en het type weefsel. De weefselvertering mag niet langer duren dan 90 minuten. Oververteerd weefsel zal onder de microscoop verschijnen als een groot vel individuele cellen. Het juiste verteringsniveau wordt aangegeven door het feit dat de meeste hiervan celclusters zijn en een druifachtig uiterlijk hebben.
      6. Stop de vertering door koud basaal medium toe te voegen (tabel 1) en filtreer in een nieuw buisje van 50 ml met een celfilter van 100 μm. Voeg koud basaal medium toe tot een volume van 50 ml.
      7. Centrifugeer de cellen bij 2 × g gedurende 10 minuten bij 8 °C. Verwijder voorzichtig het supernatans en resuspendeer de pellet door nog eens 50 ml koud basaal medium toe te voegen (tabel 1). Herhaal deze stap twee keer.
         OPMERKING: Centrifugeren met lage snelheid wordt gebruikt om kleine celclusters te laten bezinken, terwijl bloedcellen en celresten nog steeds in het supernatant zweven; Het proces wordt meerdere keren herhaald om een relatief zuivere weefselcelmassa te verkrijgen.
2. Organoïde beplating
   1. Verwijder na de tweede wasbeurt zoveel mogelijk van het supernatans en resuspendeer het gewenste aantal cellen (1.000-5.000 cellen per putje van een plaat met 24 putjes) in de juiste BME voor plating.
      NOTITIE: Houd de BME voor gebruik altijd op 4 °C.
   2. Voeg BME toe en suspendeer kleine celclusters in Advanced DMEM/F-12 door BME toe te voegen en zachtjes op en neer te pipetteren totdat de celaggregaten volledig zijn opgeschort. Controleer de concentratie van de BME tussen 30% en 50%.
   3. Zaad 50 μL BME-druppeltjes gemengd met celclusters in het midden van kweekplaten met 24 putjes.
      NOTITIE: Laat de druppels zich zoveel mogelijk niet verspreiden naar de zijwand van de putplaat. De zijwand van de adsorptiearme plaat bevindt zich niet in een lage adsorptietoestand en contact tussen de druppels en de zijwand zal leiden tot adhesie, wat niet bevorderlijk is voor de daaropvolgende incubatie.
   4. Laat de platen met de toegevoegde druppels gedurende 20 minuten stollen bij 37 °C. Voeg aan het einde van de incubatie 500 μl voorverwarmd medium (tabel 1) toe aan elk putje en incubeer in een celincubator bij 37 °C.
3. Organoïde cultuur
   1. Ververs het kweekmedium (tabel 1) eens in de 2-3 dagen. Kweek aan het begin van de kweek de HCC-organoïden gedurende 2 weken in HCC-isolatiemedium (tabel 1).
   2. Vervang het medium na 2 weken incubatie met HCC-isolatiemedium door HCC-organoïde-expansiemedium (tabel 1) (maximaal 2 weken bewaard bij 4 °C).
   3. Ververs het kweekmedium eens in de 3 dagen.
   4. Na 7-10 dagen kweken met HCC-expansiemedium, wanneer de organoïde de juiste dichtheid of grootte heeft bereikt, start u experimentele interventies of passeert of lyofiliseert u de organoïden indien nodig.
4. Organoïde passaging
   1. Voorbereiding van benodigdheden en materialen
      1. Verwarm ultralage oppervlaktecelkweekplaten (24 putjes) gedurende 1 uur voor in een incubator bij 37 °C. Ontdooi bevroren BME 's nachts bij 4 °C tot vlak voor gebruik.
      2. Verwarm de organoïde-oogstoplossing en trypsinevervanger bij 37 °C gedurende 30 min.
   2. passeerproces
      1. Nadat u het kweekmedium van de putplaat hebt verwijderd, brengt u de organoïdussuspensie over in een buis van 15 ml.
      2. Voeg organoïde-oogstoplossing toe volgens de hoeveelheid BME (500 μL organoïde-oogstoplossing per 50 μL BME) door op en neer te schrapen en pipetteren met een pipetpistool van 1.000 μL.
         OPMERKING: Vermijd luchtbellen tijdens het hele proces om verlies van organoïden te voorkomen, aangezien de aanwezigheid van luchtbellen duidt op een hogere pipetteerdruk.
      3. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
      4. Zuig de BME voorzichtig op met een pipet van 1.000 μl en controleer of de BME volledig is opgelost. Observeer elke 10 minuten totdat een heldere organoïdecelcluster wordt waargenomen, centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 400 × g en verwijder zoveel mogelijk van het supernatans.
         OPMERKING: In dit stadium kan de organoïde worden ingevroren en geconserveerd.
      5. Voeg voor de enzymatische vertering van organoïden 1-5 ml trypsinevervanger toe (afhankelijk van het aantal organoïden) en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 °C. Observeer onder de microscoop de mate van enzymatische vertering om te bepalen of de organoïden uiteenvallen in kleine clusters van 2-10 cellen; Als dit niet het geval is, ga dan door met de enzymatische vertering.
         OPMERKING: Overdigestie zal resulteren in de lysis van organoïde celclusters in afzonderlijke cellen, waardoor hun levensvatbaarheid afneemt en de daaropvolgende kweektijd wordt verlengd.
      6. Voeg het juiste volume koud basaal medium toe (tabel 1) om de vertering te stoppen.
      7. Centrifugeer de organoïden bij 400 × g gedurende 5 minuten bij 8 °C; Verwijder het supernatans zoveel mogelijk.
      8. Resuspendeer het gewenste aantal organoïden (1.000-5.000 organoïden per putje van een plaat met 24 putjes) in de juiste matrix voor plating. Volg dezelfde stappen als in paragraaf 1.2.
         OPMERKING: De dichtheid van de beplating moet worden geoptimaliseerd op basis van de groeisnelheid en de grootte van de organoïden.
      9. Passage de organoïden elke 10 dagen in een verhouding van 1:3 of 1:4, afhankelijk van de dichtheid van de organoïdegroei.
5. Cryopreservatie en reanimatie van organoïden
   1. Cryopreservatie van organoïden
      1. Bereid vriesdroogbuisjes voor, waarbij elke buis samenvloeit met twee putjes van een plaat met 24 putjes die organoïden bevat.
      2. Volg de stappen 1.4.2.1 tot en met 1.4.2.4 voor het passeren van organoïden om organoïden zonder BME te verkrijgen, en resuspendeer de organoïden voorzichtig door 500 μL/putje organoïde-vriesdroogoplossing toe te voegen aan een plaat met 24 putjes.
         OPMERKING: Afhankelijk van de groeistatus en grootte van de organoïden wordt aanbevolen om de organoïden tot de derde generatie in cultuur te cryopreserveren.
      3. Breng de suspensie over in vriesdroogbuizen en plaats deze in een gradiëntgekoelde doos bij -80 °C. Na gradiëntafkoeling bij -80 °C gedurende ten minste 24 uur, de buizen overbrengen naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
   2. Reanimatie van organoïden
      1. Incubeer gevriesdroogde buizen in een waterbad van 37 °C en stop de incubatie wanneer er nog maar een klein blokje ijs overblijft.
      2. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 5 minuten bij 8 °C om het supernatans volledig te verwijderen.
      3. Volg de paragrafen 1.2 en 1.3 voor de volgende bewerkingen.

Resultaten

Na implementatie van de bovengenoemde procedure is de opkomst van HCC-organoïde sferoïden doorgaans waarneembaar binnen een tijdsbestek van 3 dagen (Figuur 1). Figuur 1A,B toont de gevestigde HCC-organoïde, die op de eerste dag van vestiging onmiddellijk compacte sferoïden ontwikkelt die worden gekenmerkt door afgeronde randen en permeabel cytosol. Tijdens de groei van HCC-organoïden had het gebruik van verschillende concentraties BME verschille...

Discussie

Een opmerkelijk voordeel van van patiënten afgeleide organoïdemodellen ligt in hun vermogen om de biologische kenmerken van tumoren getrouw na te bootsen, inclusief weefselstructuur en genoomlandschap. Deze modellen vertonen een opmerkelijk niveau van nauwkeurigheid en weerspiegelen effectief de heterogeniteit en progressie van tumoren, zelfs over langere perioden van cultivatie ^6,8,9. Door het gebruik van dit verfijnde organoïd...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines